生物相容性評估-細(xì)胞毒性試驗(yàn)解析

7/7生物相容性評估-細(xì)胞毒性試驗(yàn)解析#概述

為了防止醫(yī)療器械在臨床使用時(shí)引起不良反應(yīng)，醫(yī)療器械生產(chǎn)商需要根據(jù)ISO或者GB/T提供的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生物相容性評估。作為生物相容性測試的重要組成部分，體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)具有通用性，廣泛適用于各種醫(yī)療器械和材料的評價(jià)。該測試并不是單一的試驗(yàn)方法，而是規(guī)定一個(gè)試驗(yàn)方案，需要在一系列試驗(yàn)步驟中判斷，以選出最合適的試驗(yàn)。細(xì)胞毒性根據(jù)檢測終點(diǎn)可以分為：形態(tài)觀察，細(xì)胞增殖，細(xì)胞代謝。常見的細(xì)胞毒性試驗(yàn)有：細(xì)胞MEM洗脫試驗(yàn)，MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)，直接接觸法細(xì)胞毒性試驗(yàn)，中性紅攝取細(xì)胞毒性試驗(yàn)，克隆形成細(xì)胞毒性試驗(yàn)，瓊脂擴(kuò)散法細(xì)胞毒性試驗(yàn)，相對增殖度法細(xì)胞毒性試驗(yàn)，XTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)等。

培養(yǎng)中的細(xì)胞

細(xì)胞毒性的判斷

細(xì)胞毒性測試是最常用的生物相容性測試，主要測試化學(xué)物質(zhì)存在于浸提液中的化學(xué)物質(zhì)可能會對細(xì)胞的形態(tài)、增殖等方面產(chǎn)生的影響。根據(jù)GB16886.1標(biāo)準(zhǔn)，無論臨床用途如何，只要與人直接或間接接觸，該測試是推薦做的。在眾多生物相容性測試中，細(xì)胞毒性試驗(yàn)成本低，測試較為簡單，周期相對短，并且不必使用動(dòng)物。但是該項(xiàng)測試因一般使用體外細(xì)胞系，測試系統(tǒng)非常敏感，在生物相容性測試失敗的產(chǎn)品案例中細(xì)胞毒性占多數(shù)，所以生產(chǎn)商應(yīng)當(dāng)對該項(xiàng)試驗(yàn)格外重視。在ISO，GB/T，USP，YBB，ASTM中均有具體的細(xì)胞毒性測試方法，所謂細(xì)胞毒性陽性或者失敗，全面的說法應(yīng)該是在哪一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)下哪一個(gè)試驗(yàn)類型中測試結(jié)果為陽性。

常見的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果判定總結(jié)如下：

MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯色

影響細(xì)胞毒性的因素舉例

pH

由于大多數(shù)細(xì)胞適宜生存的pH為7.2-7.4，偏離此范圍可能對細(xì)胞生長將產(chǎn)生有害的影響。產(chǎn)品生產(chǎn)或者加工工藝中引入的酸或者堿都會通過浸提進(jìn)入培養(yǎng)基。一般細(xì)胞毒性試驗(yàn)使用的貼壁細(xì)胞如L-929，會因pH的波動(dòng)停止生長或者出現(xiàn)形態(tài)變圓、皺縮，從而表現(xiàn)出顯著細(xì)胞毒性。

金屬

用于醫(yī)療器械制造的金屬，如銅、鉻和鋅，是人體某些酶發(fā)揮作用所必需的。然而，在較高的劑量或者通過某些途徑暴露時(shí)，這些金屬可能導(dǎo)致中毒，在體內(nèi)引起局部和全身的不良反應(yīng)。鎘，鈷、鎳、鋁和鈦離子已被證明具有誘變作用，并根據(jù)暴露的劑量和途徑被歸為具有可能或已證明的致癌元素。金屬離子往往還是影響細(xì)胞滲透壓的主要因素。病患接觸到的金屬/化合物的劑量決定了該金屬/化合物是否會引起毒性，是否含有該類成分不是引起毒性的充分條件。金屬離子會氧化攻擊細(xì)胞內(nèi)部的重要結(jié)構(gòu)成分，產(chǎn)生活性自由基（例如，活性氧或氮物質(zhì)），可以對細(xì)胞核、蛋白質(zhì)、和/或脂質(zhì)產(chǎn)生毒性。例如，Cr顯示為強(qiáng)效羥基自由基金屬，會導(dǎo)致DNA鏈斷裂。然而值得注意的是，六價(jià)鉻比三價(jià)鉻遺傳毒性高四倍，研究表明一些金屬離子，如Co和Ni，可以直接與DNA聚合酶結(jié)合，或者影響其保真度增加將不正確的核苷酸摻入新合成的DNA鏈的幾率。金屬離子導(dǎo)致細(xì)胞毒性有很多途徑，目前仍在研究中。如下是常見金屬離子在L929細(xì)胞系中的IC50信息[8]。

增塑劑

市場上許多醫(yī)療器械是塑料制品如血袋，管路，注射器，該類產(chǎn)品絕大部分需要是要加增塑劑，如鄰苯二甲酸物質(zhì)，丙二酚，以增加柔韌性和彈性。鄰苯二甲酸酯(DEHP)及其代謝產(chǎn)物會引起一定毒性如內(nèi)分泌紊亂。其替代物還有對苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHT)，偏苯三酸三辛酯(TOTM)，非鄰苯二甲酸類還有1,2-環(huán)己烷二甲酸二異壬酯（DINCH）、雙（2-乙基己基）己二酸、乙酰基檸檬酸三丁酯等。每一種增塑劑從材料中遷移的速率取決于增塑劑和嵌入塑料的特性。不同增塑劑在50%乙醇溶液中從PVC管中提取的遷移率有很大差異，TOTM的釋放率比DEHP低20倍。DEHT從PVC浸提出的速度比DEHP小三倍。根據(jù)于醫(yī)療器械的特性，其他因素也可能影響塑化劑的釋放，如PVC輸液管路的流速。

最常見的MEHPs，對苯二甲酸單(2-乙基己基)酯，2-乙基己二酸單-2-乙基己二酸，單-鄰苯二甲酸異壬基酯，會比母體增塑劑(DEHP,DINP和DINCH)更容易引起對L929細(xì)胞更強(qiáng)的細(xì)胞毒性表現(xiàn)。MEHPs已被證明在濃度低至0.01mg/mL(10μg/mL或10ppm)時(shí)就可能影響細(xì)胞活力[8]。

增塑劑舉例及其IC50數(shù)據(jù)信息見下表：

滲透壓

滲透壓是溶液本身的一種性質(zhì)，所謂溶液滲透壓，簡單來說，是指溶液中溶質(zhì)微粒對水的吸引力。溶液滲透壓的大小取決于單位體積溶液中溶質(zhì)微粒的數(shù)目，溶質(zhì)微粒越多，即溶液濃度越高，對水的吸引力越大，溶液滲透壓越高；反過來，溶液微粒少，即溶液濃度越低，溶液滲透壓越低。一般來說可溶物均對滲透壓有一定的影響。常規(guī)培養(yǎng)基能夠給細(xì)胞毒性試驗(yàn)所用的細(xì)胞系穩(wěn)定的增殖環(huán)境，但是當(dāng)醫(yī)療器械浸提液將此平衡打破，細(xì)胞的正常增殖將會受到影響，因此沒有高毒性或者特定毒性機(jī)制的金屬離子，酸根離子等也會在某些濃度影響細(xì)胞毒性。

如何看待細(xì)胞毒性

因毒性皺縮變圓的細(xì)胞

作為一個(gè)較為敏感的檢測終點(diǎn)，是否能通過細(xì)胞毒性測試是監(jiān)管高度關(guān)注的問題。醫(yī)療器械可能含有醛類、醇類、金屬離子、增塑劑或其他可能對其產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用的材料，這些細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果說明了是細(xì)胞在接觸對某些化學(xué)物質(zhì)有很大的反應(yīng)。然而，這些效應(yīng)并不總是與體內(nèi)全身毒性或臨床效應(yīng)相關(guān)，盡管細(xì)胞毒性試驗(yàn)有一定的局限，但它是一項(xiàng)強(qiáng)制性試驗(yàn)，在提交市場許可之前，必須對每個(gè)醫(yī)療器械進(jìn)行測試。如直接接觸法細(xì)胞毒性試驗(yàn)、克隆形成法細(xì)胞毒性試驗(yàn)、如MEM洗脫試驗(yàn)、中性紅試驗(yàn)和MTT試驗(yàn)，可以提供有價(jià)值的體外細(xì)胞毒性的數(shù)據(jù)，但往往高估了可能引起的體內(nèi)不良反應(yīng)，因此并不總是準(zhǔn)確有效的對應(yīng)臨床反應(yīng)?；诩?xì)胞的測試方法所表現(xiàn)出的毒性不一定說明在動(dòng)物體內(nèi)或者臨床患者身上引起毒性，例如，一些醫(yī)療器械浸提出的可溶性金屬離子（例如，鈉、銅、鎳）通過改變細(xì)胞生長環(huán)境對細(xì)