第十二章 嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)

PAGEPAGE8第十二章嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus,HBV）不僅能引起人類(lèi)急慢性肝炎，而且還可導(dǎo)致原發(fā)性肝癌的形成。乙型肝炎是一種世界性傳染病，我國(guó)是高流行區(qū)。我國(guó)有50%～70%的人群受過(guò)乙型肝炎病毒的感染，有8%～10%為乙型肝炎病毒表面抗原攜帶者，約有一億人口。根據(jù)1980年全國(guó)調(diào)查表明，我國(guó)現(xiàn)患肝炎病人約2000萬(wàn)人，其中60%以上為慢性肝炎患者。然而，遺憾的是至今尚無(wú)有效的辦法來(lái)防治HBV的感染。目前，乙肝疫苗雖已開(kāi)始研制并應(yīng)用，但是，即使普及疫苗接種，現(xiàn)有的乙肝患者及帶毒者的治療，至少在今后的50的內(nèi)仍然是一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題，何況在我國(guó)，疫苗推廣尚存在問(wèn)題，而乙肝的治療更為困難。近年來(lái)，由于基因重組技術(shù)的發(fā)展，加速了HBV的研究進(jìn)程，HBV的基因結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄及增殖特性已基本搞清，并且整合在原發(fā)性肝癌細(xì)胞染色體上的HBVDNA序列亦被證實(shí)。同時(shí)采用多種載體系統(tǒng)重組HBVDNA片段，在體外已成功地表達(dá)了乙型肝炎病毒表面抗原（HbsAg），乙型肝炎病毒核心和e抗原（HBcAg/HbeAg），可望采用基因工程的方法來(lái)制備合適的HBV疫苗替代昂貴的HBV血源性疫苗。第一節(jié)嗜肝DNA病毒科的分類(lèi)與毒粒結(jié)構(gòu)一、嗜肝DNA病毒的分類(lèi)乙型肝炎病毒于1986年由國(guó)際病毒命名委員會(huì)正式劃歸為一個(gè)新病毒科的成員，該科下設(shè)正嗜肝DNA病毒屬（Orthohepadnavirus）和禽嗜肝DNA病毒屬（Avihepadnavirus）。屬于本科的還有東方土撥鼠肝炎病毒（Woodchuckhepatitisvirus,WHV）、地松鼠肝炎病毒（Groundsquirrelhepatitisvirus,GSHV）和鴨乙型肝炎病毒（Duckhepatitisvirus,DHBV）。本科病毒具有類(lèi)似的毒粒結(jié)構(gòu)，構(gòu)有嗜肝特性，有明顯的種屬特異性，并可導(dǎo)致持續(xù)性病毒感染。HBV、WHV等可引起慢性活動(dòng)性肝炎和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。二、嗜肝病毒的毒粒結(jié)構(gòu)完整的毒粒即Dane顆粒，直徑42nm，由外膜和核殼組成，后者含有一個(gè)環(huán)狀DNA分子、DNA多聚酶、DNA結(jié)合蛋白以及蛋白激酶活性。完整的HBV顆粒由外膜蛋白（HbsAg）與核衣殼組成，核衣殼由HBcAg構(gòu)成，其核心部分含有病毒DNA，DNA多聚酶/逆轉(zhuǎn)錄酶，蛋白激酶及DNA結(jié)合蛋白，另一種存在于急慢性乙肝病人血清中呈可溶性狀態(tài)的蛋白稱(chēng)之為HBeAg，它是由HBVC基因（不含前C區(qū)）編碼的，當(dāng)用2-硫基乙醇，熱或輕微的蛋白酶處理HBV核心顆粒時(shí)，可使HBcAg轉(zhuǎn)變成HBeAg，亦有人認(rèn)為HBeAg能形成多聚體形式，可能是病毒核心的一結(jié)構(gòu)成分。（一）外膜蛋白HBsAg的抗原性比較復(fù)雜，有一個(gè)屬特異性的共同抗原決定簇“a”和至少兩個(gè)亞型決定簇“d/y和w/r”?！癮”決定簇又可分為a1、a2、a3；“W”決定簇又可分為W1、W2、W3、W4，此外，尚有少見(jiàn)的亞型決定簇q、g、n、x和t。其中最常見(jiàn)的主要血清型為adw、adr和ayw。亞型的地區(qū)分布不同，我國(guó)以adr為主，adw次之。新疆、西藏、內(nèi)蒙地區(qū)以ayw為主。外膜由蛋白、多糖和類(lèi)脂組成。糖蛋白插入雙層類(lèi)脂膜。毒粒的外膜含有主要蛋白、中蛋白和大蛋白三種蛋白。1．主要蛋白：含226個(gè)氨基酸，由S基因編碼，有糖基化與非糖基兩種形式，前者為GP27，后者為GP24，兩者的比例大致為1︰1。GP27在146位Asn有一N連結(jié)的多糖分子。根據(jù)不同亞型的6個(gè)主要蛋白的氨基酸序列分析表明，它有3個(gè)疏水區(qū)段，7～23，80～98和169～226，為兩個(gè)親水區(qū)段所隔開(kāi)。疏水區(qū)段的氨基酸比較保守，氨基酸的變異主要發(fā)生在親水區(qū)段。Tiollais等（1983）認(rèn)為兩個(gè)主要蛋白分子通過(guò)二硫鍵形成的二聚物是一個(gè)結(jié)構(gòu)單位，它具有完全的HBsAg抗原性，其中第二個(gè)親水區(qū)段，即122～155位，含有HBsAg主要的屬和亞型的抗原決定簇。2．中蛋白：由281個(gè)氨基酸組成，由前S2和S基因編碼。它是糖蛋白，根據(jù)糖基化程度，有兩種類(lèi)型：GP33和GP36。GP33含有一個(gè)多糖分子，而GP36含兩個(gè)多糖分子。前S2基因編碼的55個(gè)氨基酸中親水性的屬多，在外膜表面含一個(gè)抗原決定簇，后者與二硫鍵無(wú)關(guān)，其免疫原性較主要蛋白為強(qiáng)。3．大蛋白：由前S1、前S2和S基因編碼，它有糖基化（GP42）和非糖基化（GP39）兩種類(lèi)型。不同亞型的大蛋白的氨基酸長(zhǎng)度不同：ay亞型有389個(gè)氨基酸，ad亞型有400個(gè)氨基酸。GP42含有一個(gè)N連結(jié)的多糖，至少N端一部分露在外膜的表面。每一毒粒含有300～400個(gè)主要蛋白分子和40～80個(gè)中蛋白和大蛋白分子。（二）核衣殼蛋白HBV的HBcAg含有一種主要蛋白（P22C），并含有一種蛋白激酶，能使P22C蛋白磷酸化。P22C羧基端富有Arg（精AA）、Ser（絲AA）和Pro（脯AA）。在Arg豐富區(qū)內(nèi)有一個(gè)八肽的串聯(lián)重復(fù)序列：Ser-Pro-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Gln（谷胱酰胺），這與P22C和HBV基因組結(jié)合有關(guān)。這樣的結(jié)構(gòu)與魚(yú)精蛋白和其他DNA結(jié)合蛋白相類(lèi)似。HBeAg是一個(gè)隱蔽的抗原決定簇，可經(jīng)衣殼的裂解而釋放，在患者血清中，呈較小的蛋白(15Kd)，由P22C經(jīng)蛋白酶水解形成，其C端為T(mén)hr(蘇AA)-Thr-Val-Val(纈AA)序列。（三）基因組HBV的基因組為部分雙鏈環(huán)狀DNA，單鏈區(qū)長(zhǎng)度不等。其長(zhǎng)鏈（L(-)）的長(zhǎng)度是固定的，約3200個(gè)核苷酸。短鏈（S(+)）的長(zhǎng)度為L(zhǎng)(-)鏈的50%～100%。L(-1)和S(+)鏈的5′端的位置是固定的，而S(+)鏈3′端的位置都是可變的?；蛑阅芫S持環(huán)狀結(jié)構(gòu)是由于兩條鏈的5′端各有一個(gè)粘性末端序列。S(+)鏈的5′端位于1601，L(-)鏈的5′端位于1826。粘端的兩側(cè)各有一個(gè)11bp的直接重復(fù)序列（DR）：5′TTCACCTCTGC，各開(kāi)始于1824和1590。稱(chēng)為DR1和DR2。第二節(jié)嗜肝DNA病毒基因組的結(jié)構(gòu)一、四種嗜肝DNA病毒基因組結(jié)構(gòu)上的異同嗜肝DNA病毒具有類(lèi)似的基因組結(jié)構(gòu)。HBV（adw）基因組全長(zhǎng)為3200bp。一般以S(+)鏈中EcoRI單一切點(diǎn)5′GAATTC的第一個(gè)T作為物理圖的起始點(diǎn)；無(wú)EcoRI切點(diǎn)的，則以相同位置為起始點(diǎn)。WHV和GSHV的基因組約為3300bp，而DHBV為3021bp。HBV與WHV，GSHV和DHBV的核苷酸序列的同源性分別為70%、55%和40%，其中WHV和GSHV核苷酸序列的同源性最高為80%。不同毒株的HBVL(-)鏈轉(zhuǎn)錄物均含有4個(gè)ORF，而且在不同的HBV亞型中基因的缺失或插入均為3的倍數(shù)，從而使ORF保持不變；相反，S(+)鏈的轉(zhuǎn)錄物為無(wú)任何足夠長(zhǎng)度的ORF。所以，L(-)鏈攜帶有病毒的全部的編碼容量，也正因?yàn)槭沁@樣把長(zhǎng)鏈稱(chēng)為負(fù)鏈。4種病毒兩條鏈的5′端均有DR1和DR2，以維持基因組呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但是，其重復(fù)序列及其間隔距離有差異。HBVL(-)轉(zhuǎn)錄物的4個(gè)ORF稱(chēng)為S、C、P和X。其中P區(qū)與其他三個(gè)ORF相重疊。但是DHBVL(-)鏈轉(zhuǎn)錄物缺少X區(qū)。HBV、WHV、GSHV和DHBV不同編碼區(qū)的長(zhǎng)短略有不同。HBV以及其他嗜肝DNA病毒的基因組在哺乳類(lèi)動(dòng)物DNA病毒中是最小的一種，其編碼還有廣泛的重疊以充分?jǐn)U大其編碼容量。L(-)鏈可以閱讀其長(zhǎng)度的1.5倍。總結(jié)HBV、WHV、GSHV和DHBV基因組結(jié)構(gòu)的差異，如下表：嗜肝DNA病毒基因組結(jié)構(gòu)的差異基因組HBVWHVGSHVDHBV大?。╞p）5′端直接重復(fù)序列DR1與DR2之間距離(bp)S（aa）PS2(aa)PS1(aa)C(aa)X(aa)P(aa)3200TTCACCTCTGC223226551081831548323308TCACCTGTGC212222601441881418793311TTCACCTGTGC211222601461871388813021TACACCCCTCTC4616710988338—839aa：氨基酸數(shù)。對(duì)HBV的主要亞型ayw、adr、adw和aydw進(jìn)行全序列分析認(rèn)為，亞型之間的差異為8%～10%，而同一亞型之間的變異為1.5%～2.0%。4株WHV的全序列分析表明，變異率為1%～3.5%。二、嗜肝DNA病毒基因組的轉(zhuǎn)錄物在感染的猩猩肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有兩種主要的HBV聚（A）RNA轉(zhuǎn)錄物，分別為2.1（或2.2）kb和3.5kb，均由L(-)鏈轉(zhuǎn)錄。2.1kbRNA的5′端在前S2區(qū)上游約20bp處，3′端在C基因起始端，它包括前S2區(qū)段，S基因和X區(qū)段。3.5kbRNA的5′端在前C基因區(qū)，3′端與2.1kbRNA的3′端相同，它包括HBV的全基因組加上大約100bp。這提示3.5kbRNA來(lái)自共價(jià)閉合的雙鏈RNA。HBV轉(zhuǎn)錄物未發(fā)現(xiàn)拼接現(xiàn)象，至少在2.1kb和3.5kbRNA是如此。2.1kbRNA是PreS2和S1蛋白的mRNA；而3.5kbRNA是核心蛋白的mRNA，可能也是DNA多聚酶的mRNA。除以上2個(gè)主要轉(zhuǎn)錄物外，還有2.6kbmRNA，產(chǎn)生preS1蛋白及0.8～0.9kbmRNA，它可能與X蛋白有關(guān)。理論上HBV應(yīng)有4個(gè)啟動(dòng)子?，F(xiàn)已知2.1kbmRNA啟動(dòng)子與SV40晚期啟動(dòng)子同源，3.6kbmRNA啟動(dòng)子位于1573～1657bp區(qū)段，并有一個(gè)細(xì)胞蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。在WHV和GSHV感染并有病毒繁殖的肝臟中也有2.1kb和3.7kb的轉(zhuǎn)錄物以及一些次要的轉(zhuǎn)錄物。DHBV有第三個(gè)主要聚（A）RNA轉(zhuǎn)錄物，起始于前S1區(qū)起始密碼子下游的幾個(gè)核苷酸處。第三節(jié)嗜肝DNA病毒的繁殖機(jī)制HBVDNA在肝細(xì)胞內(nèi)以兩種形式存在，一種是游離DNA，一種是整合到宿主細(xì)胞染色體中。游離DNA，它代表病毒復(fù)制的中間型，見(jiàn)于HBV感染的急性期和某些慢性期；而整合DNA則常見(jiàn)于慢性病毒感染，特別是原發(fā)性肝細(xì)胞癌中。游離的與整合的DNA可存在于同一樣本，但并不意味著兩種形式不同時(shí)存在于同一細(xì)胞內(nèi)。除肝細(xì)胞外，其DNA還可見(jiàn)于腎、胰和皮膚組織細(xì)胞中，游離形式和整合形式的HBVDNA還可在骨髓單形核血細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，這可能與發(fā)病機(jī)理有關(guān)。關(guān)于嗜肝DNA病毒的繁殖機(jī)制，根據(jù)對(duì)DHBV和HBV的研究認(rèn)為，不同于其他DNA病毒，主要有RNA的中間型。主要步驟如下：嗜肝DNA病毒的種屬特異性可能是由于前S區(qū)存在肝細(xì)胞受體的識(shí)別位點(diǎn)；當(dāng)病毒進(jìn)入細(xì)胞后，DNA到達(dá)核內(nèi)，即轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆拈_(kāi)環(huán)雙鏈DNA，隨后成為超螺旋DNA，L(-)鏈通過(guò)細(xì)胞的RNA聚合酶被轉(zhuǎn)錄成3.5kbRNA，稱(chēng)作前基因組。從每個(gè)基因組合成多拷貝的前基因組。前基因組帶上DNA多聚酶和DNA連結(jié)蛋白，以前基因組為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成L(-)DNA。反轉(zhuǎn)錄起始于DR1區(qū)，而DNA連結(jié)蛋白共價(jià)結(jié)合子L(-)鏈的5′端，可能作為L(zhǎng)(-)鏈合成的引物。在DNA合成過(guò)程中，前基因組被一種類(lèi)似RNase的活性物所降解，這樣反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是一個(gè)全長(zhǎng)的L(-)鏈DNA。有一種大約20bp的小RNA片段，可能來(lái)自前基因組的5′端，在DR2處，作為合成正鏈的引物。正鏈不需要完全合成，它對(duì)核衣殼的包裝以及病毒的釋放是不需要的。嗜肝DNA病毒的繁殖模式與花椰菜花葉病毒（CaMV）和反轉(zhuǎn)錄病毒的相似之處是都存在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，但是反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組是RNA，病毒復(fù)制的中間型是整合的DNA，而嗜肝DNA病毒和CaMV的基因組是DNA，復(fù)制的中間型是RNA。在DHBV復(fù)制過(guò)程中從未發(fā)現(xiàn)整合現(xiàn)象，可見(jiàn)基因組的整合過(guò)程可能對(duì)嗜肝DNA病毒來(lái)說(shuō)是非必需的。反轉(zhuǎn)錄病毒和CaMV負(fù)鏈的合成由RNA（tRNA）起始，而嗜肝DNA病毒DNA負(fù)鏈的合成可能由某一種蛋白起始。反轉(zhuǎn)錄病毒的三個(gè)基因gag、pol、env可與嗜肝DNA病毒的三個(gè)基因C、P和S相當(dāng)。但是，反轉(zhuǎn)錄病毒的蛋白是從單一原始轉(zhuǎn)錄物經(jīng)拼接的mRNA轉(zhuǎn)譯而來(lái)的，而嗜肝DNA病毒的蛋白是從至少是兩個(gè)原始轉(zhuǎn)錄物不經(jīng)拼接而轉(zhuǎn)譯來(lái)的。第四節(jié)嗜肝DNA病毒與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的關(guān)系大量的流行病學(xué)資料表明，從世界范圍的地區(qū)分布來(lái)說(shuō)，HBsAg慢性攜帶者的流行情況與原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）的年發(fā)病率呈明顯的正相關(guān)。HCC患者血清中HBsAg的陽(yáng)性率遠(yuǎn)比正常人群為高。在中國(guó)臺(tái)灣進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查表明，在40～59歲的男性患者中，HBsAg攜帶者患HCC的危險(xiǎn)性比HBsAg陰性者大217倍。在HBsAg攜帶者人群中死于肝硬化或HCC者占51%，而對(duì)照人群僅為2%。美國(guó)疾病控制中心的統(tǒng)計(jì)表明，大約10%的HBV患者可轉(zhuǎn)變成慢性病毒攜帶者，有大于25%的慢性活動(dòng)性肝炎可發(fā)展為肝癌，并常導(dǎo)致肝硬化，HBV攜帶者發(fā)生原發(fā)性肝癌的比正常人高12～300倍。WHV在土撥鼠中可以引起實(shí)驗(yàn)性HCC。HbsAg陽(yáng)性的HCC患者，不論在從癌組織建立的細(xì)胞株，還是腫瘤細(xì)胞中，大都可以發(fā)現(xiàn)整合的HBVDNA序列，整合的位點(diǎn)數(shù)在1至12之間，在HCC患者的癌組織中，從未發(fā)現(xiàn)游離的HBVDNA，而在慢性攜帶者中可以發(fā)現(xiàn)。在HBV血清指標(biāo)陰性的HCC患者中也可以發(fā)現(xiàn)整合的HBVDNA序列。另一方面，HBV基因整合與癌變的確切關(guān)系尚不明了。HBVDNA也可在HCC患者肝臟的非癌細(xì)胞部位發(fā)現(xiàn)，也在無(wú)HCC的慢性肝炎患者或肝硬化患者中發(fā)現(xiàn)。在癌組織樣本中和在HCC建立的細(xì)胞系中進(jìn)行的整合HBVDNA結(jié)構(gòu)分析表明，整合發(fā)生了復(fù)雜的基因重排，整合的機(jī)理不清楚。Dejean等報(bào)道，特異性HBV基因整合是通過(guò)DR1和DR2區(qū)，但Choo等認(rèn)為整合位點(diǎn)在HBV基因組的單鏈區(qū)。分析人HCC的HBV基因整合序列以及土撥鼠HCC的WHV基因整合序列，未發(fā)現(xiàn)有整合的特殊的保守序列。整合區(qū)GC豐富，在整合HBVDNA的細(xì)胞基因側(cè)翼區(qū)中也未發(fā)現(xiàn)任何已知癌基因。第五節(jié)HBV基因結(jié)構(gòu)及體外表達(dá)一、HBV的基因結(jié)構(gòu)與功能HBV的基因組是一個(gè)環(huán)形的部分雙股的DNA分子，其中完整的鏈稱(chēng)為長(zhǎng)鏈或負(fù)鏈[L(-)]，由3200左右核苷酸組成，短鏈又稱(chēng)為正鏈[S(+)]，核苷酸數(shù)目相當(dāng)于長(zhǎng)鏈的50～100%。兩條鏈的5′端之間的堿基互補(bǔ)構(gòu)成粘性末端，維持其環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在粘性末端的兩側(cè)各有一個(gè)由11個(gè)堿基對(duì)(bp)（5′TTCACCTCTGC）組成的正向重復(fù)順序（DR），位于核苷酸1824和核苷酸1590，分別稱(chēng)為DR1和DR2。HBVDNA的S(+)鏈不管多長(zhǎng)均不具有編碼蛋白的功能，即不含ORF（Openreadingframe），而L(-)鏈則含有所有HBV的蛋白密碼，其轉(zhuǎn)錄的4個(gè)ORF，分別稱(chēng)為S、C、P和X，P區(qū)最長(zhǎng)與另外的三個(gè)區(qū)重疊，這樣，L(-)鏈被閱讀一次半。（一）S區(qū)S區(qū)編碼HBV的外膜蛋白，分為前S1（Pre-S1）區(qū)，前S2（Pre-S2）區(qū)及S基因。HBV各五型的S基因和Pre-S2的長(zhǎng)度是一致的，分別為226和55個(gè)氨基酸編碼容量，而Pre-S1區(qū)變化較大，在108～119個(gè)氨基酸之間，adw亞型比ayw亞型的Pre-S1區(qū)約長(zhǎng)33個(gè)核苷核。Pre-S1與Pre-S2的變異率相當(dāng)于S基因的兩倍，這說(shuō)明S基因編碼病毒外殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，而Pre-S區(qū)的氨基酸順序與病毒的包裝關(guān)系較小，但影響宿主的免疫應(yīng)答。以前認(rèn)為S蛋白抗體具有中和作用，近來(lái)研究表明Pre-S2編碼的55個(gè)氨基酸多肽的免疫原性明顯高于HBsAg的S區(qū)，該多肽的N-末端的26個(gè)氨基酸含有代表主要抗體結(jié)合部位的決定簇。Pre-S1區(qū)編碼的108個(gè)（adw亞型）或119個(gè)（ayw亞型）氨基酸多肽，連接在“中”蛋白的N-末端，并且位于病毒顆粒表面，亦具有較高的免疫原性。Pre-S1多肽在小鼠體內(nèi)具有T、B細(xì)胞水平上的免疫活性，在人急性HBV感染過(guò)程中，可產(chǎn)生Pre-S1特異性體液免疫反應(yīng)，不過(guò)，Pre-S1特異性抗體是否參與體內(nèi)病毒的清除過(guò)程尚不清。（二）C區(qū)C區(qū)編碼核心抗原（HBcAg）和e抗原（HBeAg）。該區(qū)有兩個(gè)起始密碼子，一個(gè)位于核苷酸1814，另一個(gè)位于核苷酸1901，二者之間含有的29個(gè)密碼子稱(chēng)為前C區(qū)（Pre-C），其它則稱(chēng)為C區(qū)。核苷酸第1814～2450序列編碼HBcAg，而核苷酸第1901～2450序列編碼HBeAg。此外，在前C第1816核苷酸處有一缺口，推測(cè)該區(qū)為HBVDNA整合入宿主DNA的部位，從而解釋了為什么HBVDNA整合入宿主細(xì)胞DNA時(shí)，通常只表達(dá)HBsAg，而不表達(dá)HBcAg或病毒顆粒。（三）P區(qū)P區(qū)編碼的產(chǎn)物是富含組氨酸的堿性蛋白，分子量約為90,000D，與DNA多聚酶相似。比較這種蛋白的氨基酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其覆蓋S基因末端區(qū)所編碼的氨基酸順序與所有反轉(zhuǎn)錄病毒和花椰菜花葉病毒（CaMV）的反轉(zhuǎn)錄酶部分同源，因而認(rèn)為P區(qū)編碼具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的病毒DNA多聚酶。（四）X區(qū)X區(qū)編碼145到154個(gè)氨基酸的多肽，其功能尚不清楚，用合成多肽的抗體從HBV感染的肝組織中檢測(cè)出相應(yīng)的多肽為P28，而在原發(fā)性肝癌患者血清中測(cè)得與HBxAg起反應(yīng)的抗體，但抗-HBx是否能作為HCC的血清學(xué)標(biāo)記尚有待證實(shí)。二、HBV基因的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控在HBV感染的黑猩猩肝臟中檢測(cè)到了兩個(gè)HBV特異性Poly(A)RNA分子，二者均是由HBVDNAL(-)鏈轉(zhuǎn)錄的，分別命名為2.1kbRNA和3.5kbRNA。2.1kbRNA分子的5′-末端位于Pre-S2區(qū)上游20個(gè)核苷酸處，而3′-末端則位于C基因起始附近，它覆蓋了Pre-S2區(qū)，S基因和X區(qū)。3.5kbRNA分子的5′-末端位于Pre-C區(qū)，其3′-末端與2.1kbRNA分子的3′-末端位置相同，因此，它覆蓋了整個(gè)L(-)鏈，外加100個(gè)核苷酸的序列。這提示3.5kbRNA分子產(chǎn)生于共價(jià)閉環(huán)形HBVDNA，并進(jìn)行了極小部分的再次轉(zhuǎn)錄。通過(guò)克隆的HBVDNA片段轉(zhuǎn)染細(xì)胞，證實(shí)了2.1kbRNA是HBV主要外膜蛋白的翻譯模板，而3.5kbRNA則是其核心蛋白的翻譯模板，同時(shí)很可能指導(dǎo)具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的HBVDNA多聚酶的合成，至于指導(dǎo)其它HBV蛋白的mRNA尚不清楚。HBV只能在人和黑猩猩的肝臟中增殖，這提示HBV基因的表達(dá)存在嚴(yán)格的種系及組織特異性。已證實(shí)HBV基因組中至少含有3個(gè)啟動(dòng)子，即HBcAg基因啟動(dòng)子（CP）、Pre-S區(qū)啟動(dòng)子（SP1）及S基因啟動(dòng)子（SP11），它們?cè)贖BVDNA基因圖上的位置分別是核苷酸1648、核苷酸2780及核苷酸3152處。Siddiqui等描述的在HBVDNAPre-S區(qū)內(nèi)，EcoRI切點(diǎn)上游部位，控制其主要表面蛋白合成的“內(nèi)部”啟動(dòng)子可能就是SP11。在哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞及其病毒基因啟動(dòng)子上游區(qū)，存在一順式（inCis）刺激其啟動(dòng)子活性的核苷酸序列，稱(chēng)之為增強(qiáng)子。HBV增強(qiáng)子位于HBcAg基因啟動(dòng)子上游的450位核苷酸處即表面抗原的編碼序列與“X”區(qū)之間，它能明顯地增強(qiáng)HBsAg基因啟動(dòng)子的活性及HBcAg基因的表達(dá)。不過(guò)增強(qiáng)子本身只有組織細(xì)胞特異性的反式作用因子（trans-actfactor）作用下，才能發(fā)揮作用。Shaul等從人肝癌細(xì)胞中提取的特異性核蛋白能與HBV增強(qiáng)子及其上游區(qū)結(jié)合，并明顯增強(qiáng)了HBV基因的表達(dá)。因而，推測(cè)肝細(xì)胞中這種特異性核蛋白的存在可能是HBV嗜肝性的原因所在。三、HBV基因的體外表達(dá)HBVDNAL(-)鏈的4個(gè)ORF編碼的蛋白分別為HBsAg、HBcAg/HBeAg、HBVDNA多聚酶及X蛋白。S基因編碼的由226個(gè)氨基酸的多肽，是HBV外膜的主要構(gòu)成成分，稱(chēng)為“主要”蛋白；Pre-S2區(qū)與S基因共同編碼的蛋白由281個(gè)氨基酸組成，稱(chēng)為“中”蛋白，Pre-S2多肽區(qū)含多聚人血清白蛋白受體（pHSA）；Pre-S1、Pre-S2與S基因共同編碼的蛋白最大，含398個(gè)氨基酸（adw亞型），稱(chēng)為“大”蛋白。最早采用克隆的HBVDNA，在酵母或哺乳類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)的蛋白通常是S基因編碼的“主要”蛋白，后來(lái)研究表明HBsAg的主要抗原決定簇位于Pre-S2多肽區(qū)，并證明了Pre-S2多肽在小鼠體內(nèi)能增加S蛋白的免疫原性，人工合成的Pre-S2多肽的抗體能中和HBV的感染并起到保護(hù)黑猩猩的作用，因而認(rèn)為體內(nèi)Pre-S2多肽抗體在清除HBV過(guò)程中可能起到重要作用。所以，近年來(lái)人們致力于表達(dá)含Pre-S2多肽的“中”蛋白或含整個(gè)Pre-S多肽的“大”蛋白的研究。目前，使用HBVDNA片段克隆已成功地在酵母細(xì)胞及哺乳類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)了具有多聚人血清白蛋白（pHSA）受體的“中”蛋白，同樣已證明含Pre-S2基因與S基因克隆質(zhì)粒的大腸桿苗提取物中的HBsAg顆粒亦含pHSA受體。Dehoux等在釀酒酵母中成功地表達(dá)了含整個(gè)Pre-S多肽的“大”蛋白，分子量為3.9kd，具有pHSA受體，并認(rèn)為這種蛋白參與HBV顆粒外膜的構(gòu)成。Scully等將S基因插入桿狀病毒（Baculovirus）基因中，感染一種昆蟲(chóng)細(xì)胞而表達(dá)大量的22nmHBsAg顆粒，認(rèn)為可用來(lái)制備疫苗。另一方面的研究是所謂“嵌合”蛋白或“融合”蛋白的表達(dá)，采用痘苗病毒作HBV基因表達(dá)的載體，其目的是種痘的同時(shí)使機(jī)體獲得對(duì)HBV的免疫力。此外，Delpeyroux等在HBVS基因部位插入合成的編碼脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白的D