湖南省林業(yè)地方標(biāo)準(zhǔn)

-19-湖南省林業(yè)地方標(biāo)準(zhǔn)山銀花組織培養(yǎng)育苗技術(shù)規(guī)程（征求意見稿）山銀花組織培養(yǎng)育苗技術(shù)規(guī)程編制說明一、工作簡況（一）標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目的來源、制定標(biāo)準(zhǔn)的目的和意義、參加單位和標(biāo)準(zhǔn)主要起草人員分工1、標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目的來源本項(xiàng)目由湖南省市場監(jiān)督管理局《關(guān)于下達(dá)2022年第一批地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計劃的通知》（湘市監(jiān)標(biāo)函〔2022〕4號）文件批準(zhǔn)立項(xiàng)，項(xiàng)目類別為制定，由湖南省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。項(xiàng)目承擔(dān)單位為湖南省林業(yè)科學(xué)院。2、制定標(biāo)準(zhǔn)的目的與意義山銀花是我國大宗中藥材。《中國藥典》（2020版）規(guī)定山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬、黃褐毛忍冬干燥花蕾或帶初開的花。山銀花含有揮發(fā)油、黃酮類、三萜皂甙、綠原酸及無機(jī)元素等多種成分，具有清熱解毒、消炎退腫、保肝抗病毒、延緩衰老的功效。最近研究還表明它有良好的抗癌、抗新冠肺炎和抗愛滋病病毒以及“SARS”病毒的作用，已廣泛應(yīng)用在制藥、香料、化妝品、保健食品、飲料等領(lǐng)域，已開發(fā)出很多產(chǎn)品，如雙黃連口服液、含片、涼茶、銀麥啤酒、沐浴露等，備受消費(fèi)者青睞。山銀花在我國主要分布于湖南、重慶、貴州、四川、云南、江西、廣西等，其樹姿優(yōu)美，是園林綠化優(yōu)良植物。同時由于山銀花冬具有適應(yīng)性強(qiáng)，對氣候、土壤要求不嚴(yán)，耐瘠薄、耐鹽堿，耐旱、耐寒熱，喜光耐陰，根系稠密發(fā)達(dá)，分蘗力強(qiáng)，一般土壤均能種植等特點(diǎn)，是水土保持和石漠化治理的良好樹種。山銀花花蕾綠原酸含量在全國各種藥用忍冬植物中較最高，是西南、中南地區(qū)藥用忍冬植物的主栽品種之一，尤以湖南、重慶和貴州栽培面積較大。湖南是山銀花的主產(chǎn)區(qū)，主栽品種是灰氈毛忍冬，主要在湖南隆回、溆浦、辰溪、洪江、新化、連源、雙牌、吉首、鳳凰、汨羅等地栽培。湖南省現(xiàn)有山銀花栽植面積35萬畝，年綜合產(chǎn)值60多億元，其中隆回縣21萬畝，年綜合產(chǎn)值50億元，是我國“金銀花之鄉(xiāng)”。近3年綜合產(chǎn)值干花銷售價格穩(wěn)定在80-100元/公斤，種植的經(jīng)濟(jì)效益高，各地都在發(fā)展，山銀花已成為一些貧困山區(qū)農(nóng)民的主要經(jīng)濟(jì)來源，也是隆回等地農(nóng)村支柱產(chǎn)業(yè)。目前，我省山銀花種苗都采用常規(guī)的嫁接方法，存在繁殖系數(shù)小、砧木選擇混亂、優(yōu)良性狀退化快、苗木死亡率高等問題，不利于優(yōu)良新品種的推廣，且一些新品種，如‘金翠蕾’、‘銀翠蕾’、‘白云’，扦插、嫁接成活率較低。組織培養(yǎng)培育的組培苗根系發(fā)達(dá)，生長勢旺，抗病蟲力強(qiáng)，且苗木生產(chǎn)不受季節(jié)、氣候的影響，繁殖系數(shù)大，質(zhì)量高，因此，組織培養(yǎng)繁育的苗木深受企業(yè)和花農(nóng)的青睞。但是生產(chǎn)組培苗所要求技術(shù)含量較高，如初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)周期、煉苗時間、移栽方法、苗木管理等，均會影響組培苗的增殖、生根、移栽成活率及其移栽后組培苗的生長等，因此，我省迫切需要制定山銀花組織培養(yǎng)育苗技術(shù)規(guī)程，指導(dǎo)企業(yè)、花農(nóng)培育優(yōu)質(zhì)的灰氈毛忍冬良種苗木，建設(shè)好高水平、高標(biāo)準(zhǔn)、高質(zhì)量的種植基地，有效地提高山銀花的產(chǎn)量和品質(zhì)，提升山銀花種植的經(jīng)濟(jì)效益，對增加山區(qū)農(nóng)民收入，促進(jìn)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展，促進(jìn)我省山銀花產(chǎn)業(yè)發(fā)展，均具有重要的戰(zhàn)略意義和現(xiàn)實(shí)意義。3、項(xiàng)目主要參加單位及標(biāo)準(zhǔn)主要起草人員分工該項(xiàng)目承擔(dān)單位為湖南省林業(yè)科學(xué)院。項(xiàng)目組成員具有多年的山銀花苗培育工作經(jīng)歷。標(biāo)準(zhǔn)起草人員見表1。表1標(biāo)準(zhǔn)起草人員及人員分工序號姓名工作單位專業(yè)職稱分工1王湘瑩湖南省林業(yè)科學(xué)院森林培育助理研究員標(biāo)準(zhǔn)編寫與數(shù)據(jù)調(diào)查2王曉明湖南省林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)林二級研究員標(biāo)準(zhǔn)編寫3曾慧杰湖南省林業(yè)科學(xué)院遺傳學(xué)副研究員試驗(yàn)驗(yàn)證4李永欣湖南省林業(yè)科學(xué)院遺傳育種研究員數(shù)據(jù)分析5蔡能湖南省林業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)高工數(shù)據(jù)調(diào)查6陳藝湖南省林業(yè)科學(xué)院森林培育助理研究員統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)7喬中全湖南省林業(yè)科學(xué)院分子生物學(xué)高工數(shù)據(jù)調(diào)查8王昊湖南省林業(yè)科學(xué)院森林培育助理研究員數(shù)據(jù)調(diào)查（二）主要工作過程1、已具備的科研工作基礎(chǔ)本課題組現(xiàn)有研究員或教授2人，副研究員或高工4人，中級職稱2人。其良好的學(xué)術(shù)隊(duì)伍和科研條件以及研究人員的專業(yè)背景，可保障按時高質(zhì)量完成研究目標(biāo)。從事山銀花種業(yè)創(chuàng)新研究20多年，開展了山銀花種質(zhì)資源收集保存和評價、遺傳育種、功能基因發(fā)掘、種苗快繁技術(shù)等研究，已收集保存收集山銀花優(yōu)良種質(zhì)資源52份，首次發(fā)現(xiàn)花期花冠一直不開裂的山銀花優(yōu)良基因資源，選育出‘金翠蕾’、‘銀翠蕾’、‘花瑤晚熟’等5個國家級或省級良種(新品種)，栽植第3-5年干花產(chǎn)量173.4-378kg/畝，比普通種高出1.3-3.5倍，干花有效成分綠原酸含量達(dá)5.83～8.86%，比普通種高出34.64～92.0%。率先發(fā)掘出山銀花黃酮類化合物合成、花管開裂相關(guān)基因7個；構(gòu)建了山銀花品種的DNA指紋圖譜。研創(chuàng)出山銀花新品種高效組培快繁技術(shù)，攻克了山銀花組培苗移栽成活困難的技術(shù)難關(guān)，移栽成活率達(dá)94.8%，并成功研究出了山銀花以苗繁苗技術(shù)，顯著提高苗木繁殖速度，解決了組培苗生產(chǎn)成本居高不下難題，實(shí)現(xiàn)了山銀花新品種苗木高效、低成本、規(guī)?；a(chǎn)。鑒定（認(rèn)定）或評價山銀花科技成果7項(xiàng)，其中2項(xiàng)獲得湖南省科技進(jìn)步二等獎，1項(xiàng)獲得梁希林業(yè)科技三等獎；獲得國家發(fā)明專利2項(xiàng)；制定湖南省地方標(biāo)準(zhǔn)2項(xiàng)，發(fā)表相關(guān)論文51篇，其中SCI論文12篇。2、完成標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目的步驟、方法和技術(shù)路線項(xiàng)目單位于2021年1月成立了山銀花組織培養(yǎng)苗技術(shù)規(guī)程項(xiàng)目組，并明確了工作指導(dǎo)思想，確定了項(xiàng)目主要內(nèi)容和技術(shù)指標(biāo)，編寫了項(xiàng)目實(shí)施方案，明確了項(xiàng)目組人員的分工。2021.1--2021年12月開展組織培養(yǎng)苗培育驗(yàn)證試驗(yàn)，收集相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。起草小組首先收集、查閱了國內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)等技術(shù)資料，在此基礎(chǔ)上，集成組合前期科研實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，起草了標(biāo)準(zhǔn)草案。2022年2月完成標(biāo)準(zhǔn)文本初稿，并組織項(xiàng)目組成員進(jìn)行了專題討論，3月對標(biāo)準(zhǔn)文本內(nèi)容進(jìn)行定稿，形成征求意見稿。4月上旬，項(xiàng)目組將征求意見稿發(fā)送給專家、農(nóng)戶和合作社征求意見，根據(jù)反饋情況形成征求意見匯總表，對征求意見稿進(jìn)行調(diào)整、修改和完善。2022年5月，項(xiàng)目組計劃對反饋意見進(jìn)行匯總，形成《標(biāo)準(zhǔn)反饋意見匯總表》。同時對本標(biāo)準(zhǔn)的《征求意見稿》及《編制說明》進(jìn)行修改，形成兩者的送審稿，將3份材料提交給省市場監(jiān)督管理局后，等待現(xiàn)場實(shí)審。計劃于2022年6月進(jìn)行現(xiàn)場審查。此后，項(xiàng)目組將根據(jù)專家意見，對該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行最后修改，形成《山銀花組織培養(yǎng)育苗技術(shù)規(guī)程》報批稿，交給省市場監(jiān)督管理局頒布實(shí)施。項(xiàng)目實(shí)施的技術(shù)路線為：利用已有的技術(shù)基礎(chǔ)，根據(jù)項(xiàng)目實(shí)施方案，在湖南省林業(yè)科學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開展山銀花組織培養(yǎng)育苗技術(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)，并進(jìn)行試驗(yàn)調(diào)查研究，收集相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，參考項(xiàng)目組以往科研成果及查到的文獻(xiàn)資料，編制該標(biāo)準(zhǔn)。完成的具體步驟為：標(biāo)準(zhǔn)查新→項(xiàng)目申報→相關(guān)資料收集和整理→標(biāo)準(zhǔn)草案的撰寫（完成）→向相關(guān)單位及專家征求意見→回收征求的意見→根據(jù)征求意見進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的修改→專家評審→根據(jù)審查意見，對標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修改，形成報批稿→頒布實(shí)施。二、標(biāo)準(zhǔn)的編制原則和標(biāo)準(zhǔn)的主要技術(shù)內(nèi)容及論據(jù)（一）標(biāo)準(zhǔn)的編制原則1、編寫格式按中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則。2、標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容緊密聯(lián)系我省目前山銀花組織培養(yǎng)育苗技術(shù)現(xiàn)狀，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)先進(jìn)、合理，系統(tǒng)性和可操作性強(qiáng)。（二）主要技術(shù)內(nèi)容及論據(jù)1、關(guān)于適用范圍的說明本標(biāo)準(zhǔn)適應(yīng)于湖南省山銀花組織培養(yǎng)育苗。2、規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6001育苗技術(shù)規(guī)程LY/T1882林木組織培養(yǎng)育苗技術(shù)規(guī)程LY/T1000容器育苗技術(shù)3、關(guān)于術(shù)語和定義的說明山銀花(LoniceraeFlos)為忍冬科忍冬屬植物灰氈毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.)干燥花蕾或帶初開的花。4、本標(biāo)準(zhǔn)的主要技術(shù)內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了山銀花組織培養(yǎng)育苗技術(shù)的外植體采集、外植體處理、培養(yǎng)基制備、組織培養(yǎng)、煉苗、移栽、容器苗培育、苗木出圃、檔案管理等。5、本標(biāo)準(zhǔn)的主要指標(biāo)確定的依據(jù)（1）外植體采集宜在春季3-4月晴天葉片表面露水干后采集外植體。選擇生長健壯、無病蟲害的母樹采集外植體。從當(dāng)年生嫩枝上剪取帶頂芽或腋芽的莖段，留葉柄基部，去掉葉片。將采集的嫩枝低溫保濕帶回實(shí)驗(yàn)室，取嫩枝頂端4cm-6cm作為外植體。（2）外植體的處理用自來水沖洗外植體3次～5次，用軟毛刷蘸中性洗潔精溶液輕輕刷洗，再用流水沖洗外植體至潔凈。在超凈臺上將外植體浸泡在75%酒精10s，無菌水沖洗2次～3次，用添加2滴～3滴吐溫-80的0.1%升汞溶液浸沒外植體5min～6min，無菌水沖洗4次～5次，用滅菌濾紙吸干外植體表面水分。（3）培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基配制、滅菌與保存按照LY/T1882執(zhí)行。初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基與生根培養(yǎng)基的配方見附錄A.（4）組織培養(yǎng)①培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為25℃±2℃，光照時間h·d-1，光照強(qiáng)度30?40mmol·m-2·s-1。②初代培養(yǎng)：將滅菌的外植體切成長1.5cm～2.5cm的小莖段，接種在初代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30d左右。=3\*GB3③繼代培養(yǎng)：首先將初代培養(yǎng)誘導(dǎo)的萌芽切成長2.0cm～2.5cm的莖段，接種在繼代培養(yǎng)基上。每隔25d～30d將繼代培養(yǎng)增殖的叢生芽按2個～3個芽為一個單位分開，切去基部褐變的愈傷組織，接種在新的繼代培養(yǎng)基上。繼代培養(yǎng)控制在16代內(nèi)，增殖材料超過16代或出現(xiàn)退化，苗細(xì)弱時，宜重新采集外植體更新繁殖材料。④壯苗培養(yǎng)：將繼代苗剪成長2.0cm～2.5cm莖段，接種在壯苗培養(yǎng)基上。⑤生根培養(yǎng)：從壯苗培養(yǎng)的組培苗中挑選高2.5cm～4.0cm的苗，分割成單株后轉(zhuǎn)接在生根培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)生根。生根培養(yǎng)周期是25d～30d。=6\*GB3⑥煉苗：當(dāng)組培苗根長度達(dá)到1.0cm～1.5cm時進(jìn)行煉苗，將組培瓶苗移到溫室大棚。煉苗溫度控制15℃～30℃，自然光下閉口煉苗7d～10d。（5）移栽①移栽條件：移栽容器宜選用穴盤或底部有孔的育苗盤，移栽基質(zhì)以泥炭土70%，珍珠巖30%為宜。在春季、初夏和秋季進(jìn)行移栽。②移栽方法：從培養(yǎng)瓶中取出煉苗后的生根苗，清水洗凈根部培養(yǎng)基，在58%瑞毒霉錳鋅可濕性粉劑0.1%溶液中浸泡3min～4min，移栽在盛有基質(zhì)的移栽容器中，用該瑞毒霉錳鋅溶液淋透移栽基質(zhì)。=3\*GB3③移栽苗管理：將移栽的組培苗置于有自動噴霧設(shè)備的塑料大棚中，覆蓋遮光率85%的遮陽網(wǎng)，開啟自動噴霧設(shè)備。移栽50d～60d后將成活的組培苗栽植在育苗容器中，進(jìn)行容器苗培育。（6）容器苗培育宜選用塑料營養(yǎng)杯，規(guī)格9cm×9cm或10cm×10cm。容器苗基質(zhì)為泥炭土80%，珍珠巖20%。栽植組培苗前1d～2d，再用70%甲基托布津或75%百菌清或58%甲霜錳鋅1000倍液淋透基質(zhì)。在育苗容器中裝填約1/2的基質(zhì)，將移栽成活的組培苗栽植在育苗容器中，加滿基質(zhì)，淋足定根水。（7）苗木管理①光照控制：組培苗栽植在育苗容器后置于遮光率85%的遮陽棚內(nèi)。栽植后1個月后，選擇陰天，揭去遮陽網(wǎng)。②水分管理：根據(jù)基質(zhì)的干濕情況適時澆水或噴水，保持基質(zhì)濕潤。③施肥：每隔15d～20d用氮磷鉀水溶性肥600倍～800倍溶液澆苗1次。④打頂摘心：當(dāng)苗木頂梢開始彎曲，及時打頂摘心。⑤病蟲害防治：每隔15d～20d噴施75%百菌清800倍液與25克/升溴氰菊酯乳油2000倍混合溶液。⑥除草：按照LY/T1000執(zhí)行。（8）苗木出圃①苗木分級：合格容器苗分為Ⅰ級、Ⅱ級苗，分級指標(biāo)見表1。苗齡(月)I級苗II級苗綜合控制指標(biāo)苗高(cm)地徑(cm)苗高(cm)地徑(cm)12≥30.0≥0.40≥20.0≥0.25根系完整和發(fā)達(dá)，生長健壯，葉色正常②苗木檢驗(yàn)：容器苗出圃應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，檢驗(yàn)方法和檢測規(guī)則按GB6000規(guī)定執(zhí)行。③苗木出圃：按GB6001規(guī)定執(zhí)行。（9）檔案管理檔案管理的內(nèi)容包括：外植體采集與處理情況、組織培養(yǎng)和容器育苗技術(shù)措施、苗木管理、各項(xiàng)作業(yè)的用工量和原材料消耗等。主要試驗(yàn)分析本規(guī)程緊密聯(lián)系山銀花組織培養(yǎng)育苗的實(shí)際，以科學(xué)、合理和可操作性強(qiáng)為原則進(jìn)行選擇和確定試驗(yàn)。為了篩選適宜的山銀花組織培養(yǎng)育苗技術(shù)，項(xiàng)目組開展了如下主要試驗(yàn)：（1）外植體采集及處理對接種污染率的影響試驗(yàn)供試品種為金翠蕾。設(shè)置3個不同時期的外植體，從當(dāng)年抽生的新梢上剪取帶頂芽或腋芽的健壯嫩枝莖段，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。同時設(shè)計3種消毒滅菌處理：75%酒精浸泡10S后，在0.1%升汞中浸泡5min、6min、7min。每個處理分別接種100瓶，每瓶接種1個外植體，每處理頂芽30個，腋芽70個。初代培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg·L-1+IBA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1。接種3天后，若發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染者，及時剔除，并記錄外植體的愈傷組織形成及其萌芽過程。接種30天后，調(diào)查外植體的總成活率。表1外植體采集及處理對成活率的影響消毒處理春季(4/16)嫩莖夏季(5/23)嫩莖秋季(8/26)嫩莖酒精10s升汞5min592213酒精10s升汞6min酒精10s升汞7min342042282721由表1可見，在不同季節(jié)剪取外植體，經(jīng)消毒滅菌后接種在初代培養(yǎng)基上，從其外植體污染情況看，春季剪取的莖段作外植體，其無菌苗獲得的成功率比較高，可達(dá)59%，其次是夏季萌發(fā)的嫩莖，成功率可達(dá)42%，而成活率較低的是秋季生長的嫩莖，最高僅27%。從表1還可知，不同的季節(jié)采樣，升汞消毒時間對外植體成活率的影響也較大，春季嫩枝消毒時間以5分鐘為宜，夏、秋季則以6分鐘比較好。春季嫩枝5分鐘0.1%升汞消毒處理，外植體萌發(fā)也較快，接種于初代培養(yǎng)基后，非染菌芽8d左右就萌發(fā)，20d萌芽可長至2～4cm長；夏季的外植體接種后約10d天開始萌芽，而秋季的外植體萌發(fā)最慢，接種后約13天才萌發(fā)。試驗(yàn)結(jié)果也表明，春、夏、秋三個季節(jié)的嫩枝，頂芽萌發(fā)比腋芽平均早1-3天左右，接種20d天，頂芽萌發(fā)的芽生長量比腋芽平均高1.8cm。以上研究表明，山銀花組培快繁初代培養(yǎng)的外植體及其消毒滅菌處理方式，以春季帶頂芽的嫩莖為適宜的外植體；消毒滅菌處理則以75%酒精浸泡10S后，在0.1%升汞中浸泡5min為佳。銀翠蕾、白云組培，以這種外植體和消毒滅菌方式，同樣能獲得較好的效果。（2）初代培養(yǎng)適宜培養(yǎng)篩選試驗(yàn)研究供試品種：金翠蕾、銀翠蕾。以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖30g·L-1。試驗(yàn)因子為6-BA(1.0mg·L-1)、IBA(0,0.1mg·L-1)和IBA(0,0.1mg·L-1)的不同水平組合，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，共制備4種培養(yǎng)基。外植體為春季帶腋芽的嫩枝莖段,消毒滅菌處理:75%酒精浸泡10S后，在含有2～3滴吐溫80的0.1%升汞溶液中浸泡5min。每處理接種30瓶，每瓶接種1個外植體。得苗率=(存活數(shù)/萌芽數(shù))*100%。由表2可見，山銀花2個品種的外植體接種在4種培養(yǎng)基中都能萌芽。接種后4-6d，莖段基部膨大，8～13d后由葉腋處或頂芽陸續(xù)長出新芽，30d后可伸長到1～2.2cm。其中金翠蕾和銀翠蕾在T1培養(yǎng)基中的得苗率最高，分別為68.42%和71.43%，萌芽長勢較好。而接種在T2、T3、T4培養(yǎng)基的外植體萌芽長勢較差。這說明山銀花初代培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1。表2初代培養(yǎng)適宜培養(yǎng)篩選試驗(yàn)研究培養(yǎng)基附加成分品種存活數(shù)得苗率(%)苗高(cm)6-BANAAIBAT11.00.10.0金翠蕾1967.342.03銀翠蕾2169.102.24T21.00.00.1金翠蕾1241.201.68銀翠蕾1437.941.88T31.00.10.1金翠蕾2053.721.55銀翠蕾1657.14.1.60T41.00.00.0金翠蕾1720.221.30銀翠蕾1922.861.25（3）繼代培養(yǎng)適宜的基本培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)研究=1\*GB3①基本培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)供試品種為金翠蕾。設(shè)計MS、WPM、WH、B5四種基本培養(yǎng)基，分別添加6-BA1.0mg·L-1+IBA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1。將初代培養(yǎng)獲得的無菌苗接種于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30天再觀察其生長情況，調(diào)查增殖系數(shù)。隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計，4次重復(fù)，每個重復(fù)中各處理接種6瓶，每瓶接種6個基本一致的無菌苗。增殖系數(shù)=調(diào)查時有效芽數(shù)量/接種時的無菌苗數(shù)量。有效芽是指長度1cm以上的叢芽。試驗(yàn)結(jié)果如表3。方差分析結(jié)果表明，不同的基本培養(yǎng)基對增殖系數(shù)的影響達(dá)到顯著水平。在WPM培養(yǎng)基上培養(yǎng)的組培苗的增殖系數(shù)最高，為5.37，但其生長不正常，長勢差，苗細(xì)長，葉微黃。MS培養(yǎng)基的殖系數(shù)較高，達(dá)到3.88，其瓶苗生長健壯，莖節(jié)間長，粗壯，葉色濃綠。WH和B5培養(yǎng)基的增殖系數(shù)較低，不足1.3。因此，山銀花繼代培養(yǎng)的適宜基本培養(yǎng)基為MS。表3繼代培養(yǎng)適宜的基本培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)基本培養(yǎng)基MSWPMWHB5增殖系數(shù)3.88b5.37a1.21c1.25c注：小寫字母表示0.05的顯著水平。下同。=2\*GB3②大量元素對組培苗增殖的影響試驗(yàn)供試品種為金翠蕾。以MS培養(yǎng)基為研究對象，設(shè)計試驗(yàn)因素5個：硝酸銨、硝酸鉀、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀，每個因素4個水平(表4)，即=1\*GB3①在培養(yǎng)基中不添加該因素(0)；=2\*GB3②含量減半(1/2)；=3\*GB3③含量保持不變(1)；=4\*GB3④含量加倍(2)，按L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計。培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg·L-1+IBA0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1。從表4可見，MS基本培養(yǎng)基大量營養(yǎng)元素含量對組培苗繼代培養(yǎng)增殖系數(shù)的影響順序是：硝酸鉀＞磷酸二氫鉀＞硝酸銨＞氯化鈣＞硫酸鎂，其中以硝酸鉀和磷酸二氫鉀的含量影響較大，說明鉀離子和磷的含量對山銀花增殖影響較大；硫酸鎂的影響則最小。由此確定山銀花繼代培養(yǎng)基大量營養(yǎng)元素適宜的含量是：硝酸鉀為零，磷酸二氫鉀、硝酸銨、氯化鈣和硫酸鎂分別減半。該基本培養(yǎng)基定名為改良MS培養(yǎng)基。表4大量元素對組培苗增殖的影響處理硝酸銨硝酸鉀硫酸鎂氯化鈣磷酸二氫鉀增殖系數(shù)生長量(cm)1000003.602.17201/21/21/21/24.002.033011113.202.274022223.602.2351/201/2124.142.2761/21/20213.662.1371/21201/23.862.5081/2211/203.142.13910121/23.942.001011/22103.062.03111101/223.742.0712121/2013.202.13132021/213.801.971421/21023.402.1015211/2203.032.101622011/23.142.13t13.6003.8703.5353.5153.208t23.7003.5303.5933.6703.735t33.4853.4583.4203.3853.465t43.3433.2703.5803.5583.720R0.3570.6000.1730.2850.527注：t1、t2、t3分別表示各因素水平的平均值,R表示極差。下同。（4）繼代培養(yǎng)適宜的增殖培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)研究供試品種為金翠蕾、銀翠蕾，繼代苗接種在改良MS培養(yǎng)基，采用正交試驗(yàn)設(shè)計。由表5可知，參試的2個山銀花品種對培養(yǎng)基的反應(yīng)有所差別。研究結(jié)果表明，影響金翠蕾和銀翠蕾繼代培養(yǎng)的各因子的主次順序是6-BA、NAA、生物素D，其中金翠蕾適宜繼代培養(yǎng)基為6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+生物素D1.0mg·L-1，該組合的培養(yǎng)效果為優(yōu)；銀翠蕾適宜繼代培養(yǎng)基為6-BA0.5mg·L-1+NAA0.05mg·L-1+生物素D1.0mg·L-1。表5繼代培養(yǎng)適宜的增殖培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)研究處理培養(yǎng)基附加成分金翠蕾銀翠蕾6-BANAA生物素D增殖系數(shù)(個)增殖系數(shù)(個)10.50.050.54.784.6320.50.101.04.654.4930.50.301.54.103.9241.00.051.04.244.3051.00.101.54.493.9561.00.300.53.873.6671.50.051.53.813.8181.50.100.54.023.8591.50.301.03.933.55金t14.514.284.22翠t24.24.394.27蕾t33.923.974.13R0.590.420.14銀t14.354.254.05翠t23.974.104.11蕾t33.743.713.89R0.610.540.22（5）生根培養(yǎng)適宜的生根培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)研究供試品種為金翠蕾。從組培苗上剪取2.5～3.5cm長的小苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上。生根基本培養(yǎng)基為1/2MS。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，4次重復(fù)。=1\*GB3①不同生長素對組培苗生根的影響試驗(yàn)生根培養(yǎng)基為1/2MS+活性炭200mg·L-1，設(shè)計3種生長素，分別為IBA、NAA、IAA，濃度為3.0mg·L-1。方差分析結(jié)果表明，不同生長素對組培苗生根的影響較大，各處理間差異顯著。從表6可知,IBA處理的生根率最高，達(dá)到93.4%，其生根苗葉色濃綠，根系好，須根多。而NAA處理的組培苗，莖基部形成較多的愈傷組織，生根率最低，小苗發(fā)黃。因此，山銀花組培苗生根培養(yǎng)適宜的生長素為IBA。表6不同生長素對組培苗生根的影響生長素種類平均根系數(shù)(條)平均根長(cm)生根率(%)IBA7.2a1.6b93.4aNAA3.1c1.8a65.2cIAA4.5b1.2bb=2\*GB3②IBA濃度對組培苗生根的影響試驗(yàn)設(shè)計5種IBA濃度，分別為0.0、1.0、2.0、5.0、10mg·L-1，4次重復(fù)。生根培養(yǎng)基為1/2MS+活性炭200mg·L-1。對試驗(yàn)數(shù)據(jù)(表7)進(jìn)行曲線估計和回歸分析，得生根率的回歸方程為y=35.0721+49.4675x-11.0710x2+0.6201x3,相關(guān)系數(shù)r=0.9995(r0.05=0.878,r0.01=0.959)。說明IBA濃度對山銀花組培生根影響顯著，隨著IBA濃度的升高，二者的變化曲線呈拋物線狀。對本回歸方程求一階導(dǎo)數(shù)并令其等于零，求解極值點(diǎn)，可得出令生根率取得極大值的IBA濃度為2.98mg·L-1。從表7可見，IBA濃度在2～4mg·L-1的范圍內(nèi)有利于山銀花組培苗誘導(dǎo)生根，濃度過高，生根率反而較低。山銀花組培苗生根培養(yǎng)的IBA適宜濃度為2.98mg·L-1。表7IBA濃度對組培苗生根的影響IBA(mg·L-1)0.01.02.05.010.0生根率(%)34.675.493.783.342.7=3\*GB3③活性炭濃度對組培苗生根的影響試驗(yàn)設(shè)計活性炭6種濃度，分別是0、100、200、300、400、500mg·L-1，4次重復(fù)。生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA3.0mg·L-1。對試驗(yàn)數(shù)據(jù)(表8)進(jìn)行曲線估計和回歸分析，得生根率的回歸方程為y=76.7821+0.1280x-0.0003x2,相關(guān)系數(shù)r=0.9634**(r0.05=0.811,r0.01=0.917)。這表明活性炭濃度對山銀花組培苗生根影響顯著，隨著活性炭濃度的升高，二者的變化曲線呈拋物線狀。對回歸方程求極值點(diǎn)，可得出令生根率取得極大值的活性炭濃度為213mg·L-1。通過以上研究說明，山銀花組培苗生根培養(yǎng)較適宜的培養(yǎng)基為1/2MS+IBA2.98mg·L-1+活性炭213mg·L-1。但為了實(shí)際操作的方便，在實(shí)踐中IBA和活性炭濃度常常取整數(shù)，因此，山銀花組培苗適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA3.0mg·L-1+活性炭200mg·L-1。表8活性炭濃度對組培苗生根的影響活性炭(mg·L-1)0100200300400500生根率(%)77.883.394.488.980.669.4根系數(shù)(條)4.26.38.67.87.53.4（6）不同移栽基質(zhì)對組培苗移栽成活的影響試驗(yàn)設(shè)計4種移栽基質(zhì)，分別是J1：泥炭土50%+珍珠巖50%；J2：泥炭土30%+珍珠巖70%；J3：泥炭土70%+珍珠巖30%；J4：黃心土50%+細(xì)砂50%，4次重復(fù)。從表9可以看出，不同的移栽基質(zhì)對山銀花組培苗移栽成活率的影響達(dá)到顯著水平。J3基質(zhì)的移栽成活率最高，達(dá)89.3%，其次是J1和J2，移栽成活率最低是基質(zhì)J4，僅26.5%。因此，山銀花組培生根苗適宜的移栽基質(zhì)為泥炭土70%+珍珠巖30%。表9不同移栽基質(zhì)對組培苗移栽成活率的影響基質(zhì)編號J1J2J3J4成活率(%)72.2b68.8b89.3a26.5c三、采用國內(nèi)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的程度，以及與國內(nèi)外同類標(biāo)準(zhǔn)水平的對比情況目前國內(nèi)外尚未有相關(guān)的山銀花組織培養(yǎng)育苗技術(shù)規(guī)程，因