高三生物一輪復習：微生物培養(yǎng)技術及應用

.2微生物的培養(yǎng)技術及應用一.微生物的基本培養(yǎng)技術（提供營養(yǎng)，確保無其他雜菌）（一）培養(yǎng)基的配制1.培養(yǎng)基概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。2.種類a.按物理性質(zhì)分固體培養(yǎng)基（加瓊脂）：用于實驗室菌種的分離.鑒定.計數(shù)等液體培養(yǎng)基（不含凝固劑）：用于工業(yè)生產(chǎn)（擴大培養(yǎng)）b.按用途分選擇培養(yǎng)基：從眾多微生物中分離所需要的微生物鑒別培養(yǎng)基：鑒別不同種類的微生物c.按成分分天然培養(yǎng)基（有些成分未知）：用于工業(yè)生產(chǎn)合成培養(yǎng)基（各成分已知并按一定比例配制的）：用于實驗室分離.鑒定.計數(shù)比較概念舉例選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì)以促進所需要的微生物生長，抑制不需要的微生物生長培養(yǎng)基中加入青霉素：培養(yǎng)酵母菌和霉菌，抑制細菌生長加入高濃度食鹽，培養(yǎng)耐鹽菌，如金黃色葡萄球菌鑒別培養(yǎng)基根據(jù)微生物的代謝特點在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品在培養(yǎng)基中加入伊紅-亞甲藍：鑒別飲用水中是否含有大腸桿菌（菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤）3.培養(yǎng)基的成分a.1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)構成組分含量提供的主要營養(yǎng)牛肉膏5g碳源.磷酸鹽和維生素等蛋白胨10g氮源和維生素等NaCl5g無機鹽H2O定容至1000ml水b.營養(yǎng)成分：雖然各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都含有水.碳源.氮源.無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)此外，培養(yǎng)基還需滿足微生物生長對PH.特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及O2的需求例如培養(yǎng)乳酸桿菌—維生素；細菌—培養(yǎng)基調(diào)至中性或弱堿霉菌—培養(yǎng)基調(diào)至酸性；厭氧微生物—提供無氧條件碳源無機碳：CO2，NaHCO3—培養(yǎng)自養(yǎng)生物有機碳：葡萄糖，脂肪酸，花生粉，餅，石油等—提供異養(yǎng)生物氮源無機氮：N2,NH3,銨鹽，硝酸鹽有機氮：蛋白胨，尿素等（二）無菌技術1.獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是：防止外來雜菌的入侵消毒：是指使用較為溫和的物理.化學或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物滅菌：是指使用強烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢（抗逆性休眠體）和孢子（無性生殖細胞）對于操作的空間.操作者的衣著和手進行清潔和消毒用于微生物培養(yǎng)的器皿.接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行應避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸2.常用方法消毒煮沸消毒：100℃煮沸5~6min巴氏消毒：不耐高溫的液體，如牛奶在62-65℃消毒30min或80-90℃處理30s-1min可殺死牛奶中絕大多數(shù)微生物，并且不破壞牛奶的營養(yǎng)成分化學藥劑消毒：酒精擦拭雙手，用氯氣消毒水源等紫外線消毒：接種室，接種箱或超凈工作臺在使用前可用紫外線照射30min在照射前，適量噴灑石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液生物消毒法：利用生物或其代謝物除去環(huán)境中部分微生物滅菌濕熱滅菌：用沸水.流通蒸汽或高壓蒸汽進行滅菌的方法，其中高壓蒸汽滅菌效果最好。壓力100kpa，溫度121℃，維持15-30min（培養(yǎng)基滅菌）干熱滅菌：能耐高溫的，需要保持干燥的，如玻璃器皿（吸管，培養(yǎng)皿和金屬用具等）。溫度160-170℃的熱空氣中維持2-3h。灼燒滅菌：接種工具如涂布器.接種環(huán).接種針或其他金屬用具.直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，試管口.瓶口也可以灼燒滅菌。（三）微生物的純培養(yǎng)1.相關概念：培養(yǎng)物：將接種于培養(yǎng)基內(nèi)，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體純培養(yǎng)物：由一個單體繁殖所獲得的微生物群體純培養(yǎng)：獲得純培養(yǎng)物的過程2.常用接種方法：平板劃線法和稀釋涂布平板法平板劃線法：是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作目的是：將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體，這就是菌落。稀釋涂布平板法：則是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個菌落。3.實踐：酵母菌的純培養(yǎng)P12（1）原理：微生物群分散成單個細胞在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見的，有一定形態(tài)結(jié)構的子細胞群體，這就是群落。（2）方法：采用平板劃線法和稀釋涂布平板法將單個微生物分散在固體培養(yǎng)基上，之后經(jīng)培養(yǎng)得到的單一菌落一般是由單個微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物。（3）步驟制備培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基：馬鈴薯切塊+水煮軟爛過濾濾液+葡萄糖+瓊脂滅菌培養(yǎng)基：濕熱滅菌（高壓蒸汽滅菌），壓力100kpa，溫度121℃培養(yǎng)皿：干熱滅菌，溫度160-170℃滅菌2h倒平板：50℃左右，在酒精燈火焰附近倒平板接種和分離酵母菌：用平板劃線法接種，未接種的平板倒置培養(yǎng)酵母菌待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個放入28℃左右的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h（4）實驗結(jié)果的分析a.培養(yǎng)未接種的培養(yǎng)基的目的：是檢測培養(yǎng)基是否被雜菌污染（或檢測培養(yǎng)基制備是否合格）未接種的培養(yǎng)基表面若有菌落生長，則說明培養(yǎng)基被污染，應重新制備；若無菌落生長，則說明未被污染b.在接種酵母菌的培養(yǎng)基上可觀察到獨立的菌落，這些菌落在顏色.形狀和大小上相似，酵母菌落一般表面光滑，多呈乳白色c.若在培養(yǎng)基中觀察到不同形態(tài)的菌落，原因可能是菌液不純，混入其他雜菌，或在實驗操作過程中被雜菌污染附：平板劃線法操作步驟1）取菌液:灼燒接種環(huán)冷卻并拔棉塞試管口通過火焰蘸取一環(huán)菌液瓶口通過火焰并塞上棉塞2）第一次劃線：用接種環(huán)在培養(yǎng)基表面劃三至五條平行線3）重復劃線簡答：1.平板冷卻后為什么要將平板倒置？可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基造成污染2.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)？為什么？灼燒時期目的取菌種前殺死接種環(huán)上原有微生物每次劃線前殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數(shù)目逐漸減少，直至得到單個細胞接種結(jié)束后殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者3.若要按照如圖d進行劃線，那么在接種劃線的操作過程中，共灼燒了幾次接種環(huán)？圖中共劃了5個區(qū)域，在每次劃線前后均需要對接種環(huán)灼燒滅菌，因此共需要灼燒接種環(huán)6次。4.在第二次以及其后的劃線操作時，總是從上一次劃線的末端開始劃線的原因是？劃線后，線條末端酵母菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使酵母菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細胞繁殖而來的菌落。二.微生物的選擇培養(yǎng)與計數(shù)1.選擇培養(yǎng)基（1）自然界中目的菌的篩選a.實例：聚合酶鏈式反應（PCR）中用到的耐高溫的DNA聚合酶，就是從熱泉中篩選出來的水生棲熱菌中提取出來的。b.依據(jù)：水生棲熱菌能在70-80℃的高溫條件下生產(chǎn)，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存（生物與環(huán)境相適應）（2）實驗室中目的菌的篩選a.原理：人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養(yǎng).溫度和PH等）同時抑制或阻止其他微生物的生長。b.方法：利用選擇培養(yǎng)基分離選擇培養(yǎng)基：允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基2.微生物的選擇培養(yǎng)取菌液：取0.1ml菌液滴加到培養(yǎng)基上涂布器消毒：涂布器浸在酒精中涂布器滅菌：灼燒涂布器，待酒精燃盡，冷卻再涂布涂布平板取菌液：取0.1ml菌液滴加到培養(yǎng)基上涂布器消毒：涂布器浸在酒精中涂布器滅菌：灼燒涂布器，待酒精燃盡，冷卻再涂布涂布平板（2）稀釋涂布平板法的操作過程1）鏟去土樣2）等比稀釋（梯度稀釋）3）涂布平板（3）培養(yǎng)：待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入恒溫箱中培養(yǎng)1~2d3.微生物的數(shù)量測定（1）稀釋涂布平板法—活菌計數(shù)法（結(jié)果偏?。菏蔷鋽?shù)而不是活菌數(shù)）a.原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌b.計數(shù)原則1）為保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)為30-300的平板進行計數(shù)2）在設計試驗時，在同一稀釋度下，應至少對3個平板進行重復計數(shù)，然后求出平均值3）統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目少，這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示。（2）顯微鏡直接計數(shù)法（結(jié)果偏大：活菌+死菌）一種常用的，快速直觀的測定微生物數(shù)量的方法。該方法利用特定的細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板（比細菌計數(shù)板厚，常用于相對較大的酵母菌細胞，霉菌孢子等的計數(shù)P18）（3）計算公式每克樣品中的菌株數(shù)=稀釋的倍數(shù)·某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)/涂布平板時所用的稀釋液的體積（ml）即=C平M倍/V涂一般V涂=0.1ml簡答：用平板劃線法能否達到對細菌進行計數(shù)的目的？為什么？不能，平板劃線法最開始的劃線很可能菌類會長成一片，導致無法計數(shù)，此外灼燒接種環(huán)時，也會殺死一部分菌類。實踐（一）土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)1.實驗目的:（1）從土壤中分離出能分解尿素的細菌（2）統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟有多少這樣的細菌2.背景：土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為能合成脲酶CO(NH2)2+H2O脲酶CO2+2NH3NH3會使培養(yǎng)基的堿性增強.PH升高.以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，我們就可以準確地鑒定該菌種能夠分解尿素3.篩選菌株：配制以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基4.設置對照：目的是排出非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。如a.培養(yǎng)物中是否含有雜菌污染—可設置未涂布的平板做空白對照（或接種無菌水）b.選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落—可用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基做對照如果牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。5.實驗流程土壤取樣梯度稀釋涂布平板微生物的培養(yǎng)與觀察注：土壤取樣時，一般要鏟去表層土，因為細菌適宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大多數(shù)分布在距地表3~8cm的土壤層在實際操作中，通常選用一定稀釋范圍的樣品進行培養(yǎng)，細菌一般選104.105.106的稀釋液進行平板培養(yǎng)，目的是以保證獲得菌落數(shù)在30-300之間，適于計數(shù)的平板細菌一般在30-37℃溫度下培養(yǎng)1~2d，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，原因是這樣可以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目菌落特征包括：菌落的形狀.大小.隆起度和顏色等簡答：利用尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基分離出的微生物都是能分解尿素的微生物嗎？不一定，因為有些微生物可以利用尿素分解菌的代謝產(chǎn)物進行生長繁殖。（二）分解纖維素的微生物的分離一.基礎知識（1）纖維素和纖維素酶纖維素酶是一種復合酶，至少包括三種組分，即C1酶.CX酶.葡萄糖苷酶。纖維素C1酶.CX酶纖維二糖葡萄糖苷酶葡萄糖（2）纖維素分解菌的篩選—剛果紅染色法原理：剛果紅染料能與纖維素這樣的多糖形成紅色復合物，當纖維