化學發(fā)光法的原理技術要點及評價應用教學課件

化學發(fā)光法的原理技術要點及評價應用化學發(fā)光法的原理技術要點及評價應用化學發(fā)光免疫技術的類型按發(fā)光劑不同分為1.發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）chemiluminescenceenzymeimmunoasssay

2.化學發(fā)光免疫測定技術(CLIA)chemiluminescenceimmunoassay

3.電化學發(fā)光免疫測定技術(ECLI)

electrochemiluminescenceimmunoassay按分離方法不同分

1.微粒子化學發(fā)光免疫測定

2.磁顆粒化學發(fā)光免疫測定化學發(fā)光免疫技術的類型按發(fā)光劑不同分為第一節(jié)發(fā)光與化學發(fā)光劑一、發(fā)光一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。1.光照發(fā)光:發(fā)光劑經(jīng)短波長入射光照射后進入激發(fā)態(tài)，當回復至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。2.生物發(fā)光:反應底物在熒光素酶的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出。3.化學發(fā)光:在常溫下由化學反應產(chǎn)生的光的發(fā)射。化學發(fā)光是一個多步驟的過程。第一節(jié)發(fā)光與化學發(fā)光劑一、發(fā)光一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回

熒光素酶ATP；O2；Mg2+氧化螢火蟲熒光素螢火蟲熒光素生物發(fā)光返回光+AMP+O2+CO2+熒光素酶氧化螢火蟲熒光素螢火蟲熒光素生物發(fā)光返回光化學發(fā)光

機制：某些化合物可以利用化學反應產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài)。當此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。二、化學發(fā)光劑化學發(fā)光劑或發(fā)光底物：在化學發(fā)光反應中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物。發(fā)光劑分為熒光素、生物發(fā)光劑、化學發(fā)光劑化學發(fā)光機制：某些化合物可以利用化學反應產(chǎn)生的能二、化學①能參與化學發(fā)光反應；②與抗原或抗體偶聯(lián)后形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑；③偶聯(lián)后仍保留高的量子效應和反應動力；④應不改變或極少改變被標記物的理化特性，特別是免疫活性。化學發(fā)光劑應符合以下幾個條件返回①能參與化學發(fā)光反應；化學發(fā)光劑應符合以下幾個條件返回1.酶促反應的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物。CLEIA中常用的酶有HRP和APHRP的發(fā)光底物有魯米諾、對-羥基苯乙酸AP的發(fā)光底物有AMPPD、4-MUP（熒光底物）特點：可作標記物、也可作過氧化物酶的底物1.1魯米諾H2O2/OH—HRP+N2+H2O

+光1.酶促反應的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光對-羥基苯乙酸（HPA）HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚體（熒光物質(zhì)），在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長的熒光，可用熒光光度計測量。1.2HPAH2O2HRP+熒光氧化二聚體對-羥基苯乙酸（HPA）HPA在H2O2存在下被HRP氧化AMPPDAMPPD在堿性條件下，被AP酶解生成相當穩(wěn)定的AMP-D陰離子，其有2～30min的分解半衰期，發(fā)出波長為470nm的持續(xù)性光，在15min時其強度達到高峰，15～60min內(nèi)光強度保持相對穩(wěn)定。光AP

/OH—HPO42—1.3AMPPDAMPPDAMPPD在堿性條件下，被AP酶解生成相當穩(wěn)定的4-MUP4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的激發(fā)光的作用下，發(fā)出448nm的熒光，可用熒光光度計進行測量。熒光AP1.44-MUP4-MU360nm激發(fā)光H3PO4+4-MUP4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在3602.直接化學發(fā)光劑特點：不需催化劑，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光的物質(zhì)。反應迅速、背景低、信比高，發(fā)光量與AE濃度呈線性關系。常用試劑：吖啶酯（acridinium，AE）+CO2+光2.直接化學發(fā)光劑特點：不需催化劑，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件3.電化學發(fā)光劑是指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)出光的物質(zhì)。特點：①反應在電極進行；②電子供體為：三丙胺（TPA）③化學發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕返回三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖3.電化學發(fā)光劑是指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)出返回第二節(jié)發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）一、原理屬于酶免疫測定的一種。只是最后一步酶反應所用底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應發(fā)出的光在特定的儀器上進行測定。二、技術類型

根據(jù)酶促反應底物不同可分為：1.熒光酶免疫測定技術

2.化學發(fā)光酶免疫測定技術根據(jù)免疫學反應模式分

1.雙抗體夾心法和雙抗原夾心法3.固相抗原競爭法：第二節(jié)發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）一、原理屬于酶免疫熒光酶免疫測定技術反應原理圖洗滌棄上清是利用理想的酶熒光底物，生成的產(chǎn)物穩(wěn)定并有強的熒光強度，通過測定熒光強度進行定量。熒光酶免疫測定技術反應原理圖洗滌是利用理想的酶熒光底物，化學發(fā)光酶免疫測定技術反應原理圖洗滌棄上清是利用酶對發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，通過光強度的測定而直接進行定量?；瘜W發(fā)光酶免疫測定技術反應原理圖洗滌是利用酶對發(fā)光底電化學發(fā)光原理圖這一過程可在電極表面周而復始地進行產(chǎn)生許多光子，使光信號增強

返回激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定基態(tài)電極電化學發(fā)光原理圖這一過程可在電極表面周而復始地進行返回激發(fā)1.抗原抗體結(jié)合反應將已包被了抗體的乳膠微粒和待測標本加入反應杯中，經(jīng)溫育一定時間后,再加入AP標記抗體，溫育,形成固相包被抗體-抗原-酶標抗體復合物技術要點2.分離技術將復合物轉(zhuǎn)移到玻璃纖維上，用緩沖液洗滌，沒結(jié)合的抗原被洗脫，酶標抗體-抗原-膠乳微?？贵w復合物則被保留在纖維膜上。3.酶促發(fā)光反應

加入4-MUP，酶標抗體上AP將4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激發(fā)光的照射下，發(fā)出448nm的熒光，經(jīng)熒光儀記錄，放大，根據(jù)標準曲線由電腦計算出所測物質(zhì)的含量1.抗原抗體結(jié)合反應將已包被了抗體的乳膠微技術要點2.1.磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒,與標本中相應抗原或抗體和酶標的抗體或抗原通過一定模式的免疫學反應后,最終通過磁場將結(jié)合酶標記物IC和游離酶標記物進行分離的技術。分離技術2.微粒子捕獲法：所用顆粒是無磁性微粒子作為抗體或抗原的包被載體,然后用纖維膜柱子進行酶標記物的結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離。3.包被珠分離法：用聚苯乙稀等材料制成小珠,在小珠上包被抗原或抗體,經(jīng)抗原抗體反應后,將結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標記物進行分離.1.磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒,與標分離技術2.微第三節(jié)化學發(fā)光免疫測定技術（CLIA）一、原理用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體,與待測標本中相應Ab或Ag、磁顆粒性的Ag或Ab反應，通過磁場把結(jié)合狀態(tài)（沉淀部分）和游離狀態(tài)的化學發(fā)光劑標記物分離開來，然后加入發(fā)光促進劑進行發(fā)光反應，通過對發(fā)光強度的檢測進行定量或定性檢測。二、技術類型

1.分離方法常用磁顆粒分離技術2.免疫學反應模式同酶發(fā)光免疫測定技術3.不同只是相應標記物是吖啶酯而不是酶第三節(jié)化學發(fā)光免疫測定技術（CLIA）一、原理用化學1.抗原抗體結(jié)合反應將包被McAb的磁顆粒和待測標本加入到反應管中，標本中待測Ag與磁珠上Ab結(jié)合，再加上AE標記Ab，經(jīng)過溫育，形成磁珠Ab-Ag-AE標記Ab復合物。技術要點2.分離技術在電磁場中進行2-3次洗滌后，很快地將未結(jié)合的多余Ag和標記Ab洗去。3.化學發(fā)光反應經(jīng)洗滌的磁珠中，加入H2O2和pH糾正液NaOH，這時AE不需要催化劑即分解并發(fā)光，由集光器接收，經(jīng)光電倍增管放大，記錄1S內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，其積分與被測物含量成正比，按標準曲線，儀器可計算出被測物含量。1.抗原抗體結(jié)合反應將包被McAb的磁顆粒和待技術要點1.AE其低背景噪音、化學反應簡單、快速而無催化劑。方法評價2.AE與大分子的結(jié)合并無減少所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度，靈敏度可達10-15g/ml。3.AE標記試劑有效期長，可達一年。4.固相分離劑為極為幼細的磁粉，除增大包被面積，加快反應外，亦同時使清洗及分離更簡易、快捷。1.AE其低背景噪音、化學反應簡單、快速而無催方法評價2第四節(jié)電化學發(fā)光免疫測定技術（ECLI）一、原理是一種在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應，實際上包括了電化學和化學發(fā)光二個過程。ECL是電啟動發(fā)光反應，而CL是通過化合物混合啟動發(fā)光反應。用化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+標記Ab，通過Ag-Ab反應和磁珠分離技術，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的Ag或Ab進行定量/定性。二、技術類型

1.分離方法常用磁顆粒分離技術2.免疫學反應模式同酶發(fā)光免疫測定技術3.相應標記物是三聯(lián)吡啶釕而不是酶第四節(jié)電化學發(fā)光免疫測定技術（ECLI）一、原理是一1.三聯(lián)吡啶釕標記抗體和生物素標記抗體與待測標本同時加入一個反應杯中孵育反應技術要點2.將鏈霉親和素（SA）包被磁珠加入反應杯中，再次孵育，使生物素（B）通過與親和素（A）的結(jié)合，將磁珠、Ab連接為一體，形成雙Ab夾心法。3.蠕動泵將形成的[Ru(bpy)3]2+-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠復合體吸入流動測量室，磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面。同時，游離的Ab也被吸出測量室。4.蠕動泵加入TPA，電極加電壓，啟動ECL反應過程。該過程在電極表面周而復始地進行，產(chǎn)生許多光子，光電倍增管檢測光強度，其與[Ru(bpy)3]2+的濃度呈線性關系,故可測出待測Ag的含量。1.三聯(lián)吡啶釕標記抗體和生物素標記抗體與待測標本技術要點原理圖返回抗體包被樣本Ru(byp)2+TPA緩沖的磁珠抗原標記抗體液洗滌3原理圖返回抗體包被樣本Ru(byp)2方法評價①標記物的再循環(huán)利用，使發(fā)光時間更長、強度更高、易于測定；②敏感度高，可達pg／ml或pmol水平；③線性范圍寬＞104；④反應時間短，20min以內(nèi)可完成測定；⑤試劑穩(wěn)定性好，2～5℃可保持一年以上。

方法評價①標記物的再循環(huán)利用，使發(fā)光時間更長、強五、臨床應用1.甲狀腺激素2.生殖激素3.腎上腺/垂體激素4.貧血因子5.腫瘤標記物6.感染性疾病7.糖尿病8.心血管系統(tǒng)9.病毒標記物10.骨代謝11.過敏性疾病12.治療藥物監(jiān)測返回五、臨床應用1.甲狀腺激素2.生殖激素返回此課件下載可自行編輯修改，僅供參考！

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2.化學發(fā)光免疫測定技術(CLIA)chemiluminescenceimmunoassay

3.電化學發(fā)光免疫測定技術(ECLI)

electrochemiluminescenceimmunoassay按分離方法不同分

1.微粒子化學發(fā)光免疫測定

2.磁顆?；瘜W發(fā)光免疫測定化學發(fā)光免疫技術的類型按發(fā)光劑不同分為第一節(jié)發(fā)光與化學發(fā)光劑一、發(fā)光一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。1.光照發(fā)光:發(fā)光劑經(jīng)短波長入射光照射后進入激發(fā)態(tài)，當回復至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。2.生物發(fā)光:反應底物在熒光素酶的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出。3.化學發(fā)光:在常溫下由化學反應產(chǎn)生的光的發(fā)射?；瘜W發(fā)光是一個多步驟的過程。第一節(jié)發(fā)光與化學發(fā)光劑一、發(fā)光一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回

熒光素酶ATP；O2；Mg2+氧化螢火蟲熒光素螢火蟲熒光素生物發(fā)光返回光+AMP+O2+CO2+熒光素酶氧化螢火蟲熒光素螢火蟲熒光素生物發(fā)光返回光化學發(fā)光

機制：某些化合物可以利用化學反應產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài)。當此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。二、化學發(fā)光劑化學發(fā)光劑或發(fā)光底物：在化學發(fā)光反應中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物。發(fā)光劑分為熒光素、生物發(fā)光劑、化學發(fā)光劑化學發(fā)光機制：某些化合物可以利用化學反應產(chǎn)生的能二、化學①能參與化學發(fā)光反應；②與抗原或抗體偶聯(lián)后形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑；③偶聯(lián)后仍保留高的量子效應和反應動力；④應不改變或極少改變被標記物的理化特性，特別是免疫活性?；瘜W發(fā)光劑應符合以下幾個條件返回①能參與化學發(fā)光反應；化學發(fā)光劑應符合以下幾個條件返回1.酶促反應的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物。CLEIA中常用的酶有HRP和APHRP的發(fā)光底物有魯米諾、對-羥基苯乙酸AP的發(fā)光底物有AMPPD、4-MUP（熒光底物）特點：可作標記物、也可作過氧化物酶的底物1.1魯米諾H2O2/OH—HRP+N2+H2O

+光1.酶促反應的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光對-羥基苯乙酸（HPA）HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚體（熒光物質(zhì)），在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長的熒光，可用熒光光度計測量。1.2HPAH2O2HRP+熒光氧化二聚體對-羥基苯乙酸（HPA）HPA在H2O2存在下被HRP氧化AMPPDAMPPD在堿性條件下，被AP酶解生成相當穩(wěn)定的AMP-D陰離子，其有2～30min的分解半衰期，發(fā)出波長為470nm的持續(xù)性光，在15min時其強度達到高峰，15～60min內(nèi)光強度保持相對穩(wěn)定。光AP

/OH—HPO42—1.3AMPPDAMPPDAMPPD在堿性條件下，被AP酶解生成相當穩(wěn)定的4-MUP4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的激發(fā)光的作用下，發(fā)出448nm的熒光，可用熒光光度計進行測量。熒光AP1.44-MUP4-MU360nm激發(fā)光H3PO4+4-MUP4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在3602.直接化學發(fā)光劑特點：不需催化劑，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光的物質(zhì)。反應迅速、背景低、信比高，發(fā)光量與AE濃度呈線性關系。常用試劑：吖啶酯（acridinium，AE）+CO2+光2.直接化學發(fā)光劑特點：不需催化劑，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件3.電化學發(fā)光劑是指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)出光的物質(zhì)。特點：①反應在電極進行；②電子供體為：三丙胺（TPA）③化學發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕返回三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖3.電化學發(fā)光劑是指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)出返回第二節(jié)發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）一、原理屬于酶免疫測定的一種。只是最后一步酶反應所用底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應發(fā)出的光在特定的儀器上進行測定。二、技術類型

根據(jù)酶促反應底物不同可分為：1.熒光酶免疫測定技術

2.化學發(fā)光酶免疫測定技術根據(jù)免疫學反應模式分

1.雙抗體夾心法和雙抗原夾心法3.固相抗原競爭法：第二節(jié)發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）一、原理屬于酶免疫熒光酶免疫測定技術反應原理圖洗滌棄上清是利用理想的酶熒光底物，生成的產(chǎn)物穩(wěn)定并有強的熒光強度，通過測定熒光強度進行定量。熒光酶免疫測定技術反應原理圖洗滌是利用理想的酶熒光底物，化學發(fā)光酶免疫測定技術反應原理圖洗滌棄上清是利用酶對發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，通過光強度的測定而直接進行定量?；瘜W發(fā)光酶免疫測定技術反應原理圖洗滌是利用酶對發(fā)光底電化學發(fā)光原理圖這一過程可在電極表面周而復始地進行產(chǎn)生許多光子，使光信號增強

返回激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定基態(tài)電極電化學發(fā)光原理圖這一過程可在電極表面周而復始地進行返回激發(fā)1.抗原抗體結(jié)合反應將已包被了抗體的乳膠微粒和待測標本加入反應杯中，經(jīng)溫育一定時間后,再加入AP標記抗體，溫育,形成固相包被抗體-抗原-酶標抗體復合物技術要點2.分離技術將復合物轉(zhuǎn)移到玻璃纖維上，用緩沖液洗滌，沒結(jié)合的抗原被洗脫，酶標抗體-抗原-膠乳微?？贵w復合物則被保留在纖維膜上。3.酶促發(fā)光反應

加入4-MUP，酶標抗體上AP將4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激發(fā)光的照射下，發(fā)出448nm的熒光，經(jīng)熒光儀記錄，放大，根據(jù)標準曲線由電腦計算出所測物質(zhì)的含量1.抗原抗體結(jié)合反應將已包被了抗體的乳膠微技術要點2.1.磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒,與標本中相應抗原或抗體和酶標的抗體或抗原通過一定模式的免疫學反應后,最終通過磁場將結(jié)合酶標記物IC和游離酶標記物進行分離的技術。分離技術2.微粒子捕獲法：所用顆粒是無磁性微粒子作為抗體或抗原的包被載體,然后用纖維膜柱子進行酶標記物的結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離。3.包被珠分離法：用聚苯乙稀等材料制成小珠,在小珠上包被抗原或抗體,經(jīng)抗原抗體反應后,將結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標記物進行分離.1.磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒,與標分離技術2.微第三節(jié)化學發(fā)光免疫測定技術（CLIA）一、原理用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體,與待測標本中相應Ab或Ag、磁顆粒性的Ag或Ab反應，通過磁場把結(jié)合狀態(tài)（沉淀部分）和游離狀態(tài)的化學發(fā)光劑標記物分離開來，然后加入發(fā)光促進劑進行發(fā)光反應，通過對發(fā)光強度的檢測進行定量或定性檢測。二、技術類型

1.分離方法常用磁顆粒分離技術2.免疫學反應模式同酶發(fā)光免疫測定技術3.不同只是相應標記物是吖啶酯而不是酶第三節(jié)化學發(fā)光免疫測定技術（CLIA）一、原理用化學1.抗原抗體結(jié)合反應將包被McAb的磁顆粒和待測標本加入到反應管中，標本中待測Ag與磁珠上Ab結(jié)合，再加上AE標記Ab，經(jīng)過溫育，形成磁珠Ab-Ag-AE標記Ab復合物。技術要點2.分離技術在電磁場中進行2-3次洗滌后，很快地將未結(jié)合的多余Ag和標記Ab洗去。3.化學發(fā)光反應經(jīng)洗滌的磁珠中，加入H2O2和pH糾正液NaOH，這時AE不需要催化劑即分解并發(fā)光，由集光器接收，經(jīng)光電倍增管放大，記錄1S內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，其積分與被測物含量成正比，按標準曲線，儀器可計算出被測物含量。1.抗原抗體結(jié)合反應將包被McAb的磁顆粒和待技術要點1.AE其低背景噪音、化學反應簡單、快速而無催化劑。方法評價2.AE與大分子的結(jié)合并無減少所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度，靈敏度可達10-15g/ml。3.AE標記試劑有效期長，可達一年。4.固相分離劑為極為幼細的磁粉，除增大包被面積，加快反應外，亦同時使清洗及分離更簡易、快捷。1.AE其低背景噪音、化學反應簡單、快速而無催方法評價2第四節(jié)電化學發(fā)光免疫測定技術（ECLI）一、原理是一種在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應，實際上包括了電化學和化學發(fā)光二個過程。ECL是電啟動發(fā)光反應，而CL是通過化合物混合啟動發(fā)光反應。用化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+標記Ab，通過Ag-Ab反應和磁珠分離技術，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的Ag或Ab進行定量/定性。二、技術類型