細胞生物學(xué)技術(shù)：7流式細胞術(shù) 原理、操作及應(yīng)用課件

流式細胞術(shù)

---原理、操作及應(yīng)用流式細胞術(shù)

---原理、操作1主要內(nèi)容一、流式細胞儀結(jié)構(gòu)和原理流式細胞術(shù)簡介流式細胞儀的光信號檢測流式細胞儀的結(jié)構(gòu)組成熒光抗體的選擇流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析二、流式細胞術(shù)操作與技巧三、流式細胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用主要內(nèi)容一、流式細胞儀結(jié)構(gòu)和原理21.1流式細胞術(shù)簡介流式細胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞(或生物學(xué)顆粒)的理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。流式細胞儀（FlowCytometer）是集細胞與分子生物學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、光電子技術(shù)、計算機技術(shù)、細胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。1.1流式細胞術(shù)簡介流式細胞術(shù)（FlowCytometr3流式細胞術(shù)的特點檢測對象：單細胞懸液或生物顆粒；檢測參數(shù)：多參數(shù)；檢測特點：單細胞水平分析；檢測速度：高速，最高達上萬個細胞/秒；檢測結(jié)果：精度高、準確性好；可對目標細胞進行分選；流式細胞術(shù)的特點檢測對象：單細胞懸液或生物顆粒；4流式細胞儀的分類分析型流式細胞儀細胞樣本分析后最終進入廢液桶，不能回收利用。分選型流式細胞儀既能流式分析，還能對分析的目的細胞進行分選；進樣管道較長，還需要保持無菌狀態(tài)，所以分選型流式細胞儀一般只用于分選。流式細胞儀的分類分析型流式細胞儀5流式細胞儀的發(fā)展及商品化1934Moldavanl:Firsttry(固定式細胞分析-流動式)；1953Crosland-Taylor:鞘流系統(tǒng)(解決難題)；1956Coulter原理(血細胞計數(shù)器)；1965Kamentsky:分光光度計定量細胞成分和散射光應(yīng)用；1967Kamentsky等設(shè)計了細胞分選的裝置；1969Vandilla等:第一臺熒光檢測細胞計(鞘流聚焦、激光)；1972斯坦福大學(xué):研制出熒光激活細胞分選儀(FACS)；1973BD公司與斯坦福大學(xué)合作，研制生產(chǎn)第一臺商用流

式細胞儀-FACSⅠ。1975Kohler和Milstein:單克隆抗體技術(shù)(促進流式發(fā)展)。流式細胞儀的發(fā)展及商品化1934Moldavanl:F6BD公司分析型流式細胞儀FACSCalibur雙激光四色，市場覆蓋率最高LSRII雙激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配FACSCantoII雙激光六色，三激光八色FACSVerse雙激光六色，三激光八色BD公司分析型流式細胞儀FACSCalibur雙激光四色7BD公司分選型流式細胞儀FACSVantageSEFACSAriaIIIInfluxBD公司分選型流式細胞儀FACSVantageSEFACS81.2流式細胞術(shù)光信號檢測光信號的類型散射光信號：與標記熒光素無關(guān)，是細胞的固有參數(shù)。前向散射光(forwardscatter,FSC);側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).熒光信號自發(fā)熒光(細胞色素因子、核黃素)：微弱特異熒光：標記的熒光素分子發(fā)出

的熒光，比自發(fā)熒光強很多倍。1.2流式細胞術(shù)光信號檢測光信號的類型91.2.1散射光信號（一）前向散射光FSC

FSC信號方向與激光束平行，偏離度一般在1-6度范圍內(nèi)，亦稱小角度散射光，主要反映被測細胞的體積大小和活力。1.2.1散射光信號（一）前向散射光FSC10（二）側(cè)向散射光SSCSSC方向與激光束和液流形成的平面相垂直，亦稱90度散射光，其信號強度反映細胞內(nèi)部顆粒度和精細結(jié)構(gòu)的變化。（二）側(cè)向散射光SSCSSC方向與激光束和液流形成的平面相垂11（三）散射光的作用實驗中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細胞群體，去除碎片、死細胞和粘連細胞的干擾。粒細胞單核細胞淋巴細胞紅細胞、死細胞和碎片（三）散射光的作用實驗中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組12死細胞或碎片粘連細胞腫瘤細胞株FSC/SSC散點圖死細胞加藥處理后FSC/SSC散點圖通過FSC/SSC散點圖，gate出目標細胞進行分析。死細胞粘連細胞腫瘤細胞株FSC/SSC散點圖死細胞加藥處理后131.2.2熒光信號（一）熒光：

物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。發(fā)射波長(熒光波長)Emissionwavelength激發(fā)波長Excitationwavelength＜1.2.2熒光信號（一）熒光：物質(zhì)中的電子吸收光的能量由14（二）常用熒光素<499nm藍色熒光（Blue）；

500-549nm，綠色熒光（Green）；550-584nm，黃色熒光（Yellow）；

585-615nm，橙色熒光（Orange）；616-700nm，紅色熒光（Red）；

≥700nm，遠紅外熒光（Far-Red）。標記抗體的熒光素熒光素分子激發(fā)光波長（nm）發(fā)射光波長（nm）中文名FITC490520異硫氰酸熒光素PE488575藻紅蛋白PerCP490675多甲藻葉綠素蛋白APC650660別藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻紅蛋白-花青素5PE-Cy7496/546767藻紅蛋白-花青素7Alexa

Flour488495519AlexaFlour647650665（二）常用熒光素<499nm藍色熒光（Blue）；15核酸熒光染料PI（碘化丙啶535,623）可選擇性的插入核酸雙螺旋堿基對中。常用于DNA分析，需要用RNase處理細胞排除RNA對DNA熒光定量的影響；PI不能透過活細胞膜，常用于鑒定死細胞。7-AAD（7-氨基放線菌素D545,647）以插入的方式與DNA鏈的G-C堿基對結(jié)合，不能透過活細胞膜，常用于鑒定死細胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚358,456）可以非嵌入方式與DNA鏈上的A-T堿基對特異性結(jié)合。變異系數(shù)明顯小于其他染料，一種理想的DNA定量染料。Hoechst（343,450）常見為Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式與DNA鏈上的A-T堿基對結(jié)合。能對活細胞染色，用于活細胞DNA定量分析，如精子分選；還用于側(cè)群細胞的分選。PY（派若寧560,573）RNA染料，能進入活細胞。AO（吖啶橙509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黃綠色熒光，RNA呈橙黃色熒光，可進行DNA/RNA雙參數(shù)分析。核酸熒光染料161.3流式細胞儀的結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)流動室液流驅(qū)動系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)激發(fā)光源光束收集系統(tǒng)電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)噴嘴電偏轉(zhuǎn)板樣本收集器1.3流式細胞儀的結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)171.3.1液流系統(tǒng)鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來的技術(shù)，可以實現(xiàn)兩種液體的同軸流動，樣本細胞流位于軸心穩(wěn)定流動，外面包裹有鞘液(sheath)。流體動力學(xué)聚焦：穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入截面積較小的部分后，有一個聚焦收縮作用，細胞流直徑被約束在10-20um，避免了多個細胞重疊進入檢測區(qū)。鞘液鞘液細胞流激光照射點流體動力學(xué)聚焦示意圖1.3.1液流系統(tǒng)鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來的技術(shù)，可181.3.2光學(xué)系統(tǒng)（一）激發(fā)光源：激光器氣體激光器：氬離子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪離子(647nm)、氪氬(568nm)；染料激光器：如氬離子激光泵浦的Rhodomin6G水溶液染料激光器，發(fā)出550-650nm可變波長激發(fā)光；半導(dǎo)體激光器：價格低、結(jié)構(gòu)簡單、壽命長。BD的FACSCalibur已采用635nm半導(dǎo)體激光器。激光特點：單波長、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。現(xiàn)在儀器常配有儀器選配2-4根激光器，波長多為488nm、633nm和355nm、405nmUV；1.3.2光學(xué)系統(tǒng)（一）激發(fā)光源：激光器19（二）光收集系統(tǒng)濾光片的組成長通濾片(LP)：只允許特定波長以上的光束通過；短通濾片(SP)：只允許特定波長以下的光束通過；帶通濾片(BP)：只允許一定波長范圍內(nèi)的光束通過。Long

passShortpassBandpass460500540SP500LP500BP500/50460500540460500540（二）光收集系統(tǒng)濾光片的組成Longpass20全反射光路FACSAria流式細胞儀器信號檢測系統(tǒng)PE-Cy7PerCP-Cy5.5PE-TexasRedPEFITCSSC全反射光路FACSAria流式細胞儀器信號檢測系統(tǒng)PE-C211.3.3電子系統(tǒng)光電檢測器將光信號轉(zhuǎn)換成電子信號。前置放大電路將信號等比例放大，輸出電脈沖信號。模數(shù)轉(zhuǎn)換器將模擬的電脈沖信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算機系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。1.3.3電子系統(tǒng)光電檢測器22（一）光電檢測器(photodetector)光電二極管(photodiode)光靈敏度低，測定強信號（FSC）；光電倍增管(photomultiplier,PMT)光靈敏度高，測定弱信號（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。PMT前向散射光光電二極管（一）光電檢測器(photodetector)光電二極管(p23（二）電信號兩種放大方式由于光信號比較弱，需將其等比例放大，方便計算機分析處理，一般信號的放大可以使用線性或?qū)?shù)兩種方式。

線性(linear;lin)對數(shù)(logarithmic;log)一般FSC和SSC變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號變異范圍較大，多使用對數(shù)放大。（二）電信號兩種放大方式由于光信號比較弱，需將其等比例放大，24（三）熒光信號的面積A、寬度W和高度H細胞通過激光檢測區(qū)域時，產(chǎn)生的熒光信號被光電倍增管接收，形成脈沖信號。熒光信號脈沖形成示意圖（三）熒光信號的面積A、寬度W和高度H細胞通過激光檢測區(qū)域時25TimeVoltsPulseAreaPulseHeightPulseWidth0熒光信號脈沖的面積、高度和寬度Width=Area/Height一個信號脈沖有高度、面積和寬度。TimeVoltsPulseAreaPulseHeigh26光信號電信號數(shù)字信號光信號電信號數(shù)字信號27通道(channel)

一個光電檢測器就是一個通道，有多少個光電二極管/倍增管，就有多少個通道：散射光通道:FSC通道和SSC通道；熒光通道通道命名方式：以FL(fluorescence)加數(shù)字命名，如FL1、FL2、FL3等。以該通道接收的主要熒光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。Forexample：FACSCalibur有488nm和633nm兩根激光器，488nm能檢測FSC、SSC、FL1(FITC)、FL2(PE)、FL3(PerCP)，635能檢測FL4(APC)，代表Calibur有6個通道，最多能同時檢測4個熒光，6種參數(shù)。通道(channel)281.3.4流式分選

電荷式分選超聲振動器(15-100kHz)液流充電系統(tǒng)高壓偏轉(zhuǎn)板收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)lasers斷裂點(充電)高壓偏轉(zhuǎn)板1.3.4流式分選電荷式分選lasers斷裂點(充29四路分選原理電荷式分選裝置四路分選原理電荷式分選裝置30分選指標分選時間由三方面決定：進樣速度、目標細胞所占比例、需要收集的細胞數(shù)。需要細胞數(shù)目標細胞所占比例(%)15501041.7min20s2s10516.8min3.4min20s1062.8h3.4min3.4min1071.2天5.6h34min分選時間表(機器流速10000個/s時)分選指標分選時間由三方面決定：進樣速度、目標細胞所占比例、需31分選速度、分選純度和分選收獲率，相互影響。分選純度指被分選出來的細胞所占的百分比，一般能達99%以上。分選收獲率是指被分選出的細胞與原來總細胞的百分比。分選純度和收獲率永遠是相互矛盾的，純度提高，收獲率降低，反之亦然。富集模式(enrichmode)純化模式(purifymode)單細胞模式(singlecellmode)分選速度、分選純度和分選收獲率，相互影響。321.4熒光抗體的選擇A根據(jù)流式細胞儀選擇抗體流式細胞儀能檢測的通道數(shù)(由激光器種類、數(shù)量和使用的光學(xué)濾片決定)。如FACSCalibur：多色標記熒光素搭配原則：每個通道只能選擇一種熒光素；各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。488FL1BP530/30515-545FITC、AF488FL2BP585/42564-606PEFL3670LP﹥670PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7635FL4BP661/16653-669APC、AF6471.4熒光抗體的選擇A根據(jù)流式細胞儀選擇抗體488FL133B根據(jù)抗原表達強弱合理選擇抗體不同的熒光素強度有所不同；高表達的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的熒光素分配給表達低的抗原：CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PEC選擇熒光波譜間光譜重疊較小的熒光染料進行組合，同時需要正確的調(diào)節(jié)補償。CD5B根據(jù)抗原表達強弱合理選擇抗體C選擇熒光波譜間光譜重疊較341.5FCM數(shù)據(jù)存儲、顯示與分析標準的FCM數(shù)據(jù)采用列表模式（listmode），記錄了每個細胞的所有參數(shù)的信息。每個細胞檢測5個參數(shù)，那么獲取10000個細胞，容量為5×10000（字或雙字）。Event#FSCSSCFL1FITCFL2PEFL3APC110050010650421105057007006390480720670104954901572015……1.5FCM數(shù)據(jù)存儲、顯示與分析標準的FCM數(shù)據(jù)采用列表模35FCM數(shù)據(jù)顯示方式單參數(shù)直方圖(Histogram)雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示：散點圖(DotPlot)偽彩圖(Pseudo-colorPlot)等高線圖(ContourPlot)密度圖(DensityPlot)假三維圖(Pseudo3DPlot)三維圖(3DPlot)常用分析軟件CellQuestDivaFlowJOWinMDIFCSExpressFCM數(shù)據(jù)顯示方式單參數(shù)直方圖(Histogram)常用分析36直方圖Histogram細胞的某一單參數(shù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分布圖，橫坐標表示熒光信號或散射光信號相對強度的值，單位是道數(shù)，縱坐標一般是細胞數(shù)。Event#FL1FITC11027003720415……0…………10…………100…………1000CountsFITC熒光強度直方圖Histogram細胞的某一單參數(shù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分布圖，橫37橫坐標既可以是線性的，也可以是對數(shù)的。DNA倍體分析抗原表達分析Overlay圖橫坐標既可以是線性的，也可以是對數(shù)的。DNA倍體分析抗原表達38散點圖散點圖中每個點代表一個細胞，X軸與Y軸分別代表一種參數(shù)，優(yōu)點是比直方圖直觀。FL1FL2散點圖散點圖中每個點代表一個細胞，X軸與Y軸分別代表一種參數(shù)39散點圖和偽彩圖散點圖和偽彩圖40等高圖和密度圖等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細胞數(shù)目相等，越在里面的曲線代表細胞數(shù)目越多。密度圖：點密度越大的地方細胞越多，點密度越小的地方細胞少。等高圖和密度圖等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細胞41假三維圖和三維圖SSC-HeightFSC-HeightCountsSSC→CD45→CD14→假三維圖和三維圖SSC-HeightFSC-HeightCo42設(shè)門與數(shù)據(jù)分析門(Gate，簡寫G)是流式細胞術(shù)中的一個重要術(shù)語，F(xiàn)CM數(shù)據(jù)分析過程實際上就是選門和設(shè)門的過程。橢圓形圓形設(shè)門與數(shù)據(jù)分析門(Gate，簡寫G)是流式細胞術(shù)中的一個重要43矩形任意形狀R(Region，區(qū)域)。門可以是單一區(qū)域(G=R1)，也可以是幾個區(qū)域組合在一起：G=R1andR2;G=R1orR2;G=R1notR2。矩形任意形狀R(Region，區(qū)域)。門可以是單一區(qū)域(G=44十字門線性門十字門線性門45二、流式細胞術(shù)操作與技巧流式細胞術(shù)操作流程：培養(yǎng)細胞血液骨髓新鮮組織石蠟包埋單細胞懸液制備熒光染色上機檢測表型測定細胞分選繼續(xù)培養(yǎng)FISHPCR統(tǒng)計學(xué)分析二、流式細胞術(shù)操作與技巧流式細胞術(shù)操作流程：表型測定繼續(xù)培養(yǎng)462.1單細胞懸液制備2.2免疫熒光標記2.3對照的設(shè)置2.4光譜重疊與補償2.1單細胞懸液制備472.1單細胞懸液制備2.1.1新鮮實體組織的樣本制備

對于不同組織來源的實體組織和實體瘤標本，應(yīng)該根據(jù)各自特點選擇不同的分散細胞方法，以期達到單細胞產(chǎn)量高、損傷小的目的。常用方法有：酶消化法機械法化學(xué)試劑處理法2.1單細胞懸液制備2.1.1新鮮實體組織的樣本制備48酶消化法：根據(jù)分散組織類型來確定使用的酶類：胰蛋白酶—水解酯鍵、肽鍵；膠原酶—降解幾種分子類型的膠原；溶菌酶—水解糖蛋白、肽的糖苷鍵；彈性蛋白酶—消化糖蛋白、彈性蛋白的纖維。將新鮮組織置于離心管中，加入1-2ml酶消化20-30min（恒溫37℃或室溫），間斷振蕩或吹打；終止消化，收集細胞懸液，300目尼龍網(wǎng)過濾，除去細胞團塊，低速離心除去細胞碎片；將制備好的單細胞懸液進行熒光標記或保存?zhèn)溆?。注意：酶的使用濃度、溫度、消化時間、酶活性的pH值。酶消化法：根據(jù)分散組織類型來確定使用的酶類：49機械法特點：易造成細胞碎片和團塊，實際操作時，應(yīng)注意碎片和團塊的去除，常與其他方法（如酶消化法）配合使用。組織解離器機械法：有剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法等。利用機械方法、物理方法給予組織交大的壓力，使細胞從組織間分散開來。機械法特點：易造成細胞碎片和團塊，實際操作時，應(yīng)注意碎片和團50化學(xué)處理法：作用原理：將組織細胞間起黏著作用的鈣、鎂離子置換出來，從而使細胞分散開來，常用試劑有EDTA、EGTA、TPB等。EDTA是一種螯合劑，可以和組織間的鈣、鎂離子形成螯合物，實際運用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白酶）。特點：用化學(xué)法細胞存活率低、細胞產(chǎn)額低，細胞碎片和聚集量不穩(wěn)定?；瘜W(xué)處理法：51機械法往往造成嚴重的細胞損傷，而結(jié)果卻是較低的細胞產(chǎn)量，注意去除細胞碎片和團塊以免影響FCM結(jié)果，如低速離心去碎片、尼龍網(wǎng)過濾團塊等。酶消化法、化學(xué)試劑處理法對實體組織的分散效果較理想，但會造成所測化學(xué)成分的不良影響。根據(jù)實驗?zāi)康娜ミx擇合適的單細胞懸液制備方法，最終要求細胞呈單個分散狀態(tài)；細胞碎片、團塊盡量少；細胞活性不受到明顯損傷，保證下一步熒光染色。細胞生物學(xué)技術(shù)：7流式細胞術(shù)原理、操作及應(yīng)用課件522.1.2石蠟包埋組織樣本制備切片：將石蠟組織切成50um厚的組織片4-5片，放入1試管中；脫脂：加入二甲苯3-5ml脫脂，室溫下1-2天，脫凈后棄二甲苯；水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步10min，去乙醇后加入蒸餾水3-5ml，3-5min后棄水；消化：加入5ml0.5%胃蛋白酶（pH1.5-2.0），37℃恒溫水浴30min，每隔5-10min振蕩一次；終止消化：加冷的PBS或生理鹽水終止消化；過濾：用300目尼龍網(wǎng)過濾，未消化好的組織可做第二次消化；收集細胞懸液：將過濾液離心沉淀，再用PBS漂洗1-2次，低速離心沉淀去除碎片；根據(jù)實驗?zāi)康臉擞洘晒饪贵w，或保存細胞備用。2.1.2石蠟包埋組織樣本制備切片：將石蠟組織切成50um532.1.3血液、骨髓樣本制備外周血單個核細胞PBMC的分離血液層Ficoll層血漿層PBMCFicoll層紅細胞層離心前離心后Ficoll密度梯度離心法分離PBMC注意：由于多核粒細胞比較大，粒細胞沉降在紅細胞層，所以該法不適合粒細胞研究；該法操作過程中可能丟失一些有意義的細胞或細胞亞群，所以臨床上一般不主張分離血液或骨髓的單個核細胞。2.1.3血液、骨髓樣本制備外周血單個核細胞PBMC的分離54紅細胞裂解液去除紅細胞原理：紅細胞裂解液成分為低滲的NH4Cl溶液，利用雙凹型的紅細胞膜抗性差，白細胞膜抗性比較好的特點，加入低滲透壓的紅細胞裂解液時，紅細胞膜脹破，而白細胞膜不受影響，從而達到去除紅細胞的目的。紅細胞裂解液去除紅細胞552.1.4培養(yǎng)細胞單細胞懸液制備2.1.5體液脫落細胞樣本制備懸浮生長細胞吸管反復(fù)吹打貼壁生長細胞消化處理離心獲得單細胞懸液洗脫液尿液胸腹水離心收集細胞，用生理鹽水或PBS洗滌3次300目尼龍膜過濾后離心沉淀去上清單細胞懸液2.1.4培養(yǎng)細胞單細胞懸液制備2.1.5體液脫落細胞樣56FCM可檢測下列細胞成分：表面標記物胞漿標記物核內(nèi)標記物可溶性成分2.2免疫熒光染色黏附因子表面受體細胞因子分泌到胞外的細胞因子胞內(nèi)抗原核酸含量核內(nèi)抗原FCM可檢測下列細胞成分：2.2免疫熒光染色黏附因子表面受57熒光素偶聯(lián)抗體抗體上偶聯(lián)熒光素(FITC、PE等)，通過抗原抗體反應(yīng)讓目標細胞特異性的帶上熒光。染色過程即抗原抗體反應(yīng)過程。熒光染料/熒光化合物PI、DAPI等插入核酸鏈中；CFSE和蛋白質(zhì)共價結(jié)合；AnnexinV-FITC檢測凋亡。熒光蛋白如GFP，不需要染色，直接檢測。熒光素偶聯(lián)抗體58免疫熒光染色主要包括直接和間接免疫熒光染色兩種方法。間接標記的方法難以進行多色標記，而且操作復(fù)雜、信噪比高，所以一般首先直標熒光抗體。熒光抗體熒光二抗第一抗體直接標記間接標記免疫熒光染色主要包括直接和間接免疫熒光染色兩種方法。間接標記59一般檢測時，獲取1～2萬個細胞，標記0.5～1×106細胞即可。下述情況細胞量需相應(yīng)增加：檢測胞內(nèi)/核內(nèi)抗原，離心次數(shù)多；細胞周期乙醇固定損失細胞多；檢測細胞在標本中比例低···0.5～1×106個細胞孵育體積50-100ul上機體積200-500ul終濃度約1×106個/ml加染料洗滌后補加液體細胞表面抗原標記一般檢測時，獲取1～2萬個細胞，標記0.5～1×106細胞即60表面抗原分析是流式應(yīng)用中最廣泛的，標記步驟也相對簡單。標記：取0.5～1×106細胞，加入適量抗體(根據(jù)抗體說明書)，充分混勻后(總體積50-100ul)，4℃避光孵育10-30min。洗滌：加入1mlPBS洗液，300g離心洗滌5min。上機檢測：棄去上清后加入200-500ulPBS，重懸細胞后立即上機檢測；如不能及時上機檢測，則加入同樣體積的1%多聚甲醛，混勻后置于4℃冰箱內(nèi)保存，一般不超過24h。表面抗原分析是流式應(yīng)用中最廣泛的，標記步驟也相對簡單。61胞內(nèi)抗原熒光標記細胞內(nèi)抗原：如MPO；核內(nèi)抗原：如FoxP3；細胞內(nèi)細胞因子(胞內(nèi)因子)：IFN-r、IL-4、IL-17等。固定：4％多聚甲醛破膜/透化0.05%皂素(saponin)；0.01%TritonX-100

70%乙醇胞內(nèi)抗原熒光標記細胞內(nèi)抗原：如MPO；62膜表面抗原染色：分別加入相應(yīng)的熒光素標記抗體和適量細胞標本，充分混勻后避光孵育10-30min。洗滌：加1mlPBS洗液，300g離心5min。固定：去上清后加入500ul4%多聚甲醛，固定20min。透化：離心洗去固定劑后，加皂素500ul，透化10min。胞內(nèi)抗原染色：離心洗去透化液后，加入相應(yīng)熒光素標記抗體，混勻后室溫避光孵育30min。洗滌：加1mlPBS洗液，300g離心5min。上機檢測：棄去上清后加入PBS200-500ul后上機檢測。膜表面抗原染色：分別加入相應(yīng)的熒光素標記抗體和適量細胞標本，632.3對照的設(shè)置空白對照細胞內(nèi)物質(zhì)自身也發(fā)出熒光，能被FCM靈敏的檢測到，這種未染色的細胞自身發(fā)出的一些熒光稱為自發(fā)熒光。設(shè)置空白對照（未染色的細胞），用以區(qū)分細胞的自發(fā)熒光和特異性熒光，避免假陽性的結(jié)果。2.3對照的設(shè)置空白對照64流式結(jié)果中熒光強弱是一個相對值，光電倍增管電壓越大，電子信號越強；電壓越小，信號越弱。通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性對照管的熒光強度處于陰性的位置，實驗組的熒光值都是相對對照組。001001002流式結(jié)果中熒光強弱是一個相對值，光電倍增管電壓越大，電子信號65陽性對照PositiveControl設(shè)置陽性對照是為了檢測熒光抗體是否有效，并不是每次分析時都必須設(shè)置：使用新的熒光素抗體時；使用存儲時間較長的熒光素抗體時。設(shè)置陽性對照的方法：用肯定表達有該抗原的細胞來檢測；已經(jīng)證明有效的、偶聯(lián)其他熒光素的該抗原的抗體。單標對照SingleStainingControl兩色或多色實驗時須設(shè)置單標對照，用于補償?shù)恼{(diào)節(jié)；單標實驗時不需要。陽性對照PositiveControl設(shè)置陽性對照是為了檢662.4光譜重疊與補償當細胞攜帶兩種以上熒光素激發(fā)出不同波長熒光時，理論上可選擇濾光片使每種熒光僅被相應(yīng)的通道檢測到。但由于目前使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間各自發(fā)射的峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊，因而少量的熒光信號會被另一通道檢測到，這種現(xiàn)象就是光譜重疊(spectraloverlap)。FL1530/30FL2585/42發(fā)射波長FITC發(fā)射譜PE發(fā)射譜2.4光譜重疊與補償當細胞攜帶兩種以上熒光素激發(fā)出不同波長67實驗操作中，常利用電子技術(shù)和計算機軟件設(shè)置的方法將串入相鄰熒光通道的信號扣除，這種技術(shù)稱為熒光補償(fluorescencecompensation)。FL-1(FITC)FL-2(PE)FL-1(FITC)FL-2(PE)FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(-)FL-1(-)FL-2(PE)FL1-%FL2補償前補償后FITC單標PE單標實驗操作中，常利用電子技術(shù)和計算機軟件設(shè)置的方法將串入相鄰熒68未補償正確補償FITC-PE補償太大PE-FITC補償太大補償調(diào)節(jié)要合適未補償正確補償FITC-PE補償太大PE-FITC補償太大補69三、流式細胞術(shù)的應(yīng)用細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細胞結(jié)構(gòu)特異性抗原（細胞表面/胞漿/核）細胞內(nèi)細胞因子細胞活性酶活性激素結(jié)合位點細胞受體細胞功能在上述分析基礎(chǔ)上進行分選三、流式細胞術(shù)的應(yīng)用細胞大小細胞結(jié)構(gòu)特異性抗原細胞功能在上述703.1檢測細胞周期3.2檢測細胞凋亡3.3檢測細胞增殖3.4免疫細胞亞型檢測3.5檢測細胞因子3.6檢測細胞吞噬功能3.7流式分選3.1檢測細胞周期713.1檢測細胞周期處于不同細胞周期的細胞DNA含量不同，G0/G1期細胞含有二倍體量的DNA，G2/M期細胞含有四倍體量的DNA，而S期細胞DNA含量處于二倍體和四倍體量之間。DNAContentDNA熒光染料能與DNA結(jié)合，DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強度反應(yīng)了DNA吸收熒光分子的多少。通過流式檢測就能反映細胞內(nèi)DNA的含量，區(qū)分細胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期細胞比例。3.1檢測細胞周期處于不同細胞周期的細胞DNA含量不同，G72細胞周期分析核酸染料細胞膜非通透性染料：PI(碘化丙啶)、EB(溴化乙啶)，不能進入完整細胞膜，標記時需要通過固定等方法增加細胞膜的通透性。細胞膜通透性染料：DAPI、Hoechst，能染活細胞的DNA，但需紫外激光激發(fā)。PI標記法檢測細胞周期需要乙醇固定增加細胞膜的通透性；需要加RNase，去除RNA對DNA的干擾。細胞周期分析核酸染料73PI法檢測細胞周期一般步驟：收集單細胞懸液(1×106個)，緩慢加入1ml預(yù)冷的70％乙醇，于4℃固定過夜，或-20℃長期固定。離心收集細胞，再以1mlPBS徹底洗去乙醇；去上清后加入染色液(包含50ug/mlPI，100ug/mlRNaseA，0.2%TritonX-100)，37℃染色30min后上機檢測。

PI法檢測細胞周期一般步驟：74細胞周期檢測結(jié)果脾臟細胞培養(yǎng)腫瘤細胞通過流式檢測，能得出G0/G1期、S期和G2/M期細胞比例。增殖指數(shù)(proliferousindex,PI)：指處于S期和G2/M期細胞之和占總細胞的比例，反映了細胞的增殖能力。CV值(變異系數(shù))：衡量儀器測量分辨率和精度的指標。細胞周期檢測結(jié)果脾臟細胞培養(yǎng)腫瘤細胞通過流式檢測，能得出G075DNA倍體分析病變腫瘤細胞常出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和染色體異常，流式檢測DNA含量能反映異倍體情況。DNA指數(shù)(DNAindex,DI)：(樣本的G0/G1期峰平均熒光道數(shù))/(正常二倍體細胞G0/G1期峰平均熒光道數(shù))，描述樣品細胞DNA含量的偏離程度和倍體水平。倍體(ploidy)：染色體數(shù)目。二倍體DI=1；四倍體DI=2；二倍體四倍體之外統(tǒng)稱異倍體。二倍體異倍體異倍體DNA倍體分析病變腫瘤細胞常出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和染色體異常，流式檢測D76精子單倍體細胞精子單倍體細胞77雙聯(lián)體細胞的去除

利用信號脈沖FL2-W/FL2-A區(qū)別標本中的粘連細胞以及碎片，最大程度的減少假陽性。G1雙聯(lián)體細胞G2/M細胞FL2-WFL2-WFL2-HFL2-HFL2-WFL2-A雙聯(lián)體細胞的去除G1雙聯(lián)體細胞G2/M細胞FL2-WFL2-78細胞生物學(xué)技術(shù)：7流式細胞術(shù)原理、操作及應(yīng)用課件793.2檢測細胞凋亡細胞死亡方式主要有兩種：包括細胞壞死(necrosis)和細胞凋亡(apoptosis)。細胞凋亡，也稱細胞程序性死亡，是細胞受基因調(diào)控的一種主動性的、高度有序的結(jié)束自己生命的過程。凋亡細胞在形態(tài)學(xué)和生化上有明顯的特征，如細胞皺縮、核固縮、細胞膜卷曲、DNA片段化、線粒體電位發(fā)生變化。根據(jù)這些特征，流式有多種方法能定性及定量的檢測細胞凋亡情況。3.2檢測細胞凋亡細胞死亡方式主要有兩種：包括細胞壞死(n803.2.1亞二倍體(Sub-G1)峰的檢測

凋亡細胞核小體崩解，DNA含量減少，加之由于DNA的降解，與熒光染料的結(jié)合減少，因此DNA染料的著色能力下降，熒光強度降低，表現(xiàn)在G1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，即亞G1峰(凋亡峰)。細胞凋亡峰Sub-G1四倍體峰二倍體峰PINumber3.2.1亞二倍體(Sub-G1)峰的檢測凋亡細胞核小體813.2.2AnnexinV/PI雙染法正常細胞膜是不對稱性的，胞漿面含有帶負電的磷脂(如磷脂酰絲氨酸,PS)。早期凋亡時，細胞表面不對稱性發(fā)生改變，PS外翻到胞外側(cè)。AnnexinV是一種Ca2+依賴性的對PS有高度親和力的磷脂結(jié)合蛋白，可作為探針識別膜表面是否有PS，從而識別凋亡細胞。PS外翻3.2.2AnnexinV/PI雙染法正常細胞膜是不對稱82PI常用于鑒別死細胞。凋亡細胞的細胞膜仍然是完整的，所以PI不能進入早期凋亡細胞核內(nèi)。AnnexinV-FITCPI活細胞早期凋亡晚期凋亡壞死細胞裸核PI常用于鑒別死細胞。凋亡細胞的細胞膜仍然是完整的，所以PI83免疫熒光圖免疫熒光圖84C1h2h3h4h5hC1h2h3h4h5h853.2.3線粒體膜電位檢測法凋亡細胞線粒體膜電位會發(fā)生改變，利用熒光探針羅丹明123(Rh123)、DiOC6和JC-1等標記后，經(jīng)過流式能檢測出線粒體電位的變化，從而反映了細胞的凋亡情況。JC-1在正常細胞中在胞漿以聚合體形式存在，在Fl-1和Fl-2有熒光；細胞凋亡時線粒體膜電位發(fā)生去極化，JC-1進入線粒體以單體形式存在，僅在Fl-1通道有熒光。JC-1(Fl-1)JurkatTCellsControl

CamptothecinJC-1(Fl-2)3.2.3線粒體膜電位檢測法凋亡細胞線粒體膜電位會發(fā)生改變863.2.4DNA斷裂片段的檢測(TUNNEL法)凋亡中晚期會發(fā)生核酸內(nèi)切酶的激活，雙鏈的DNA出現(xiàn)不對稱的斷裂點，即產(chǎn)生一系列3’-OH端。加入外源性的脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)能夠催化外源性熒光素標記的dUTP連接到DNA的3’-OH端，通過流式檢測就能知道DNA斷裂片段的多少，這種方法叫做TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記法(TdTmediated-dUTPnickendlabeling,TUNEL)。近來研究證實，Br-dUTP(BrdU)更容易摻入到凋亡細胞的DNA中，所以現(xiàn)在流式中都先用BrdU進行摻入反應(yīng)，然后使用熒光素標記的BrdU抗體進行細胞染色，流式檢測后得到凋亡結(jié)果。3.2.4DNA斷裂片段的檢測(TUNNEL法)凋亡中晚期87TUNEL法檢測凋亡原理TUNEL法檢測凋亡原理88Fas-inducedApoptosisinJurkatTCellsAnnexinV-FITCAnnexinV/PI雙染法PITUNEL法BrdU-FITCFas-inducedApoptosisinJurka893.3檢測細胞增殖細胞增殖(proliferation)是細胞生命活動的重要特征之一。檢測細胞增殖的方法主要有：MTT檢測法胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入法流式細胞術(shù)細胞周期法相對計數(shù)法/絕對計數(shù)法示蹤染料標記法BrdU標記法增殖蛋白檢測3.3檢測細胞增殖細胞增殖(proliferation)是903.3.1示蹤染料標記法示蹤染料能與細胞發(fā)生非特異性的穩(wěn)定結(jié)合，主要有兩種結(jié)合方式：一種進入胞內(nèi)與蛋白質(zhì)共價結(jié)合，如CFSE和BRSE；另一種嵌入細胞膜的脂質(zhì)雙分子層，與細胞非共價結(jié)合，如PKH類和CellVue類等。CFSE標記細胞后對細胞沒有很強毒性，被激發(fā)后能發(fā)出很強的熒光，并且非常穩(wěn)定，只有當細胞分裂時，母細胞內(nèi)的染料會被平均分配到子細胞中，細胞的熒光信號減少一半。3.3.1示蹤染料標記法示蹤染料能與細胞發(fā)生非特異性的穩(wěn)定91PMA刺激小鼠的脾細胞增殖圖PMA刺激小鼠的脾細胞增殖圖923.3.2BrdU標記法5-溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)是胸腺嘧啶核苷的類似物，在細胞增殖DNA合成時可以與內(nèi)源性的胸腺嘧啶核苷競爭摻入到新合成的DNA中，而BrdU抗體可以特異性的識別BrdU，所以可以檢測細胞增殖。BrBrBrBranti-BrdUBrBrAcidorDNase打開雙鏈3.3.2BrdU標記法5-溴脫氧尿嘧啶核苷(bromod93BrdU標記時同時加入DNA染料(PI,7-AAD)，結(jié)果為一個典型的“馬蹄形”峰，不僅能得到G0/G1期、S期和G2/M期的比例，還能比較不同細胞DNA合成能力的不同。sub-G15.6%G0/G138.6%G2/M14.4%S期38.6%BrdU標記時同時加入DNA染料(PI,7-AAD)，結(jié)果94BrdU標記法檢測細胞增殖的另一優(yōu)勢是：發(fā)揮流式多參數(shù)的特性，能和其他指標同時檢測，既可以是表面抗原，也可以是胞內(nèi)蛋白。取致敏BALB/c小鼠脾臟細胞，體外刺激(PMA和離子霉素)后摻染BrdU45min，標記anti-BrdU、7-AAD、CD8以及IL-10進行多參數(shù)分析27%24%34%38%BrdU標記法檢測細胞增殖的另一優(yōu)勢是：發(fā)揮流式多參數(shù)的特性953.4免疫細胞亞型檢測CD分子是細胞(包括白細胞、紅細胞、血小板、內(nèi)皮細胞等)在分化為不同譜系(lineage)、不同階段以及活化過程中或疾病狀態(tài)下出現(xiàn)或消失的細胞表面標記。分化群(clusterofdifferentiation,CD)：一類分化抗原的總稱，進行流水編號，至2009年已至少有350種CD分子。大多數(shù)白細胞分化抗原在生物進化中具有保守性，但是有些小鼠白細胞分化抗原和人類還是有所不同：某些人CD分子尚未在小鼠中確定；某些人和小鼠CD分子編號相同，但功能有所差別。3.4免疫細胞亞型檢測CD分子是細胞(包括白細胞、紅細胞、96細胞群體人小鼠免疫細胞CD45+CD45+T淋巴細胞CD3+CD3+B淋巴細胞CD19+、CD20+B220(CD45R)+NK細胞CD56+CD335(NKp46)+單核細胞CD14+Mac-1+紅細胞CD235a+Ter119+造血干細胞Lin-CD34+CD38-Lin-Sca-1+CD117+免疫細胞特征表型Lin為譜系標記Lineagemarker，是造血細胞來源的各種血細胞和免疫細胞特異性標記的總稱。Lin雖然包括很多種抗體，干細胞鑒定時，可能把它們標上同一種熒光素，只需分配一個流式通道。各流式抗體公司一般都有用于流式的lineagecocktail。細胞群體人小鼠免疫細胞CD45+CD45+T淋巴細胞CD3+97GranulocytesMonocytesEosinophilsBasophilsNeutrophilsLymphocytesTBNKPeripheralWhiteBloodCellsCD45+THelperCD3+CD4+TCytotoxicCD3+CD8+CD3+CD3-CD19+CD3-CD16+CD56+MonocytesCD14+GranulocytesMonocytesEosinophi983.4.1淋巴細胞亞群分析根據(jù)功能，淋巴細胞主要分為：T淋巴細胞(CD3+)，與細胞免疫有關(guān)；輔助性T細胞(CD3+CD4+)：helperTcells，Th細胞；細胞毒性T細胞(CD3+CD8+)：CytotoxicTcells，Tc細胞。B淋巴細胞(CD19+)，與體液免疫有關(guān)；NK細胞(CD3-CD16+CD56+)，行使免疫監(jiān)控功能，能夠介導(dǎo)對某些腫瘤細胞和病毒感染細胞的細胞毒性作用?？俆、總B和NK細胞的比例以及Th/Tc可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。3.4.1淋巴細胞亞群分析根據(jù)功能，淋巴細胞主要分為：99FSCSSCCD3PerCPSSCCD4FITCCD8PE42.04%48.3%1.8%13.9%35.9%T淋巴細胞亞群分析CD3PerCPCD4FITCCD8PE42.82%37.41%49.68%FSCSSCCD3PerCPSSCCD4FITCCD8100T細胞、B細胞和NK細胞比例檢測亞群百分比(％)絕對計數(shù)(個/ul)總T細胞(CD3+)50-84955-2860總B細胞(CD3-CD19+)5-1890-560NK細胞(CD3+/CD16+CD56+)7-40150-1100健康成年人外周血淋巴細胞參考范圍T細胞、B細胞和NK細胞比例檢測亞群百分比(％)絕對計數(shù)(個1013.4.2樹突狀細胞樹突狀細胞(dendriticcell,DC)是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞，它能高效攝取、加工處理和遞呈抗原。根據(jù)DC來源可將DC分為髓樣DC(myeloidDC,mDC)和漿細胞樣DC(plasmacytoidDC,pDC)。mDC主要由CD34+細胞和單核細胞分化而來，特征性標志為CD11c。pDC與淋巴細胞來源于同一前體細胞，特征性標志為CD123。一般認為：mDC表型為：Lin-/lowHLA-DR+CD11c+CD123-；pDC表型為：Lin-/lowHLA-DR+CD11c-CD123+。（Lin包括CD3、CD14、CD16/56和CD19/20）3.4.2樹突狀細胞樹突狀細胞(dendriticcel102FSC-HeightSSC-HeightLin-FITCHLA-DRPerCPCD123PECD11cAPCR1R2R30.16%R4IdentificationofpDCinPBMCJImmunol.2004;173:1535-1548FSC-HeightSSC-HeightLin-FITCHL103GM-CSF和IL-4分選誘導(dǎo)分化LPS或TNF-

α促成熟CD14+MonocyteImmaturedendriticcellmaturedendriticcellMonocyte-DerivedDendriticCellGM-CSF和IL-4分選誘導(dǎo)分化LPS或TNF-α促成熟1043.4.3調(diào)節(jié)性T細胞調(diào)節(jié)性T細胞(regulatoryTcell,Treg)是在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮負向調(diào)節(jié)作用，屬于一種免疫耐受的細胞，已成為目前免疫學(xué)領(lǐng)域研究的熱門課題。目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種表型的Treg存在，一般認為Treg是指表達特征為CD4+CD25+Foxp3+的一群T淋巴細胞。Foxp3是Treg細胞的特異性標志，它是一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控著Treg分化發(fā)育及功能維持。胞內(nèi)染色法才能檢測，不能用于分選。3.4.3調(diào)節(jié)性T細胞調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory105FSCSSCCD4FITCSSCCD25APCIgG1PECD25APCFoxp3PETreg細胞設(shè)門方法FSCSSCCD4FITCSSCCD25APCIgG1106FSCCD3FITCCD25PESSCCD4PerCP-Cy5.5CD127APC以前根據(jù)CD4+CD25high來分選Treg。最近發(fā)現(xiàn)，CD127(IL-7受體)在Treg中低表達，因此CD127可以作為Treg比較理想的表面標記分子，以CD4+CD25int/highCD127low作為Treg的標志。CD4、CD25、CD127三標法分選Treg細胞FSCCD3FITCCD25PESSCCD4PerCP1073.4.4HLA-B27表型分析與強直性脊柱炎強直性脊柱炎(ankylosingspondylitis,AS)是一種慢性的自身免疫性疾病，主要累及骶髂關(guān)節(jié)、脊柱、脊柱軟骨組織及四肢關(guān)節(jié)，發(fā)生炎癥和增生，嚴重影響人類正常生活，甚至喪失勞動能力。HLA-B27抗原屬于Ⅰ型MHC，基本上表達在機體所有有核細胞表面，特別是淋巴細胞表面含量豐富。研究發(fā)現(xiàn)：HLA-B27的表達與AS有密切相關(guān)性，AS患者中HLA-B27頻率為71-100%，而對照組僅為3-12%。臨床上對疑似AS的病人，通過流式檢測淋巴細胞HLA-B27的表達，作為一項重要的輔助診斷依據(jù)。3.4.4HLA-B27表型分析與強直性脊柱炎強直性脊柱炎108健康人AS患者HLA-B27FITC/CD3PEkit健康人AS患者HLA-B27FITC/CD3PEkit1093.4.5CD34+絕對計數(shù)與造血干細胞移植外周血干細胞移植時，采集物中造血干細胞的數(shù)量對移植的成功有著直接的影響，因此有必要準確測定造血干細胞的絕對數(shù)量。CD34是目前應(yīng)用最多的干細胞表面標記，采用流式細胞術(shù)快速定量CD34+細胞，被臨床上廣泛采用。其基本原理都是加入一定量的微球作為內(nèi)參，通過已知濃度的微球測定CD34+細胞的絕對值。絕對計數(shù)管3.4.5CD34+絕對計數(shù)與造血干細胞移植外周血干細胞移110CD34+細胞絕對計數(shù)計算公式：CD34+細胞絕對值＝(獲取CD34+細胞數(shù)/獲取微球數(shù))×(每管微球數(shù)/標本體積)NogateNogateG=R1andR2orR3CD34+細胞絕對計數(shù)計算公式：NogateNogate1113.5檢測細胞因子細胞因子(cytokine)是一類能在細胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)等功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽。根據(jù)功能可以分為6大類：白細胞介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、生長因子和趨化因子

。細胞因子的檢測方法：ELISA流式細胞術(shù)胞內(nèi)細胞因子：胞內(nèi)染色法(intracellularstainingassay)；胞間細胞因子：CBA法(cytometricbeadassay,流式微球陣列)3.5檢測細胞因子細胞因子(cytokine)是一類能在細1123.5.1胞內(nèi)因子檢測目的：檢測胞內(nèi)因子，結(jié)合膜表面抗原，可以對免疫細胞進行分類，Th1、Th2和Th17。Th細胞根據(jù)分泌細胞因子能力的不同，分為Th1細胞和Th2細胞。細胞免疫體液免疫3.5.1胞內(nèi)因子檢測目的：檢測胞內(nèi)因子，結(jié)合膜表面抗原，113目前并沒有找到公認的細胞表面鑒別標志，所以仍以分泌的細胞因子來區(qū)分Th1和Th2細胞：Th1：CD4+IFN-γ+Th2：CD4+IL-4+Tc1：CD8+IFN-γ+Tc2：CD8+IL-4+Th17是最近發(fā)現(xiàn)的一種效應(yīng)性CD4+T細胞，以分泌IL-17為特征。Th17：CD4+IL-17+目前并沒有找到公認的細胞表面鑒別標志，所以仍以分泌的細胞因子114活化：自然狀態(tài)下，靜止的淋巴細胞不分泌或者分泌極少量細胞因子，刺激激活后，細胞內(nèi)的細胞因子合成增加。常用的刺激劑有佛波酯PMA、離子霉素(Inomycin)、ConA、PHA、LPS等。抑制分泌：細胞因子合成后很快就主動分泌到細胞外，位于細胞內(nèi)的細胞因子的量很少，一般無法達到流式分析檢測的最低標準，因此必須阻止細胞因子分泌到細胞外。蛋白質(zhì)分泌抑制劑如莫能霉素(monensin)、BFA(brefeldinA)能抑制細胞因子分泌，使其累積在細胞內(nèi)。檢測原理活化：自然狀態(tài)下，靜止的淋巴細胞不分泌或者分泌極少量細胞因子115取抗凝血和培養(yǎng)基1:1等體積稀釋，加入刺激劑PMA、離子霉素和阻斷劑莫能霉素，37℃、5%培養(yǎng)箱4-6h；取200ul，溶血后用PBS洗一遍；細胞表面染色：

加PerCP-CD3和APC-CD8室溫孵育20min(PMA刺激后CD4分子會被內(nèi)吞減少)；固定、破膜后加PBS洗一遍；細胞內(nèi)染色：加入熒光抗體FITC-IFN-γ和PE-IL-4，混勻后避光孵育30min；加2ml洗液，離心棄上清，加200ulPBS重懸細胞上機檢測。檢測步驟(以檢測全血Th1/Th2為例)取抗凝血和培養(yǎng)基1:1等體積稀釋，加入刺激劑PMA、離子霉素116細胞因子分析圖細胞因子分析圖117吸毒人外周血Th1/Th2和Tc1/Tc2比例檢測Th2Tc2Tc1Th1吸毒人外周血Th1/Th2和Tc1/Tc2比例檢測Th2Tc118ASRAControl在自身免疫性疾病AS和RA病人外周血中，Th17和Th22細胞增多ASRAControl在自身免疫性疾病AS和RA病人外周血中1193.5.2CBA法CBA(cytometricbeadarray,流式微球陣列)是新發(fā)展起來的能定量檢測胞外游離可溶性成分(如細胞因子等)的新方法。CBA應(yīng)用領(lǐng)域包括血清、血漿、淚液等體液標本以及細胞培養(yǎng)上清液中多種可溶性成分的檢測。技術(shù)優(yōu)點：能同時檢測多種目的蛋白；樣本需求量??；更高的靈敏度和更好的重復(fù)性；操作簡單省時省力。3.5.2CBA法CBA(cytometricbead120+BeadCaptureAbCaptureBeadcytokineDetectionAbCBA技術(shù)原理微球上包被細胞因子抗體后形成捕獲微球(capturebead)，捕獲微球上的捕獲抗體(captureantibody)能與樣本中相應(yīng)的細胞因子特異性結(jié)合。這樣捕獲了細胞因子的微球就類似于一個細胞，加入相應(yīng)的熒光素檢測抗體形成“三明治”式夾心復(fù)合物，上流式后就能得到細胞因子的含量。+BeadCaptureAbCaptureBeadcyt121CBA微球是包被有熒光染料的，一系列熒光強度不同的微球就能同時檢測多種細胞因子。PE-Cy5PEIL-2IL-4IL-8PEPE-Cy5IL-2IL-4IL-8CBA微球是包被有熒光染料的，一系列熒光強度不同的微球就能同122CBAkit中含有已知濃度的標準品，測定前將標準品稀釋成不同濃度，制作標準曲線。CBAkit中含有已知濃度的標準品，測定前將標準品1230pg/mL80pg/mL1250pg/mL5000pg/mLFL3BeadsIL-2IL-4IL-6IL-10TNFIFN-rIFN-rTNF-aIL-10IL-6IL-4IL-2CBA

humanTh1/Th2cytokinekit標準曲線PEPE-Cy50pg/mL80pg/mL1250pg/mL50001243.6檢測細胞吞噬功能巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞等都具有很強的吞噬功能，檢測吞噬功能是免疫學(xué)研究的重要內(nèi)容。把細菌或者吞噬顆粒標上熒光后，與目標細胞在37℃作用一段時間，流式細胞儀檢測熒光信號的強弱就可以區(qū)分目標細胞是否具有吞噬功能以及吞噬功能的強弱。3.6檢測細胞吞噬功能巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞等都125Blood.2008;112:3175-3185實驗組：LRDC和cDC與FITC偶聯(lián)的BSA在37℃作用4h；對照組：LRDC和cDC與FITC偶聯(lián)的BSA在4℃作用4h；LRDC的吞噬功能要強于cDC。BSA-FITCCountsBlood.2008;112:3175-3185實驗組126

3.7.1免疫細胞亞群分選3.7.2GFP陽性穩(wěn)轉(zhuǎn)株分選3.7.3干細胞分選

（一）造血干細胞分選（二）腫瘤干細胞分選

（三）

側(cè)群細胞分選3.7流式分選

3.7.1免疫細胞亞群分選3.7流式分選

1273.7.1免疫細胞亞群分選3.7.1免疫細胞亞群分選1283.7.2GFP陽性穩(wěn)轉(zhuǎn)株分選GFP(greenfluorescentprotein,綠色熒光蛋白)是一種含有內(nèi)在熒光素的蛋白質(zhì)，被488nm激光激發(fā)后能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的綠色熒光，是常用的報告基因。將編碼GFP的基因整合到目標基因的啟動子后面，把構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)，當目的基因表達時也會同時表達GFP，通過流式檢測GFP的含量就能間接的反應(yīng)目的基因的轉(zhuǎn)染效率以及表達強弱。當轉(zhuǎn)染效率不是很高的時候，可以借助流式分選的方法把GFP陽性的穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選出來。3.7.2GFP陽性穩(wěn)轉(zhuǎn)株分選GFP(greenfluo129分選前分選后VisibleMicroscopyFluorescenceMicroscopyFlowCytometry5%98%FCM分選GFP陽性的細胞分選前分選后VisibleMicroscopyFluore130SampleSorted2Sorted1FCM分選不同熒光強度的細胞SampleSorted2Sorted1FCM分選不同熒1313.7.3干細胞研究分選干細胞(stemcell)是一類具有自我更新能力的多潛能細胞，在一定條件下，可以分化成多種功能細胞。干細胞主要分為胚胎干細胞(embryonicstemcell,ESC)和成體干細胞(somaticstemcell)成體干細胞是能夠分化成特定組織和器官的細胞，如造血干細胞(骨髓、臍帶血干細胞)、間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、上皮干細胞等。本節(jié)主要介紹：造血干細胞間充質(zhì)干細胞腫瘤干細胞側(cè)群細胞3.7.3干細胞研究分選干細胞(stemcell)是一類132（一）

造血干細胞

造血干細胞(hematopoieticstemcell,HSC)是具有自我更新能力的并且能夠分化成所有血細胞和免疫細胞的細胞。（一）造血干細胞造血干細胞(hematopoietic133目前尚無任何方法可辨認出真正的HSC，借助細胞的免疫標志可以將人和動物的HSC縮小到一個較小范圍內(nèi)，甚至通過分選富集純化HSC用于各種基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。目前認為人的造血干細胞標志為Lin-CD34+CD38-。Lin包括CD3、CD19、CD20、CD16、CD56、CD14、CD11b和CD15。小鼠造血干細胞表型為Lin-Sca-1+c-kit(CD117)+。Lin包括CD3(T細胞)、B220(B細胞)、CD11b(單核巨噬)、Gr-1(粒細胞)和Ter119(紅細胞)。目前尚無任何方法可辨認出真正的HSC，借助細胞的免疫標志可以134從小鼠骨髓中分選出Lin-Sca-1+c-kit(CD117)+，是研究造血干細胞很好的模型。從小鼠骨髓中分選出Lin-Sca-1+c-kit(CD117135（二）

腫瘤干細胞分選腫瘤干細胞(cancerstemcell)假說：腫瘤組織是由異質(zhì)性的細胞群體組成，腫瘤組織中存在的一小部分具有干細胞性質(zhì)的腫瘤干細胞具有無限的自我更新能力，可以產(chǎn)生與上一代完全相同的子代細胞，并且具有多種分化潛能和高度增殖能力，產(chǎn)生不同表型的腫瘤細胞，并使腫瘤在體內(nèi)不斷擴大，或形成新的腫瘤。流式鑒定分選腫瘤干細胞方法：側(cè)群干細胞；根據(jù)表型標記鑒定。（二）腫瘤干細胞分選腫瘤干細胞(cancerstemc136腫瘤類型腫瘤干細胞的細胞表面標記白血病CD44+/CD38-乳腺癌CD44+/CD24-/low/Lineage-腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤CD133+/musashi-1+/nestin+肉瘤Stro-1+/CD105+/CD44+頭頸癌CD44+/BMI-1+肺癌Sca-1+/CD45-/PECAM-/CD34+肝癌CD133+黑素瘤CD20+胰腺癌CD44+/CD24+/ESA+前列腺癌CD44+/α2β1high/CD133+結(jié)腸癌EpCAMhigh/CD44+/CD166+,CD133+各種腫瘤干細胞表面標記腫瘤干細胞研究進展，饒冠華腫瘤類型腫瘤干細胞的細胞表面標記白血病CD44+/CD38-137FACSCellSorterSolidTumorSingleCellSuspensionCD24CD44Mince(smallpieces)SurgicalImplantationSublethallyirradiatedNOD/SCIDMiceBreastCancerStemCells:CD44+CD24lowLin-FACSCellSolidTumorSingleCe138（三）

側(cè)群細胞分選Hoechst

33342是一種DNA熒光染料，在紫外激發(fā)下可發(fā)出藍光(波長450nm左右)和紅色(波長650nm左右)兩種熒光。1996年，Goodell等用Hoechst33342染色小鼠骨髓細胞后，經(jīng)過流式檢測后發(fā)現(xiàn)在Hoechst-Blue/Hoechst-Red散點圖中，有一小群染色較低的細胞，只占骨髓細胞的0.1%左右，稱之為側(cè)群細胞(sidepopulation,SP細胞)。0.1%Lin-Sca-1+（三）側(cè)群細胞分選Hoechst33342是一種DNA熒139SP細胞廣泛分布于胚胎、成體組織以及腫瘤細胞系中，具有自我更新和多向分化潛能，因此代表了一種新的干細胞類型，SP特征可能作為干細胞功能性標記。目前，從白血病、乳腺癌、大腸癌等腫瘤細胞中都檢測出SP細胞，分選出這些腫瘤細胞的SP細胞都具有成瘤以及耐藥的特性，這些都提示這SP細胞可能就代表著腫瘤干細胞。主流觀點：不是所有的腫瘤細胞都會出現(xiàn)SP特征；SP細胞也不一定就是干細胞。SP細胞、干細胞和腫瘤干細胞SP細胞廣泛分布于胚胎、成體組織以及腫瘤細胞系中，具有自我更140SP產(chǎn)生的分子機制干細胞表面高表達ABC(ATPbindcassette)運輸?shù)鞍譈crp1/ABCG2，能將Hoechst333452泵出細胞外，所以SP細胞染色較低，而其他細胞沒有這種能力。轉(zhuǎn)運蛋白的抑制劑維拉帕米，能夠阻斷SP細胞將細胞內(nèi)的Hoechst33342泵出細胞外，可以作為SP檢測的對照組。HoechstRedHoechstBlue實驗組加Verapamil對照組SP細胞SP產(chǎn)生的分子機制干細胞表面高表達ABC(ATPbind141流式細胞術(shù)

---原理、操作及應(yīng)用流式細胞術(shù)

---原理、操作142主要內(nèi)容一、流式細胞儀結(jié)構(gòu)和原理流式細胞術(shù)簡介流式細胞儀的光信號檢測流式細胞儀的結(jié)構(gòu)組成熒光抗體的選擇流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析二、流式細胞術(shù)操作與技巧三、流式細胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用主要內(nèi)容一、流式細胞儀結(jié)構(gòu)和原理1431.1流式細胞術(shù)簡介流式細胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞(或生物學(xué)顆粒)的理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。流式細胞儀（FlowCytometer）是