《食品酶學》配套教學課件

食品酶學

(EnzymologyofFood)學習要求專業(yè)限選課教學理念課堂授課為基礎，調動自主學習積極性；強調學習方法和學科素質的提高；理論和實踐相結合?？记诘怯浛己嗽u價平時成績、專題討論、課程論文理論課(32學時)第一章緒論第二章糖酶第三章蛋白酶第四章酯酶第五章氧化還原酶第六章溶菌酶第七章酶工程《食品酶學》課程學習內容課程內容要求

了解酶學的發(fā)展歷史、現(xiàn)狀和前景掌握酶學的基礎理論和學習酶工程知識重點理解并掌握酶在食品生產、貯藏、加工、分析檢測中的應用技術

教材《食品酶學》主編：劉欣等中國輕工業(yè)出版社2005.12.第一版北京參考書郭勇，鄭穗平《酶在食品工業(yè)中的應用》中國輕工業(yè)出版社

1996.12彭志英《食品酶學導論》中國輕工業(yè)出版社2002.1.第一版何國慶《食品酶學》化學工業(yè)出版社

2006.5王金勝《酶工程》中國農業(yè)出版社

2007.8

王璋《食品酶學》中國輕工出版社1990.第一版2005.再版緒論1.1

食品酶學發(fā)展史1.2

食品酶學的定義、研究內容及酶制劑的來源1.3酶學基礎理論知識復習1.4酶在食品工業(yè)中的應用人們對酶的認識夏禹時代，釀酒技術周朝，制作飴糖和醬春秋戰(zhàn)國時期,用麴(曲)治療疾病酶者，酒母也酒母1.1

食品酶學的發(fā)展史酶巴斯德主張：發(fā)酵和活細胞有關，酒精發(fā)酵是酵母細胞生活的結果。巴斯德（1822-1895）微生物學的奠基人提出分子不對稱性理論，開創(chuàng)了立體化學研究的途徑。創(chuàng)立了發(fā)酵的生物學理論，低溫消毒技術（巴氏殺菌）免疫學--預防接種，研制出狂犬疫苗李比希認為：發(fā)酵及其他類似過程，是由于化學物質的作用，純粹是化學過程。從1901年到1910年最早的十次諾貝爾化學獎獲得者中，李比希的學生就有七位。李比希(1803—1873)德國化學家化學教育改革家有機化學創(chuàng)始人農業(yè)化學之父關于發(fā)酵本質的長期論戰(zhàn)1897年，布希納兩兄弟從酵母細胞分離出具有發(fā)酵作用的物質，能使糖發(fā)酵。他們得到的結果:酵母汁液迅速將蔗糖發(fā)酵產生了酒精。說明巴斯德和李比希的兩種觀點實質上是一致的。酶就是在解決發(fā)酵本質的著名論戰(zhàn)中產生的。說明了發(fā)酵是酶作用的化學本質，獲得了1911年諾貝爾化學獎。HansBuchner（1850-1902）德國細菌學家EduardBuchner(1860-1917)19世紀以來

酶學史上的重大研究進展1.1833年，Payen和Persoz發(fā)現(xiàn)了第一個酶取名淀粉酶（Diastase）2.1835年，Berzelius提出了酶是催化劑的概念3.1878年德國Kuhne提出使用“酶”（Enzyme）這一概念4.1894年，德國EmilFischer發(fā)展了酶的特異性（即專一性）概念5.1913年,Michaelis和Menten提出了酶促動力學原理——米氏學說6.1926年Sumner首次從刀豆中提取出脲酶結晶，并證明是一種蛋白質，1946年獲諾貝爾獎Crystalsofpyruvatekinase,anenzymeoftheglycolyticpathway.Theproteininacrystalisgenerallycharacterizedbyahighdegreeofpurityandstructuralhomogeneity7.1941年，Beadle和Tatum提出“一個基因一個酶”8.1953年，Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結構模型，獲諾貝爾獎9.1963年，測出了第一個酶（牛胰RNA酶A）的一級結構；10.1965年，闡明了第一個酶（雞卵清溶菌酶）的三維結構；11.1969年，人工化學合成了第一個酶（核糖核酸酶）酶的應用歷史

——走向商業(yè)生產1891年，日本人高峰讓吉開始了真菌淀粉酶的生產1908年，德國的羅門制得胰酶用于皮革的軟化1914年，羅門將酶用于洗滌劑中1911年，美國Wallestein制得木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白質渾濁1917年，法國Boidin制備了枯草桿菌淀粉酶應用于紡織品的退漿。酶的生產和應用逐步發(fā)展但難以進行大規(guī)模工業(yè)化生產1949年,用液體深層培養(yǎng)法進行細菌淀粉酶的發(fā)酵生產,開啟近代酶工業(yè)時代。50年代以后,大多數酶制劑的生產已轉向微生物深層發(fā)酵的方法。50年代，開始了酶固定化研究。1953年德國科學家首先將聚氨基苯乙烯樹脂與淀粉酶,胃蛋白酶,羧肽酶和核糖核酸酶等結合,制成了固定化酶。60年代，固定化酶技術迅速發(fā)展1969年,日本的千畑一郎首次在工業(yè)上應用固定化氨基酰化酶從DL-氨基酸生產L-氨基酸。出現(xiàn)了“酶工程”學科領域。1971年第一屆國際酶工程學術會議召開,主題是固定化酶。1973年，千畑一郎首次利用固定化的大腸桿菌細胞生產L-天冬氨酸。1978年，日本的鈴木等固定化細胞生產α-淀粉酶80年代又發(fā)展了固定化原生質體技術酶固定化技術的發(fā)展也引起了食品、發(fā)酵工業(yè)一場大變革。美國在20世紀70年代初開始采用這一新技術，使玉米淀粉經酶法液化、糖化、異構化和固定化后，成功地工業(yè)化生產第一代、第二代和第三代高果糖漿，代替蔗糖作為可口可樂和百事可樂等飲料食品的甜味劑，提高了飲料質量。酶分子修飾技術60年代，用小分子化合物修飾酶分子側鏈基團,使酶性質發(fā)生改變。70年代,修飾劑的選用、修飾方法上又有了新的發(fā)展。此外,對突變酶、克隆酶、抗體酶、人工酶、模擬酶等方面,以及酶的生產和應用技術研究，取得了較大進展酶工程不斷向廣度和深度發(fā)展,顯示出廣闊而誘人的前景。目前在自然界中鑒定的酶超過4000種生產的酶制劑有100多種其中有經濟價值的有60多種工業(yè)化生產的酶制劑僅20多種，占0.8%左右。在酶制劑的總產量中，55%是水解酶，主要用于焙烤、食品、釀酒、淀粉加工、酒精等工業(yè)、紡織。其中35%是蛋白酶，主要用于食品、洗滌劑、動植物蛋白、制革、乳品行業(yè)。集中壟斷，市場全球化規(guī)模企業(yè)由20世紀80年代初的80多家減少至20多家，占市場90%丹麥諾和諾得公司（諾維信novozymes）→1978年進入中國諾維信公司，占50%市場（天津）；美國杰能科公司（Genencor）→98年進入中國，與無錫合資，控股80%（無錫），兩家公司銷售額占全球2/3；（2005年杰能科國際公司被丹尼斯克公司收購）；公司網站：芬蘭科特公司和丹麥丹尼斯克公司酶制劑業(yè)務合并，Pfizer，Rhone，SKW,Biosystems，

日本天野酶制品株式會社

品種、規(guī)模不斷擴大我國2015年酶制劑產量為100萬噸，100家，市場份額僅占5%。國內糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大類占了97%，配制不合理。重要產品普魯蘭酶、真菌淀粉酶、系列果膠酶、低溫堿性蛋白酶，國內尚未投入生產;我國有7家上市公司介入酶制劑開發(fā)生產。東莞泛亞太生物科技有限公司

廣州博仕奧集團應用領域不斷擴大1998年全世界工業(yè)酶制劑銷售額高達16億美元，世界市場酶制劑的銷售量大約以7～8%的速度增長，2010年，銷售額達到40億美元，2015年，銷售額達到50億美元。范圍已遍及工業(yè)、醫(yī)藥、農業(yè)、化學分析、環(huán)境保護、能源開發(fā)和生命科學理論研究等各個方面。國際市場酶制劑銷售額比例

1.2食品酶學的定義、研究內容及酶制劑的來源酶（enzyme）的定義專一性催化功能生物大分子蛋白質（P-酶）核酸（R-酶）食品酶學（EnzymologyofFood）研究食品中的酶對食品的影響，研究酶在食品的應用的學科。食品酶學研究內容是以普通酶學為基礎，重點研究可應用在食品中的新酶源，研究酶在食品生產、加工及保藏中的應用，研究酶法制造新型食品及食品添加劑，研究酶與食品質量的監(jiān)控及安全衛(wèi)生等內容。食品工業(yè)用酶的來源動物、植物和微生物早期，大多數的酶是從動物或植物原料中提取的例如從動物的胰臟、胃等組織，從植物中的木瓜、菠蘿等中提取各種酶。動物和植物生長周期長，成本高，又受地理、氣候、季節(jié)等因素的影響不適宜于大規(guī)模生產工業(yè)用酶的微生物發(fā)酵法生產微生物生產酶的優(yōu)點產酶的微生物多，一種微生物可產生多種酶；微生物繁殖快、生產周期短、產量高、成本低，便于大規(guī)模生產；便于選育菌株和改良發(fā)酵條件，易于提高產率等?，F(xiàn)代酶技術的發(fā)展食品酶制劑的要求粗酶制劑、復合酶制劑毒性（食品級酶制劑通用質量標準）食品用酶的常用類型?-淀粉酶[EC]?-淀粉酶[EC]葡萄糖淀粉酶[EC]花青素酶纖維二糖酶[EC1]纖維素酶[EC]葡萄糖酶[EC1]?-葡萄糖苷酶[EC2]?-葡萄糖苷酶[EC3]?-葡聚糖酶[EC]半纖維素酶[EC8][EC5][EC2]菊糖酶支鏈淀粉酶[EC]木聚糖酶[EC2]果膠酶[EC5]三酰甘油水解酶[EC]脂肪酸酯酶[EC]柚苷酶[EC0]胰凝乳蛋白酶[EC]胰蛋白酶[EC]枯草桿菌蛋白酶[EC4]木瓜蛋白酶[EC]無花果蛋白酶[EC]菠蘿蛋白酶[EC]胃蛋白酶[EC]凝乳酶[EC]單寧酶[EC0]溶菌酶[EC]蛋白酶[EC][EC]雙乙酰還原酶過氧化氫酶[EC]葡萄糖氧化酶[EC]果糖轉移酶?-葡萄糖基轉移酶葡萄糖異構酶[EC]1.3酶的基礎知識復習酶的本質酶的分類和命名酶的催化特性酶催化反應具有高效性

酶催化反應對底物高度的專一性酶的組成和結構酶的活性中心的本質酶的作用機制影響酶促反應的因素酶活力酶的數字編號系統(tǒng)系統(tǒng)酶的數字編號系統(tǒng)系統(tǒng)根據酶所催化反應的類型將酶分為6大類，并以4個阿拉伯數字來對每一種酶進行編號。例如乙醇脫氫酶，編號為EC。EC是指酶學委員會（EnzymeCommission）。第一個數字代表酶的6個大分類，以1，2，3，4，5，6來分別代表如下6大酶類：（1）氧化還原酶（Oxidoreductases）催化氧化還原反應；（2）轉移酶（Transferases）催化分子間基團轉移的反應；（3）水解酶（Hydrolases）催化水解反應；（4）裂合酶（Lyases）催化非水解地除去底物分子中的基團及其逆反應；（5）異構酶（Isomerases）催化分子的異構反應；（6）連接酶（Ligases）（也稱為合成酶）催化兩分子連接的反應，反應中酶與ATP的一個焦磷酸鍵相偶聯(lián)。

命名通俗名常用，EC碼識別習慣命名法（如：蛋白酶；水解酶；乳酸脫氫酶；木瓜蛋白酶）國際系統(tǒng)命名法（L-乳酸：NAD+氧化還原酶；E.C.7）EC代碼系統(tǒng)命名通俗名稱葡萄糖：O2氧化還原酶葡萄糖氧化還原酶聯(lián)苯酚：O2氧化還原酶：多酚氧化酶（兒茶酚氧化酶）抗壞血酸：O2氧化還原酶抗壞血酸氧化酶H2O2：O2氧化還原酶過氧化氫酶1果膠酰水解酶果膠酯酶葡聚糖：葡聚糖水解酶α-淀粉酶葡聚糖：麥芽糖水解酶β-淀粉酶葡聚糖：葡萄糖水解酶葡萄糖淀粉酶葡聚糖：葡聚糖水解酶纖維素酶5聚半乳糖醛酸：葡聚糖水解酶聚半乳糖醛酸酶6呋喃果糖苷：果糖水解酶轉化酶木瓜蛋白酶木糖：醇酮異構酶木糖異構酶葡萄糖磷酸酯：醇酮異構酶葡萄糖磷酸異構酶影響酶促反應的因素

底物濃度米氏方程：底物濃度和反應速度之間的定量關系米氏常數：當反應速度等于最大反應速度一半時的底物濃度，單位：mol/L。酶濃度底物/濃度pH值溫度激活劑抑制劑1.4食品酶學對食品科學的重要性1.4.1酶對食品加工和保藏的重要性（1）控制動植物原料中的酶（2）利用酶的催化活性進行生產（1）控制動植物原料中的酶動植物和微生物生長發(fā)育的過程中，伴隨著許多重要的酶催化反應的發(fā)生和作用。植物采摘或動物屠宰后，體內的酶催化作用仍然在繼續(xù)進行，直至酶系的底物耗盡或pH不再適合反應進行時才終止。利用酶的性質，人們可以通過控制食品原料中的酶活力有效改善食品原料的風味和質地結構?？刂品椒刂泼富盍Φ姆椒ǎ簾崽幚矸?、冷凍法、調pH和化學方法荔枝的儲藏保鮮（2）利用酶的催化活性酶是生物催化劑首先，它不會有有害殘留物質；其次，酶有高度的專一性和高效性，酶制劑用量小，經濟合算；第三，酶催化反應條件溫和，食品營養(yǎng)成分損失少，易于操作且能耗較低。因此，酶制劑在食品工業(yè)中的應用開始得很早，且成效顯著，研究也相當活躍。例葡萄糖氧化酶應用于食品保鮮及包裝中，延長食品保質期。作為除氧劑溶菌酶能夠水解細菌細胞壁肽聚糖的β-1，4糖苷鍵，導致細菌自溶死亡，并且溶菌酶在食鹽、蔗糖等溶液中穩(wěn)定，耐酸耐熱性強，因此非常適宜用于各種食品的防腐。溶菌酶是天然安全的食品防腐劑1.4.2酶對食品安全的重要性酶作用會使食品品質特性發(fā)生改變，甚至會產生毒素和其他有害物質。有時本身無毒的底物會在酶催化降解下轉變成有害物質。例如，木薯含有生氰糖苷，但是在內源糖苷酶的作用下，產生氫氰酸。十字花科植物的種子以及皮和根含有葡萄糖芥苷，在芥苷酶作用下會產生對人和動物體有害的甲狀腺腫素。也可以利用酶的作用去除食品中的毒素例如，利用乳糖酶預先處理乳制品，可以有效緩解或消除人體因消化乳糖困難而引起的胃脹氣、腹痛、嘔吐或拉肚子等癥狀。α-葡萄糖基轉移酶用于甜葉菊加工，可以脫苦澀味黃曲霉毒素B1經黃曲霉毒素脫毒酶處理后毒性、致畸性將極大降低。酶法解毒是一種安全、高效的解毒方法，對食品無污染、有高度的選擇性，且不影響食品的營養(yǎng)物質。酶制劑工業(yè)迅速發(fā)展，人們已經能夠通過基因工程手段改造部分微生物基因，從而改變酶蛋白的基本結構，達到強化酶在某方面功能特性的目的。然而，這也給食品酶的應用帶來很大的安全隱患。作為微生物來源的食品酶制劑，通常除了包括酶蛋白本身以外，還含有微生物的代謝產物，以及添加的保存劑和穩(wěn)定劑。將加入食品中的酶看作為食品添加劑，就應該考慮到衛(wèi)生和安全問題。1.4.3酶對食品營養(yǎng)的重要性酶作用有可能導致食品中營養(yǎng)組分的損失例如，脂肪氧合酶催化胡蘿卜素降解使面粉漂白，在其他食品如一些蔬菜的加工過程中脂肪氧合酶也參與了胡蘿卜素的破壞過程。食品加工過程中，酶也參與了維生素B的破壞例如，在一些用發(fā)酵方法加工的魚制品中，由于魚和細菌中的硫胺素酶的作用，使這些食品缺少維生素B。抗壞血酸是最不穩(wěn)定的維生素，在食品加工和保藏中，Vc常由于酶或非酶的因素而被氧化。利用酶作用去除食品中的抗營養(yǎng)素，提高食品的營養(yǎng)價值例如，由于植酸以鈣、鎂、和鉀鹽的形式存在于豆類和谷類中，易于同膳食中的鐵、鋅和其他金屬離子形成難溶的絡合物，植酸還能同蛋白質形成穩(wěn)定的復合物，從而降低豆類蛋白質的生理價值。植酸酶能催化植酸水解成磷酸和肌醇。動物飼料添加植酸酶近幾年植酸酶還用于釀造，以改善原料中磷的利用，以及用于去鉀大豆蛋白食物的生產，成為腎臟病人蛋白質的來源。1.4.4酶對食品分析的重要性酶法分析特點具有準確、快速、專一性和靈敏性強等酶的催化專一性強當待測樣品中含有結構和性質與待測物十分相似（如同分異構體）的共存物時，要發(fā)現(xiàn)待測物特性或要分離純化待測物往往十分困難。而利用僅作用于待測物的酶，不需要分離就能辯識待測組分，即可對待測物質進行定性和定量分析。酶法分析的樣品一般不需要進行很復雜的預處理，尤其適合食品這一復雜體系。催化的高效性酶法分析的分析速度大多比較快目前酶在食品分析中的應用涉及食品組分的酶法測定、食品質量的酶法評價及食品衛(wèi)生與安全檢測等多個方面。近年來，食品酶法分析由于其的方便快捷和技術的不斷發(fā)展進步，已逐漸成為食品分析檢測中的一個重要分支和一種非常有效的分析手段。1.4.5酶與食品生物技術食品生物技術是生物技術的重要分支學科，主要研究基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程在食品工業(yè)上的應用。酶工程的主要研究內容是酶的生產和應用。酶不僅作為一類重要的研究對象，同時也作為重要的研究工具。例如以內切酶和連接酶作為工具酶將外源DNA或目的基因連接到載體上，獲得DNA重組體，以欲改造的動植物作為受體，使重組DNA進入受體細胞，實現(xiàn)外源DNA的轉化，從而生產出具有特定優(yōu)良性狀的轉基因食品。緒論結語食品酶學是食品科學中的一門重要專業(yè)課食品酶學與食品貯藏加工、生物工程、新資源利用、食品質量安全、食品營養(yǎng)等密切相關。學習食品酶學除了要充分利用課堂講授還需要廣泛利用課外的資訊。除了要掌握專業(yè)知識還要提高專業(yè)綜合技能?！笆谥隰~不如授之于漁”糖酶（Carbohydrases)應用淀粉食品加工糖工業(yè)發(fā)酵工業(yè)果蔬加工糖酶的作用(1)水解：大分子多糖——小分子寡糖或單糖；(2)轉糖苷作用：催化糖單位結構上的重排——產生新糖類化合物(3)作用于酯化的糖類常見糖酶的種類淀粉酶乳糖酶纖維素酶果膠酶淀粉酶催化淀粉、糖原和糊精中糖苷鍵水解的一類酶，屬水解酶類。包括：-淀粉酶、-淀粉酶、脫支酶、異構酶、葡萄糖淀粉酶、環(huán)狀糊精葡萄糖基轉移酶

由D-葡萄糖以-1,4和-1,6糖苷鍵連接的高分子物質。淀粉不同淀粉酶的水解方式-淀粉酶

—淀粉酶

葡萄糖淀粉酶

脫支酶

最終產物是

。小糊精選擇填空：小糊精

-葡萄糖和極限糊精

直鏈淀粉葡萄糖

-淀粉酶

—淀粉酶

葡萄糖淀粉酶

脫支酶

最終產物是

。-葡萄糖和極限糊精選擇填空：小糊精

-葡萄糖和極限糊精

直鏈淀粉葡萄糖

-淀粉酶

—淀粉酶

葡萄糖淀粉酶

脫支酶

最終產物是

。葡萄糖選擇填空：小糊精

-葡萄糖和極限糊精

直鏈淀粉葡萄糖

-淀粉酶

—淀粉酶

葡萄糖淀粉酶

脫支酶

最終產物是

。直鏈淀粉選擇填空：小糊精

-葡萄糖和極限糊精

直鏈淀粉葡萄糖

-淀粉酶的性質

（-Amylase）命名：-1,4葡聚糖-4-葡聚糖水解酶

EC，也稱為液化酶。分布：植物：如玉米、稻米、高粱、谷子哺乳類動物：如人及動物唾液、胰液微生物：枯草桿菌、芽孢桿菌、吸水鏈霉菌、米曲霉、黑曲霉等性質分子量：約5萬金屬酶：屬于金屬酶，每個酶分子中含有一個Ca2+，其與酶分子結合非常牢固。激活劑和穩(wěn)定劑(3)pH對-淀粉酶的影響一般在pH5.5～8時穩(wěn)定，pH4以下容易失活，酶的最適pH值為pH5～6。不同來源的α-淀粉酶具有不同的pH特性酶的最適pH與pH穩(wěn)定性

α-淀粉酶最適pH值：黑曲酶為4.0；高梁芽4.8，小麥4.5左右從人的唾液和豬的胰臟的較窄6.0～7.0枯草桿菌得到的具有較寬廣pH5.0～7.0嗜熱脂肪芽孢桿菌的狹窄3.0左右大麥芽4.8～5.4（4）溫度對-淀粉酶活力的影響α-淀粉酶在40℃時活力最高，50℃以上容易失活，一些細菌來源α-淀粉酶的最適溫度為70℃。不同來源的α-淀粉酶具有不同的熱穩(wěn)定性和最適溫度。如果以每分鐘升高1.5℃的速度加熱α-淀粉酶粗制劑的溶液，那么在溫度達到80℃時，幾種α-淀粉酶的百分殘余活力如下：霉菌1％，谷類25％，而細菌92％。耐熱α-淀粉酶地衣形芽孢桿菌α-淀粉酶的最適溫度為

℃，而淀粉液化芽袍桿菌α-淀粉酶的最適溫度為

℃。9270溫度對酶的半衰期的影響溫度對α-淀粉酶半衰期的影響底物：31.5％玉米淀粉，pH6.5鈣離子濃度

-淀粉酶的性質

（-1，4-葡聚糖麥芽糖水解酶

EC-Amylase)來源：高等植物：如小麥大麥芽、甘薯和大豆。微生物：如多黏芽孢桿菌等。

哺乳動物無

通常是從大豆提取蛋白質后由廢水中提取或從蒜苗制取淀粉的廢水中得到的。麩皮、大麥、麥芽也是生產β-淀粉酶的原料。微生物也是重要的原料。

-淀粉酶性質（1）pH對-淀粉酶活力影響植物：最適pH5.0~6.0范圍5.0～8.0微生物：最適pH6.0~7.0范圍4.0～9.0（2）溫度對β-淀粉酶活力的影響最適溫度40~60℃不同來源的酶不同，微生物來源的耐熱性優(yōu)于植物來源的。大豆的在最適pH5.5時。65℃水解30min損失50％，70℃水解30min可使酶完全失活。同樣條件下，山芋粗酶在60~65℃時不失活。大麥中的β-淀粉酶的熱穩(wěn)定性低于α-淀粉酶。一、酶活力二、酶活力單位1.國際酶活性單位在最適條件下（溫度可采用25℃或其它選用的溫度，pH等條件均采用最適條件），每1min催化1μmol的底物轉化為產物的酶量定義為1個酶活力單位（IU）。

2.實用單位在實際中往往對不同的酶使用不同的酶活單位

ɑ-淀粉酶活力單位定義為:在60℃pH6.2條件下,每小時可催化1g淀粉所需要的酶量為一個單位（U).

直接以光密度值表示：單位時間增加或減少0.001個光密度值為一個酶活單位（U)；例如溶菌酶、過氧化物酶

DNA聚合酶Ⅰ以在特定反應條件下，30分鐘內催化10nmoldNTP合成為三氯乙酸不溶物所需的酶量（U)；

T4DNA連接酶活力單位定義為：在20μl反應體積中，16℃，30分鐘內，將50%的HindⅢ酶切的λDNA片段重新連接起來所需的酶量（U)。三、酶活力測定方法

終止反應法（Stoppedmethod）

連續(xù)反應法（Continuousmethod）

終止反應法將酶反應按時即刻完全停止，再確定產物的生成量或反應物的消耗量，算出酶活性?？梢圆捎糜妹阜z測、化學檢測、放射化學檢測、光學檢測、氣體檢測等生化檢測技術。比色(光吸收)、滴定、氣體體積度量等常用的終止酶反應的方法：①反應時間一到，立即取出適當反應液，置于沸水浴中，加熱使酶失活；②加入適宜的酶變性劑，如三氯醋酸（TCA）等，使酶變性失活；③加入酸或堿溶液，使反應液的pH值迅速遠離催化反應的最適pH值而使反應終止；④將取出的反應液立即置于低溫冰箱、冰粒堆或冰鹽溶液中，使反應液的溫度迅速降低至10℃以下而終止反應。

連續(xù)測定法基于反應過程中用儀器連續(xù)測定產物的生成量或底物的減少量（動力學法），算出酶活力。光譜吸收、電位、酸堿度、黏度、氣體體積、熱量的變更等直接測定法間接測定法酶偶聯(lián)測定法酶法檢測用其它純酶將產物直接或間接轉變成為分光光譜儀或熒光光譜儀測出的化合物。偶聯(lián)法（coupledmethod）;

指示酶（Indicatorenzyme）e.g.葡萄糖氧化酶活力

葡萄糖氧化酶葡萄糖葡萄糖內脂+H2O2過氧化物酶（純品）和木酚

過氧化物酶H2O2+木酚4-甲氧聯(lián)酚

測A436nm4-甲氧聯(lián)酚的量H2O2的生成量

酶活力（葡萄糖氧化酶活力）四、酶活力測定的條件與注意的問題1.反應時間應選擇在酶反應的初速度范圍內通常以底物濃度的變化在起始濃度的5%以內的速度為初速度的近似值2.酶量必須和測得的活性有線性關系3.底物酶催化的專一性選擇合適的底物和底物濃度。底物濃度應該大于5Km；一定濃度的底物溶液；均勻一致；達到酶反應所要求純度使用的底物溶液；一般要求新鮮配制；預先配制后置于冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

4.反應條件確定酶催化反應的溫度、pH值、底物濃度和激活劑濃度等反應條件

溫度盡量保持恒定不變：反應應該在恒溫水浴槽中進行pH值必須采用一定濃度和一定pH值的緩沖溶液有些要求添加一定濃度的激活劑e.g.淀粉酶需要鈣離子；

注意問題1.一定條件2.混合均勻3.準確計時4.設置對照

實驗剖析淀粉酶活性的測定α-淀粉酶80℃保溫20min不耐酸在pH值3.6鈍化β-淀粉酶不耐熱，在高溫下易鈍化將提取液加熱到70℃保溫15min以鈍化β-淀粉酶，便可測定α-淀粉酶的活性；或者將提取液用pH3.6的醋酸溶液在0℃下加以處理，鈍化α-淀粉酶，以求出β-淀粉酶的活性。

淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用3，5-二硝基水楊酸試劑測定。由于麥芽糖能將黃色的3，5-二硝基水楊酸還原成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定范圍內其顏色的深淺與還原糖的濃度成正比，以標準麥芽糖做標準曲線，可求出麥芽糖的含量。以每克樣品在單位時間內生成麥芽糖的毫克數表示淀粉酶活性的大小。α-淀粉酶活性的測定（1）取4支試管編號，注明其中兩支為對照管，兩支為測定管。（2）于每管中各加酶液1mL，在70℃±0.5℃恒溫水浴中加熱15min，β-淀粉酶因受熱而鈍化，取出后迅速冷卻。（3）向對照管中加入4mL0.4mol/LNaOH，以使酶失活。（4）在4支試管中各加入lmLpH5.6檸檬酸緩沖液。（5）將4支試管另置于40℃±0.5℃恒溫水浴中保溫15min，再向各管分別加入40℃下預熱的1％淀粉溶液2mL，搖勻后立即放入40℃水浴中準確保溫5min后取出，向各測定管迅速加入4mL0.4mol/LNaOH溶液，終止酶活性。α+β-淀粉酶活性的測定取4支試管編號，其中2支為對照，2支為測定管，各加入稀釋酶液1mL及1mL的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。以下重復α-淀粉酶測定的第(3)～(5)的操作。

β-淀粉酶活性的測定

α-淀粉酶活性[麥芽糖(mg)／鮮重(g)·5min]=(A)×樣品稀釋總體積────────────樣品鮮重(g)×V

（α+β）-淀粉酶總活性[麥芽糖(mg)／鮮重(g)·5min]=(B)×樣品稀釋總體積───────────樣品鮮重(g)×V酶活單位的定義(以每克樣品在單位時間內生成麥芽糖的毫克數表示淀粉酶活性的大小。)U延伸如何測定酶活力？測定酶活力應注意什么問題？測定酶活力在實際中的應用淀粉酶在淀粉糖生產中的應用產品種類葡萄糖麥芽糖果糖低聚糖高果糖漿醫(yī)藥、食品、發(fā)酵行業(yè)自用糖（抗生素、味精、氨基酸等原料用糖）α-淀粉酶在淀粉糖生產上的應用酶法生產葡萄糖的優(yōu)點糖化液沒有苦味、葡萄糖純度高、提高淀粉投料濃度、葡萄糖收率高雙酶法的基本工藝淀粉調漿液化糖化脫色過濾離子交換真空濃縮結晶分離真空干燥葡萄糖產品液化機理糊化液化淀粉(晶體)結構加熱吸水膨脹鏈間交錯形成相互聯(lián)系的網狀結構外膜破裂解體粘稠狀液體體積增加50-100倍糊化液體-淀粉酶直鏈淀粉水解成低聚糖、少量麥芽糖和葡萄糖。支鏈淀粉-1,4鍵被任意分解，但-1,6鍵不被分解。(1)液化液化方法升溫液化：

原料淀粉濃度：30%~40%

pH值：6.0~6.5加入：-淀粉酶、CaCl2、NaCl升溫到：85~90℃保溫：45min

采用噴射器,蒸汽和調配好的淀粉漿從不同的入口進入,利用蒸汽把形成薄層的淀粉乳瞬間上升到指定的溫度,使之糊化、液化。噴射后再進入保溫維持罐內維持一定時間噴射嘴溫度：105~110℃，保溫維持缸溫：95~97℃，維持時間：1h左右。噴射液化地衣芽孢菌產酶能在110℃以上利用?。√腔瘷C理淀粉產物糖化酶水解葡萄糖方法糊精糖化酶60℃保溫40~48h糖化液DE97%左右升溫80℃以上,滅酶。（2）糖化冷卻55~60℃,調pH4.5~5.0酶法制糖

酶法制味精酶法生產啤酒、酒精、白酒、黃酒酶法生產檸檬酸、抗生素、酶制劑淀粉葡萄糖麥芽糖低聚糖其他用途葡萄糖異構酶作用：催化D-木糖、D-葡萄糖和D-核糖等醛糖可逆地轉化為相應的酮糖。葡萄糖(醛糖）異構酶

果糖（酮糖）非水解酶葡萄糖氧化酶果葡糖漿淀粉葡萄糖混合糖漿42%果糖果糖52%葡萄糖葡萄糖70%~90%果糖6%低聚糖液化糖化酶異構酶脫色精制濃縮分離異構酶果葡糖漿高果糖漿（HFCS)

目前世界上淀粉糖的產量已達1000多萬噸。其中一半是果葡糖漿經典問題以支鏈淀粉（或玉米淀粉）為原料，制造果葡糖漿，需要哪些酶參加催化反應？知識拓展-淀粉酶在真假蜂蜜鑒別的應用

乳糖酶（lactase)-半乳糖苷酶（-galatosidase)作用催化乳糖水解為半乳糖和葡萄糖性質

溫度：來源不同而不同26~50℃最適pH：來源不同而不同如酵母6.0,霉菌5.0,細菌7.0鐵、鈣離子有抑制作用硫化物或亞硫酸鹽有激活作用應用1、低乳糖奶的生產

乳糖溶解度低，20℃15%溶解，甜度低，以蔗糖100，則乳糖16，牛奶中乳糖占固形物30%。乳糖不能直接被小腸吸，產酸產氣，引起腹瀉。生活在亞洲一些地區(qū)的居民，由于體內缺乏乳糖酶而不能代謝乳糖，對牛奶有過敏性反應，乳糖不耐受癥。

A、分離除去乳糖低乳糖奶B、加乳糖酶乳糖乳糖酶葡萄糖+半乳糖低乳糖奶低乳糖奶粉低乳糖咖啡奶、可可奶、果味奶等

生產方法煉乳、冰淇淋等乳制品，由于溫度變化，常常有乳糖結晶析出，呈顆粒狀結構，乳糖結晶析出，會促使酪蛋白凝聚，不合食用。

水解25~30%乳糖水解可防止?jié)饪s甜煉乳中其他糖的結晶。30~40%乳糖水解可防止砂樣結晶和蛋白質的絮凝。

50%乳糖水解，在冰箱中保存4個月，乳糖也不結晶。方法：乳糖酶先分解脫脂牛奶，再制造冰淇淋。直接將乳糖酶加到冰淇淋配料中。2、冰淇淋和冷凍濃縮牛奶的生產（1）促進微生物的生產，某些微生物不能利用乳糖作碳源，水解后，可利用葡萄糖作碳源；（2）縮短酸奶的轉化時間15~20%（3）縮短鮮奶酪轉化時間，形成的凝膠強度高，產率提高10%。3、發(fā)酵乳制品4、用于乳清的精深加工5、用于半乳果葡糖漿的生產6、在焙烤工業(yè)的應用果膠酶果膠質概念由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1,4糖苷鍵聚合而成的多糖鏈。常帶有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等組成的側鏈。游離的羧基部分或全部與鈣、鉀、鈉離子，特別是與硼化合物結合在一起。沉積于植物初生細胞壁和細胞間層與纖維素、半纖維素、木質素的微纖絲以及某些蛋白相互交聯(lián)使細胞組織結構堅硬，表現(xiàn)出固有的形態(tài)。果膠

結構果膠類物質給食品加工工業(yè)中帶來的難題任何植物（水果蔬菜）都存在果膠果蔬的加工、儲藏、運輸榨汁中粘度大、汁得率低，過濾難。進入飲料中造成混濁沉淀、透光率不高番茄果膠酶是分解果膠物質的多種酶的總稱作用催化果膠質分解來源催化果膠解聚的酶催化果膠分子的酯水解的酶水解酶(EC3.)裂解酶(EC4.)聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(PMGL)聚半乳糖醛酸酶（PG)聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)果膠酯酶（PE）果膠酶分類1聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）水解果膠分子中的1,4-糖苷鍵，從而使果膠的粘度下降。

內切PMG：使果膠粘度下降明顯；

外切PMG：使果膠粘度下降不明顯。聚甲基半乳糖醛酸酶聚半乳糖醛酸酶聚甲基半乳糖醛酸裂解酶聚半乳糖醛酸裂解酶果膠酯酶CH3CH3寡聚甲基半乳糖醛酸D-甲基半乳糖醛酸或二聚甲基半乳糖醛酸聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）2聚半乳糖醛酸裂解酶（PGL）切斷果膠酸分子內部的1,4-糖苷鍵，生成具有不飽和鍵的相對分子質量較小的聚半乳糖醛酸，粘度迅速下降。

聚甲基半乳糖醛酸酶聚半乳糖醛酸酶聚甲基半乳糖醛酸裂解酶聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)果膠酯酶（PE）CH3CH3寡聚具不飽和鍵的甲基半乳糖醛酸具不飽和鍵的甲基半乳糖醛酸，聚甲基半乳糖醛酸裂解酶果膠裂解酶內切PGL具不飽和鍵隨機切斷-1,4鍵生成分子量較小的聚半乳糖醛酸，粘度迅速下降。外切PGL切斷還原性未端-1,4鍵具不飽和鍵的半乳糖醛酸，還原性增強，但粘度下降不明顯。果膠分子中的甲酯PE果膠酸+甲醇3果膠酯酶（PEEC:1)果膠酯酶促使果膠脫酯，生成果膠酸聚甲基半乳糖醛酸酶聚半乳糖醛酸酶聚甲基半乳糖醛酸裂解酶聚半乳糖醛酸裂解酶果膠酯酶（PE）CH3CH3果膠酸＋甲醇果膠酯酶（PE）內切酶（EC5）隨機水解內部糖苷鍵，生成分子量相對較小的寡聚半乳糖醛酸。外切酶（EC7)從非還原性末端開始，逐個或逐二個水解1,4-糖苷鍵，生成D-半乳糖醛酸或二聚半乳糖醛酸。4聚半乳糖醛酸酶（PG）水解果膠酸和其他聚半乳糖醛酸分子中的糖苷鍵。聚甲基半乳糖醛酸酶聚半乳糖醛酸酶聚甲基半乳糖醛酸裂解酶聚半乳糖醛酸裂解酶果膠酯酶（PE）H寡聚半乳糖醛酸D-半乳糖醛酸或二聚甲基半乳糖醛酸聚半乳糖醛酸酶(PG)H5聚甲基半乳糖醛酸裂解酶（PMGL）果膠內切-PMGL隨機切斷-1,4糖苷鍵分子量較小的聚甲基半乳糖醛酸，粘度下降；外切-PMGL從末端逐次水解-1,4糖苷鍵具不飽和鍵的甲基半乳糖醛酸，粘度下降不明顯。聚甲基半乳糖醛酸酶聚半乳糖醛酸酶聚甲基半乳糖醛酸裂解酶聚半乳糖醛酸裂解酶(PMGL)果膠酯酶H具有不飽和鍵的寡聚半乳糖醛酸具不飽和鍵的半乳糖醛酸聚半乳糖醛酸裂解酶H果膠酶分布

霉菌中含各種果膠酶，裂解酶；細菌中主要為聚半乳糖醛酸裂解酶；高等植物中主要是果膠酯酶（PE)和聚半乳糖醛酸酶(PG)，不含果膠裂解酶。

番茄果中含PE，用基因工程技術使酶失活，轉基因番茄中的酶含量不到普通番茄的1%，轉基因番茄更耐擠壓便于運輸、制番茄醬的粘度明顯提高。PG的作用果膠酯酶在降解果膠的同時會伴隨著甲醇（CH3OH)的釋出，這在制葡萄酒中應注意采用熱處理。葡萄酒釀造過程中果膠酶的應用在果蔬汁加工的過程中添加果膠酶減少提取的困難在果蔬汁加工的過程中添加果膠酶使果汁澄清果膠酶種類不同其作用方式也不相同蘋果汁含有高度酯化的果膠，它易于被果膠裂解酶澄清，而單獨使用內切-聚半乳糖醛酸酶幾乎沒有效果。如果采用內切-聚半乳糖醛酸酶和果膠酯酶混合酶制劑。當30%酯鍵和5%糖苷鍵被水解時，蘋果汁就能達到完全的澄清。果膠酶應用

1果汁的提取和澄清利于果汁的壓榨，出汁率提高，經酶處理的果汁較穩(wěn)定，可防止混濁。PG的專一性對果膠的酯化度要求不如PGL高在澄清果汁方面往往注重以PG為主的酶組成在提高浸出汁（特別是自流汁）方面往往注重使用以PGL為主的酶組成2.果酒的澄清、過濾蘋果酒葡萄酒3天然產物的提取在適宜條件下,植物細胞會發(fā)生自溶也可產生包括果膠酶在內的分解酶類，但這會使待分離產物發(fā)生結構改變，甚至產生小分子副產物，因此，一般應先鈍化胞內酶系，再有選擇地進行酶處理。天然色素如葡萄紫、番茄紅、等，中藥提取物如銀杏葉提取物、大蒜油濃縮液、蘑菇濃縮液、人參漿等均可使用酶法提取。利用酶提取,不僅可提高萃取率，還可提高純度。濃縮果汁在高糖濃度的條件下可自行凝結為果凍，但高糖對風味不好，且影響健康。通過PE處理，果膠的甲酯化程度下降濃縮果汁Ca2+、低糖濃度PE凝結果凍要求PE中不含PG、PGL、PGML，以防果膠分解不結凍。4低糖果凍的生產5.帶果肉食品的生產一般常規(guī)加工所得到的果肉在必要的高溫處理或機械泵出后，成型顆粒量明顯減少,硬度降低，直接影響了產品品質。果膠質在PE作用下脫去甲氧基，在鈣離子存在下形成凝膠，從而保持了果肉原有的形狀和硬度。以此為基料的產品有果粒、果凍、果肉酸奶、果肉冰淇淋等。6.果實脫皮橘子囊衣蓮子肉皮大蒜膜層杏仁脫皮花生脫皮7.果膠酶解產物具有生物活性PG可水解細胞壁中的果膠成分產生寡聚半乳糖醛酸，它是植物防御反應的誘導因子。某些中草藥中的藥用成分也與果膠成分有關，如艾葉、柴胡根、人參葉、蒼術根果膠酶解產物還具有抑菌活性，可顯著抑制乳酸菌的生長；還可作為功能性食品的配料。問題延伸生產澄清型果汁中如何正確合理使用果膠酶？纖維素酶（cellulase)作用能降解纖維素-1,4葡萄糖苷鍵，使纖維素變成葡萄糖的一組酶的總稱是起協(xié)同作用的多組分酶系分類C1酶，纖維二糖水解酶（簡稱CBH）（EC1）作用于纖維素線狀分子末端，水解-1,4糖苷鍵，每次切下一個纖維二糖分子；Cx酶，-1,4葡聚糖酶（簡稱EG）（EC）作用于纖維素分子內部的非結晶區(qū)，隨機水解糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產生大量帶非還原性末端的小分子纖維素；-葡萄糖苷酶（簡稱BG）（EC1）將纖維二糖水解成葡萄糖分子。來源真菌、細菌、放線菌原生動物、軟體動物、昆蟲植物纖維素酶酶學動力學性質1.pH最適pH4.5~10酸性、中性、堿性2.溫度45~60度不同的測定溫度熱穩(wěn)定性3.抑制劑、激活劑抑制劑：葡萄糖酸內酯，重金屬離子（Cu,Hg），酚類物質（免受霉菌腐爛作用）激活劑：半胱氨酸酶活性測定方法應用1.果蔬加工中的應用改進果蔬加工工藝大多數果蔬材料中含有纖維素，在果蔬加工過程中采用纖維素酶處理，可以使植物組織軟化，改善口感，簡化工藝。脫苦作用葡萄糖苷酶作為風味酶葡萄糖苷酶2.在釀造工業(yè)的應用酒精的生產醬油釀造啤酒工業(yè)食醋釀造在日本清酒生產中浸米時加入0.02%~0.1%的纖維素酶，浸泡17h，米的溶解性好，糖化發(fā)酵順利，酒渣少，出酒率高；纖維素酶在食醋釀造方面表明，添加纖維素酶產酒精量比對照提高7.5%~23.8%，食醋產量提高0.25~1.38%，主料出品率提高5.1~27.2%；在酒精發(fā)酵時添加纖維素酶可顯著提高酒精產率并縮短發(fā)酵時間。3.纖維素酶在活性物質提取中的應用在提取蛋白質、淀粉、活性多糖等物質時，用纖維素酶進行處理能提高產品得率。水解金針菇，可溶性多糖和可溶性固形物提取率顯著提高，提取效果優(yōu)于水煮法和浸煮法；對香菇柄和香菇蓋中有效成分多糖和氨基酸進行提取，香菇柄加酶的提取液中多糖的含量比不加酶的增加54%，香菇蓋增加44%，而香菇柄加酶的提取液中氨基酸含量比不加酶的增加10%，香菇蓋增加15%；其他糖酶的性質及應用介紹蔗糖酶（轉化酶）（EC6)環(huán)狀糊精生成酶（EC9)木聚糖酶（EC)β-葡聚糖苷酶（EC3)第3章蛋白酶Proteinases

COOHR1—CH—N—H+HO—C—CH—R2HONH2

COOHR1—CH—N—C—CH—R2+H2OHONH23.1.1、蛋白酶的作用水解蛋白質或多肽中的酰胺鍵（肽鍵）。

pH作用方式活性中心

來源動物、植物、微生物酸性、中性、堿性蛋白酶（內切）、肽酶（外切）氨肽酶羧肽酶絲氨酸、巰基羧基、金屬離子3.1.2、分類和特性[EC3.4.#.#]3.2蛋白酶的分類3.2.1絲氨酸蛋白酶3.2.2半胱氨酸蛋白酶3.2.3金屬蛋白酶3.2.4天冬氨酸蛋白酶3.2.1絲氨酸蛋白酶活性中心:絲氨酸(Ser)和組氨酸(His)包括-胰凝乳蛋白酶（chymosin）胰蛋白酶（trypsin）彈性蛋白酶（elastase）枯草芽孢桿菌蛋白酶（subtilisin）地衣芽孢桿菌蛋白酶（alcalase）必需基團：羥基、咪唑基、羧基不可逆抑制劑：二異丙基氟磷酸（DFP）活性中心氨基酸組成相似性-胰凝乳蛋白酶（EC）酶原酶原激活酶原激活的意義

胰凝乳蛋白酶原的激活過程示意圖

由三個肽鏈組成，由雙硫鍵將各部分結合在一起。胰凝乳蛋白酶原A由245個氨基酸殘基（分子量約為25,000），分子中有五個雙硫鍵，它沒有酶的活性；在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用下，裂解生成了三個雙硫鍵-胰凝乳蛋白酶。

催化機制活性中心57位組氨酸、102位天冬氨酸、195位絲氨酸性質在近弱堿性條件下有較高的酶活性專一性較差，甚至可以水解酯鍵鈣離子有激活作用重金屬離子、胰蛋白酶抑制物等有抑制作用（2）胰蛋白酶（EC）消化系統(tǒng)中重要的蛋白質消化酶在機體內不僅可以自激活，還要激活其它的蛋白酶。胰蛋白酶原的激活過程，可以看出酶的立體構象對于酶活性的影響。胰蛋白酶的激活過程示意圖第1個問題酶原的激活具有什么生理意義？性質具有較高的專一性水解時的最適pH為7~9，較高pH下自我催化分解。鈣離子有保護和激活作用大豆中的胰蛋白酶抑制物、生花生凝集素、蛋類中的卵糖蛋白等有抑制作用3.2.2巰基蛋白酶活性中心：半胱氨酸木瓜蛋白酶（papain）、無花果蛋白酶（ficin）、菠蘿蛋白酶（bromelain）和劍麻蛋白酶（agavain）等植物酶鏈球菌蛋白酶（streptococcalproteinase）等微生物酶必需基團：巰基-SH抑制劑：氧化劑或烷基化試劑或重金屬離子激活劑，還原劑如半胱氨酸、谷胱甘肽等和金屬螯合劑如EDTA等蛋白酶活性中心附近氨基酸殘基的排列順序（1）木瓜蛋白酶（EC）分子量23900道爾頓，一級結構和立體結構都清楚底物特異性較寬，作用于精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、瓜氨酸的羧基參與的肽鍵。在pH5下最穩(wěn)定。底物不同，最適pH也會改變，酪蛋白最適pH為7，明膠則為5。最適溫度65℃,在較高溫度下仍然保持活性，例如在中性條件下70℃加熱處理30min，對牛乳的凝結活性僅下降20%；商品化的木瓜蛋白酶中，木瓜蛋白酶一般只占可溶性蛋白質總量的10%，另外的蛋白酶還有木瓜凝乳酶、溶菌酶以及木瓜肽酶等。在肉品嫩化、啤酒加工中應用（2）無花果蛋白酶（EC）分子量約為26,000道爾頓在pH3.5~9的范圍內穩(wěn)定，最適pH為6~8。最適pH不會隨著底物的變化而發(fā)生明顯的改變，例如對于酪蛋白它的最適pH在6.7和9.5，對于明膠的液化為pH7.5。熱穩(wěn)定性稍差，在80℃下溶液中無花果蛋白酶將完全失活。重金屬離子對其有抑制作用。商品酶制劑中含有多種蛋白酶，用途廣泛（3）菠蘿蛋白酶（EC3）分子量約為33,000道爾頓，屬于糖蛋白（含糖約2%）適宜pH為6~8適宜的反應溫度為30℃~45℃因底物的種類及濃度不同而有所改變其它植物蛋白酶劍麻蛋白酶中華獼猴桃蛋白酶3.2.3金屬蛋白酶活性中心：金屬離子必需基團：Zn2+、Mn2+、Fe2+二價金屬離子螯合劑（EDTA)螯合以后，抑制了它的活性。通過透析除去金屬離子也可以失活。添加恢復活性大多數金屬蛋白酶是外切酶嗜熱菌蛋白酶（EC）、橡膠原酶和出血蛋白酶是金屬內切酶羧肽酶

羧肽酶A和羧肽酶B等一些需要Zn2+，脯氨酰氨基酸酶、亞氨基二肽酶等需要Mn2+。

金屬離子置換化學修飾分子修飾氨肽酶3.2.4天冬氨酸蛋白酶活性中心：Asp必需基團:羧基也被稱為羧基酸性蛋白酶最適pH范圍是2~4胃蛋白酶（pepsin）、凝乳蛋白酶（chymosin）微小毛霉、毛霉、利疫菌的蛋白酶等。（1）胃蛋白酶（EC）由胃粘膜細胞分泌出胃蛋白酶原，經過激活而得到的。不同動物源的胃蛋白酶的氨基酸組成有一點差異，所有脊椎動物的胃液中均有胃蛋白酶。胃蛋白酶原向胃蛋白酶的轉化。

字母P標示肽鍵水解釋放出幾個肽片斷（A）、胃蛋白酶抑制物（B）和胃蛋白酶（C）性質在pH為2~5的范圍內穩(wěn)定在以蛋白質為底物時，最適pH為2，超過此范圍時胃蛋白酶容易失活，例如，在pH>6.2時或者70℃以上酶就開始失活最適溫度37℃~40℃。在溫度超過80℃時酶不可逆的失活。（2）凝乳酶（EC）是雛牛皺胃中蛋白酶的主要形式，以酶原的形式分泌出。凝乳酶在從無活性的酶原轉化為有活性的酶的過程中，發(fā)生部分水解。

活性中心：兩個天冬氨酸在pH5.5~6.5的范圍內穩(wěn)定，在pH低于2時還相當穩(wěn)定，在pH3.5~4.5的范圍內由于酶的自催化作用而很快被分解，在中性或堿性pH范圍內，凝乳酶也很快失去活性?；蚬こ碳夹g（克隆技術，克隆酶）：將小牛的凝乳酶基因克隆到微生物表達系統(tǒng)，通過發(fā)酵的方法得到具有凝乳能力的重組凝乳酶，以此來滿足干酪生產需要。蛋白質工程技術（定點突變，突變酶）：凝乳酶分子中的Tyr-77或Val-113用Phe替代后，其凝乳能力相對于原來的酶明顯增強。第2個問題以蛋白酶為例如何考慮酶制劑的來源如何考慮建立體外消化道模擬系統(tǒng)3.3蛋白酶在食品工業(yè)中的應用3.3.1、蛋白質水解物的生產3.3.2、氨基酸的生產3.3.3、明膠的生產3.3.4、干酪的生產3.3.5、肉的嫩化3.3.6、在啤酒中的應用3.3.7、在茶飲料中的應用3.3.8、酶法生產脫腥速溶豆乳蛋白質蛋白胨、多肽、氨基酸蛋白酶水解原料：動物蛋白植物蛋白微生物蛋白3.3.1、蛋白質水解物的生產肽類吸收的意義1.促進氨基酸的吸收2.直接進行蛋白質合成3.有利于礦物質元素的吸收和利用4.提高機體免疫力5.其他的生理意義營養(yǎng)調節(jié)功能肽、調節(jié)肽、生物活性肽、營養(yǎng)性多肽多肽的來源來自植物體的多肽大豆水解多肽、苦瓜多肽、南瓜多肽等來自動物體的多肽柞蠶抗菌肽、蛇毒肽、海洋動物等來自微生物的多肽肽類抗生素：那西肽多肽的作用降血壓肽、降血糖肽、睡眠肽、鎮(zhèn)痛肽、調節(jié)生理活性肽、抗腫瘤肽、抗菌肽多肽的開發(fā)酶法制備多肽流程：原料蛋白預處理酶解分離精制成品微生物發(fā)酵法制備多肽動植物蛋白原料菌種發(fā)酵工藝1大豆多肽2白蛋白多肽3玉米多肽4大米多肽

5綠豆多肽

6花生肽

7豌豆肽

8菜籽肽

9苦瓜肽

10南瓜肽

11核桃肽

12棕櫚肽

13靈芝肽

14蟲草肽

15絲肽酪蛋白磷肽（cpp）含有成簇的磷酸絲氨酸基的肽以牛乳酪蛋白為原料經單一酶或復合酶系水解,通常采用胰蛋白酶與鈣、鐵離子有親和性，在無需增加維生素D的條件下，促進了佝僂病患兒骨骼的發(fā)育。雞粉、雞精調味品的生產

牛肉水解物調味品的生產

醬油的發(fā)酵生產

魚露的發(fā)酵生產

谷朊粉水解肽

廢棄啤酒酵母水解生產酵母粉如何利用蛋白酶開發(fā)功能多肽？第3個問題3.3.2蛋白酶在氨基酸的生產的應用必需氨基酸共有8種：賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸。半必需氨基酸：精氨酸、組氨酸非必需氨基酸必需氨基酸攝入不足會導致大腦和內臟器官受損，血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能下降。WHO把氨基酸列為人體必需的營養(yǎng)素之一

。主要生理功能氨基酸的生產工藝流程：蛋白質原料預處理蛋白酶水解氨基酸混合液分離純化氨基酸氨基酸混合液濃縮結晶干燥產品用途：食品、飼用、醫(yī)藥年消費量約140萬T，谷氨酸和賴氨酸占總量的95%。其余的為小品種氨基酸及藥用氨基酸。明膠的制備原料：動物的皮或骨原理：天然膠原蛋白是三股螺旋結構，不溶于水，經處理，形成單鏈，溶于熱水，成為熱可溶性凝膠，冷卻得明膠溶液。堿性蛋白酶采用酶法，條件、時間從幾周降為不到一天。膠原蛋白酸堿水解明膠膠原多肽3.3.3蛋白酶在明膠生產的應用蛋白酶膠原多肽的功能及應用營養(yǎng)價值高保護胃粘膜抑制血壓的上升促進成骨作用防治關節(jié)病食品工業(yè)的應用3.3.4、蛋白酶在干酪生產的應用原料乳酶法凝固（凝乳酶）除去乳清產品乳酸菌發(fā)酵

干酪是在牛乳凝固后，排除乳清，將凝塊壓成塊狀而制成的產品。制成后未經發(fā)酵的稱為新鮮干酪，經長時間發(fā)酵成熟而制成的產品稱為成熟干酪。干酪中的蛋白質經過發(fā)酵后，由于凝乳酶及微生物中蛋白酶的分解作用，形成氨基酸、肽、胨等，因此很容易消化吸收。凝乳蛋白酶生產干酪的基本原理：-酪蛋白酶副--酪蛋白+糖肽Ca2+形成凝膠凝固對Ca2+不穩(wěn)定的-和-酪蛋白，失去-酪蛋白的保護也析出，形成凝膠。

除了幾種類型的鮮干酪，如農家干酪、夸克干酪，主要是通過乳酸來凝固，而其他所有干酪的生產全是依靠凝乳蛋白酶的反應而形成凝塊。肉類嫩化原理老齡動物中的膠原蛋白因交聯(lián)作用呈交鏈狀、網狀，肉粗糙、堅韌，故需進行嫩化處理。3.3.5蛋白酶在肉類嫩化生產的應用

不同蛋白酶對牛肉嫩化的能力：按每克牛肉嫩化所需酶單位為：番木瓜蛋白酶2.5、菠蘿蛋白酶5.0、無花果蛋白酶5.0、枯草桿菌蛋白酶75.0、米曲霉蛋白酶100.0、黑曲霉蛋白酶200.0、根酶蛋白酶250.0。番木瓜蛋白酶在肉嫩化上效果較好廣州華琪生物制品有限公司的嫩肉粉主要成分為番木瓜蛋白酶。能使肉類松嫩可口易消化吸收，可節(jié)省60％烹飪時間和燃料。其用法為：與肉片拌勻后，10min即可烹飪。每500g肉用本品（小匙）：雞鴨鵝豬肉2～4g，牛羊狗肉豬肚魷魚3～5g。凈重：25g／瓶。保存期：一年。蛋白酶嫩化肉類的方法，主要有兩種：3.1酶粉嫩肉法通常將粉末狀番木瓜蛋白酶勻稱地撒在肉塊上，或者將肉塊浸泡在液態(tài)番木瓜蛋白酶中，一般經10分鐘，即可烹煮。3.2宰前注射法在牲畜屠宰前5～10分鐘注射番木瓜蛋白酶，通過血管分布全身，在其宰后產生嫩化作用。3.3.6、在啤酒中的應用添加蛋白酶制劑如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶，可分解引起混濁的蛋白質，使其不易與多酚物質縮合，從而提高啤酒的穩(wěn)定性。解決冷渾濁據報導，在啤酒旺季酒齡較短的情況下，采用在啤酒過濾后加木瓜蛋白酶，能夠使啤酒穩(wěn)定時間達到４個月以上，而對啤酒的其他質量指標幾乎沒有不利影響。3.3.7

蛋白酶在茶飲料中的應用研究茶葉中蛋白質約占干物重的20%~30%,其中有很少一部分可溶于茶湯。這部分可溶性蛋白質可與多酚類、咖啡堿通過不同方式產生沉淀，參與茶乳酪(冷后渾)的形成。在茶湯中添加蛋白酶來水解這部分水溶性蛋白質，減少了蛋白質與多酚類形成復合物渾濁的機會，還增加茶湯中氨基酸含量，從而增加茶飲料的鮮爽滋味。3.3.8、酶法生產脫腥速溶豆乳粉正已醛、正已醇與蛋白質結合，當蛋白質水解為低分子量的肽，正已醛、正已醇幾乎完全釋放出來，通過酶水解所得豆類蛋白是無腥味的。豆腥味產生的原因大豆中的油脂在脂肪氧化酶作用下氧化產生呈味物質，與大豆中的蛋白質有親和性，一般條件下不易除去。物理化學：加熱，酸堿處理分離蛋白方法：真空脫臭添加糖、酸等風味劑掩蓋法和酶法酶法脫腥豆乳酶量0.5%原料溫度50℃，2h脫腥豆乳去除豆腥味方法蛋白酶的活性測定酪蛋白血紅蛋白硝基苯酯第4章酯酶4.1酯酶的定義、來源及分類

R－O－R’＋H2OR－H＋R’－OH酯酸醇甘油三酯＋H2O甘油二酯（或甘油一酯或甘油）＋脂肪酸

酯酶和脂酶同義嗎？？酶？酶酯酶（esterase）催化酯類中酯鍵裂解的酶類，反應可逆。水解時，產物為酸和醇類；合成時，把酸的羥基與醇的醇羥基縮合并脫水，產物為酯類及其它香味物質。R－O－R’＋H2OR－H＋R’－OH酯酸醇脂酶(Lipase，EC)甘油酯水解酶，脂肪酶，是酯酶中的一類，催化甘油三酯水解生成甘油二酯或甘油一酯或甘油。甘油三酯＋H2O甘油二酯（或甘油

一酯或甘油）＋脂肪酸酯酶分布和來源酯酶廣泛分布于植物、動物和微生物動物胰臟酯酶和微生物酯酶是主要來源。主要是真菌，12屬233種，其次是細菌。酯酶已經實現(xiàn)商品化，在食品、醫(yī)藥、化工等領域起著重要作用。羧基酯類（E.C.3.1.1）磷酸單酯（E.C.3.1.3）磷酸二酯（E.C.3.1.4）三磷酸單酯（E.C.3.1.5）硫酸酯（E.C.3.1.6）硫酯（E.C.3.1.6）酯酶脂酶羧酸酯（EC)芳基酯(EC)乙酸酯(EC)甘油酯(EC)葉綠素酶(EC4)果膠酯酶(EC1)乙酰膽堿酯酶(EC)磷脂酶磷脂酶A(EC)磷脂酶B(EC)種類4.1.2酯酶的分類（E.C.3.1）常見類型依據酶對底物的特性分為非特異性和特異性酯水解酶非特異性酶羧酸酯水解酶作為以脂肪族和芳香族醇的羧酸酯為底物的酶可以作用于乙酸乙酯、丁酸乙酯、甘油三丁酸酯、乙酸苯酯；乙酸酯水解酶是以乙酸脂為底物的酶可以作用于乙酸乙酯和乙酸苯脂特異性酯酶分為醇特異性和酸特異性醇可以是一元醇或多元醇、脂肪族醇或芳香族醇；酸可以是有機酸或無機酸。如羧酸酯水解酶中有磷脂酶、葉綠素酶、乙酰膽堿酯酶、果膠酯酶等。特異性脂酶?；视蛯Ｒ恍詢?yōu)先水解相對分子質量不同的三?；视?。位置專一性酶包括1,3位置專一、和單一位置專一性酶。脂肪酸專一性在水解一類脂肪酸形成的酯鍵時比另一類脂肪酸形成的酯鍵來得快。立體異構專一性4.2酯酶的催化特性4.2.1酯化作用中酯酶的催化特性非極性溶劑適合于酯化合成，控制酯化系統(tǒng)中的水含量，有利于向合成方向進行。及時移出反應產物可促進酯化反應繼續(xù)進行酶的非水相催化酶的固定化例如，在甘油單酯的生產過程中，利用固定化酶膜反應器技術和吸附柱回收體系中的單酰基甘油，產率可達90%以上，膜反應器若連續(xù)生產，每克酶可生產15kg的甘油單酯。4.2.2脂酶的催化特性脂酶的天然底物是不溶于水的，脂酶作為水解酶能作用于乳化的脂肪球100ml甘油三油酸酯乳狀液中界面面積105㎝2胰脂酶作用于不溶解的甘油三酯時，酶活力和乳化液界面面積的關系B－甘油三丁酯O－甘油三油酸酯脂酶活力的測定最適pH和最適溫度隨底物、脂酶的純度、緩沖液和測定的方法不同而稍有改變。大多數脂酶的最適pH在堿性范圍，即pH8～9，如胰脂酶的最適pH為8～9，但是也有一些脂酶具有酸性的最適pH。不同的微生物脂酶的最適pH存在著很大的差異，它們的范圍為5.6～8.5。

1972年從土壤中分離篩選出我國第一株堿性脂肪酶產生菌并首創(chuàng)了維多利亞藍快速平板鑒別法分離到堿性脂肪酶野生型菌株

維多利亞藍快速平板鑒別法（初篩）維多利亞藍加入培養(yǎng)基，調pH，取各種試樣在瓊脂平板上涂布培養(yǎng)，如在其周圍產生藍綠色圈者，表明脂肪被水解成脂肪酸。酶活性測定方法（復篩）橄欖油乳化液，pH9.4，37°C水浴，反應一定時間，用NaOH進行電位滴定酶活單位定義：每分鐘釋放出游離的一微克分子的脂肪酸所需的酶量為一個活力單位U。采用對硝基棕櫚酸脂(pNPP)法：Experimentswerecarriedoutinavolumeof5

mlcontaining10mMpNPPand1

Methanolinn-heptane,andthen25

μlsamples——lipasefor5

minat40

°C.LiberationofpNP（硝基苯酚）wasdetectedusingacommonspectrophotometeranddetectedat410

nmafterextractingaliquotsofsamplefromthereactionmediumwith1

mlof0.1

MNaOHsolution.乙酰膽堿酯酶的催化特性乙酰膽堿酯酶（acetylcholineesterase，EC）存在于所有動物的神經組織中，它催化下列反應：（CH3)3N+CH2CH2OCOCH3＋H2O→(CH3)3N+CH2CH2OH＋CH3COO－＋H+乙酰膽堿酯酶在將神經脈沖從神經細胞傳遞至運動肌神經原后立即發(fā)生此反應。一些有機磷化合物、氨基甲酸酯和許多其他化合物對乙酰膽堿酯酶具有不可逆的抑制作用，因此，這些化合物是有毒的，這也是它們殺滅昆蟲的機制。果膠酯酶的催化特性果膠酯酶（Pectinesterase，PE,EC1）存在于高等植物組織中，真菌、酵母、細菌中也產生。對半乳糖醛酸甲酯具有高度專一性催化果膠脫酯，生成果膠酸，與鈣離子橋連，形成凝膠，提高果實的硬度。蘋果酒生產工藝4.3酯酶的應用現(xiàn)狀及前景4.3.1催化合成芳香酯4.3.2催化合成單甘酯4.3.3催化合成糖酯4.3.4催化合成磷脂4.3.5三酰甘油的改性4.3.6在提取維生素E中的應用4.3.7在食用油脂精煉中的應用4.3.8在功能性油脂分離和純化中的應用4.3.9在面制品中的應用4.4.1催化合成芳香酯低分子量芳香酯是一類重要的芳香化合物，多呈天然水果香味，它們廣泛應用于食品、飲料等食品工業(yè)中。酶法生產被看成很有希望工業(yè)化生產芳香酯類的途徑。商業(yè)上重要的低分子量酯可以在無水有機溶劑中或無溶劑環(huán)境中經過轉酯生產，也可以由酸與醇直接酯化合成。固定化脂肪酶現(xiàn)已用于芳香酯的合成。生產多種脂肪族和芳香族香味酯，如乙酸乙酯、丁酸異戊酯、癸酸異戊酯、乙酸香葉酯、月桂酸丁酯、安息香酸甲酯等。美國把乳脂或黃油乳化后加酯酶保溫催化，釋放出脂肪酸，獲得的酯化香味液比黃油的香味高150倍。意大利在利用酯酶使干酪增香獲得成功國外利用酯酶把乙醇和酪酸進行酯化，獲得具有特殊芳香味的酪酸酯。日本利用酯酶合成具有濃郁香味的甘油酯等酯類我國利用酯酶，提高濃香型曲酒中的已酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等四大酯的含量，應用此技術后，優(yōu)級率提高10.18%。利用酯酶提高食醋的風味，特別是提高食醋中乙酸乙酯和乳酸乙酯等酯類的含量，效果較為明顯，一般乙酸乙酯提高5%～10%。乳酸乙酯提高3%～8%，口感有明顯地提高。利用脂肪酶和酯酶增香甘肅渭水酒業(yè)集團2003年利用酯酶增香技術，已生產出己酸乙酯生物合成酯香液，合成酯香液的己酸乙酯含量以100mL酯香液中酯含量計,酯化10d生酯量為1080mg，30d為2370mg，60d為4180mg，90d達到7230mg水平。生產的酯香液已用于成品酒（中低檔酒）的勾調，明顯好于外購香料。主要優(yōu)點是酒體自然感強、綿甜、主體香突出。4.4.2催化合成單甘酯單甘酯是世界上用量最大的食品乳化劑工業(yè)上主要使用堿催化法將油脂甘油水解（200℃~260℃，30min），由于高溫對不飽和成分是不適合的，酶法生產單甘酯或雙甘酯已被廣泛研究。

酶法生產單甘酯的方法甘油與酸、烷基酯相互作用發(fā)生直接酯化或轉酯化。利用甘油和油酸或油酸乙酯生產單油酸甘油酯；三酰甘油部分醇解和甘油解；利用三棕櫚酰甘油酯生產單棕櫚酰甘油酯。利用單甘酯較其他甘油酯熔點高，選擇適宜的反應溫度，使單甘酯從反應體系中析出而大大提高產量；在動物脂、棕櫚油、大豆油、菜子油、等均有報道。4.4.3催化合成糖酯用單糖或雙糖代替甘油制備類脂分子，?；奶遣粌H具有特有的營養(yǎng)特性，并為可作為良好的表面活性劑。糖酯可以作煎炸油，也可作為一些產品如冰淇淋、人造奶油、奶酪