酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)課件

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)

11/20/20221一、免疫檢測的基礎(chǔ)知識二、ELISA試驗(yàn)的原理三、ELISA試驗(yàn)的特點(diǎn)四、操作要領(lǐng)概要11/20/20222前言

免疫測定（immunoassay,IA）是應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)測定樣品的方法。在臨床診斷中主要通過抗原抗體反應(yīng)檢測體液中的抗原或抗體性物質(zhì)。在抗原或抗體上標(biāo)記乳膠、金屬顆粒、放射性同位素或酶，可以提高免疫測定的敏感性。11/20/20223一、免疫檢測的基礎(chǔ)知識（一）抗原（二）抗體（三）抗原抗體反應(yīng)

11/20/20225（一）抗原(AntigenAg)抗原是能在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？纱碳C(jī)體產(chǎn)生體液免疫（抗體）和引起細(xì)胞免疫（細(xì)胞因子）。能在機(jī)體中產(chǎn)生抗體的抗原多為分子量大于5000D的蛋白質(zhì)，例如禽流感、新城疫、豬瘟、口蹄疫等病毒。

11/20/20226（二）抗體（AntibodyAb）

抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM?？贵w的產(chǎn)生機(jī)體受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,含有抗體的血清稱為抗血清（antiserum）。

11/20/20227（三）抗原抗體反應(yīng)1、特異性結(jié)合并可逆抗原與抗體結(jié)構(gòu)可以形成特異性的抗原抗體復(fù)合物，此過程是可逆的。2、最適比例：前帶和后帶現(xiàn)象3、敏感性11/20/20228ESP樣品稀釋包被（抗原或抗體）酶標(biāo)復(fù)合物底物現(xiàn)色ELISA(間接)的操作步驟11/20/202210三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的特點(diǎn)

（一）靈敏度高（二）特異性強(qiáng)（三）簡便、快速（四）重復(fù)性好（五）自動化程度高，適合大批量標(biāo)準(zhǔn)化檢測（六）安全

11/20/202212其他1、酶標(biāo)比色儀2、洗板機(jī)11/20/202214嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室生物安全管理制度

嚴(yán)禁吸煙、吃東西和嬉戲打鬧！

移液器是精密儀器，請小心使用。實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)11/20/202215試劑盒組成1.已包被抗原的ELISA板兩塊（每個(gè)組用一塊板）2.洗滌液（25×）30mL3.陰性對照血清0.05mL4.陽性對照血清0.05mL5.血清稀釋液30mL6.酶標(biāo)記IgG(100×)0.1mL7.底物溶液A1mL8.底物溶液B 膠囊（2） 9.終止液 12mL11/20/2022161：20倍血清樣品稀釋方法：先取樣品稀釋液47.5ul加到酶標(biāo)孔中。然后取2.5ul待檢血清，加入樣品孔中混勻。11/20/202217操作步驟：（1）加入血清樣品：用血清稀釋液對陽性和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清做1：20稀釋，每孔加入50μL，陰、陽性標(biāo)準(zhǔn)血清各做兩孔；同時(shí)設(shè)兩孔不加任何血清樣品的空白對照孔。密封，37℃結(jié)合45分鐘。（注意：此時(shí)的槍頭不應(yīng)重復(fù)使用，否則將造成交叉污染）。（2）洗板：棄去孔內(nèi)液體，然后將25×洗滌液用滅菌水或超純水稀釋成1×工作液，每孔加入220-300μL洗板，重復(fù)4次，最后一次棄凈孔內(nèi)液體。（3）加入酶標(biāo)二抗：濃縮酶標(biāo)記抗體用血清稀釋液做1：100稀釋，每孔加入50μL，密封，37℃結(jié)合45分鐘。（注意：從加入第一孔時(shí)開始計(jì)時(shí)間）。（4）重復(fù)步驟（2）洗板。（5）加入底物：將底物A和B做1：50體積混勻，每孔加入50μL，輕輕震蕩混勻，密封，37℃或避光作用15分鐘。加樣的順序應(yīng)同步驟（3）保持一致，從加入第一孔時(shí)開始計(jì)時(shí)間。（6）終止反應(yīng)：每孔加入50μL終止液，輕搖混勻，測定吸光度OD450nm。11/20/202218注意事項(xiàng)?。?！

除洗滌緩沖液，其他試劑盒酶標(biāo)板應(yīng)取出在4℃條件下，使用前平衡至室溫。特別提醒?。?！底物溶液A在低溫下呈固態(tài)，所以實(shí)驗(yàn)一開始可將其放置在室溫。凍存的血清樣品，最好先在4℃環(huán)境中使其融化，如果需要測量不同的指標(biāo)，應(yīng)該避免反復(fù)凍融樣品，待測樣品出現(xiàn)溶血的情況時(shí)，可高速離心后再進(jìn)行試驗(yàn)，不影響結(jié)果。實(shí)驗(yàn)操作過程中，不要吸煙吃東西和交談。洗滌緩沖液和酶標(biāo)抗體現(xiàn)用現(xiàn)稀釋，否則工作濃度