抗生素類藥物的質(zhì)量分析方法(一)課件

抗生素類藥物的質(zhì)量分析方法（一）

氨基糖苷類抗生素抗生素類藥物的質(zhì)量分析方法（一）1概況抗生素是指在低濃度下即能殺滅或抑制其他病原微生物的藥物，按其結構可以分為β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類及其他抗生素。氨基糖苷類抗生素是由氨基環(huán)醇與氨基糖縮合而成的一類多羥基抗生素，是臨床上常用的一類廣譜抗生素。可通過微生物發(fā)酵或半合成而制得。目前藥典收載的品種主要有：鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、依替米星、慶大霉素、新霉素等概況抗生素是指在低濃度下即能2結構——慶大霉素結構——慶大霉素3結構——鏈霉素結構——鏈霉素4一、藥典方法

中國藥典(2000年版)，美國藥典(25版)、英國藥典(2000年版)對氨基糖苷類抗生素的含量測定大多采用微生物法，有關物質(zhì)的檢查大多采用薄層色譜法或反相高效液相色譜法。微生物法作為一種經(jīng)典的方法，仍被各國藥典所采用。本法系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用，采用量反應平行線原理設計，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價。微生物法所需設備簡單，價格低廉，但影響因素復雜，操作費時。以下介紹本組同學查閱的其他方法：一、藥典方法中國藥典(2000年版)，美國藥典(25版)5一、色譜分析法氣相色譜法(GC)

高效液相色譜法(HPLC)

離子交換色譜法（IEC）薄層色譜法(TLC)

高效毛細管電泳法(HPCE)一、色譜分析法氣相色譜法(GC)6氣相色譜法(GC)

氨基糖苷類抗生素為非揮發(fā)性化合物，且在紫外可見光區(qū)無吸收，須先進行衍生化，使其適于分析。HoebusL等用六甲基二硅烷柱前衍生測定大觀霉素，用填充柱氣相色譜法，氫火焰離子化檢測器檢測，在75％一125％的濃度范圍內(nèi)，呈良好的線性，雜質(zhì)的定量限為0.1％。PreuL等選擇適當?shù)难苌噭?，采用毛細管氣相色譜。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術分析氨基糖苷類抗生素也是應用比較廣泛的一種聯(lián)用技術。

氣相色譜法(GC)

氨基糖苷類抗生素為非揮發(fā)性化合物7高效液相色譜法(HPLC)

HPLC測定此類藥物含量大多采用反相色譜或離子對色譜系統(tǒng)，根據(jù)檢測手段的不同可分為紫外檢測、熒光檢測、電化學檢測及質(zhì)譜檢測等。柱前衍生反相HPLC是此類藥物最為常用的一種測定方法。中國藥典采用鄰苯二甲醛(0PA)柱前衍生化，紫外檢測硫酸慶大霉素C組份。同時，有報道用柱后衍生，熒光檢測食品中的鏈霉素殘留量。為了避免使用衍生化試劑，可以采用靈敏度較高的電化學檢測器及采用LC-MS聯(lián)用技術。LC-MS將HPLC的高分離效能和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度及豐富的結構信息相結合，已成為重要的分離分析方法之一。高效液相色譜法(HPLC)HPLC測定此類藥物含量大8離子交換色譜法（IEC）采用高效陰離子交換色譜分離硫酸慶大霉素、硫酸新霉素和硫酸奈替米星及其雜質(zhì)，然后采用積分脈沖安培檢測進行直接測定，不需衍生，簡便快速。缺點：檢測器的靈敏度對藥物中的微量雜質(zhì)仍顯不足，體系對有些組分的分離不盡理想，重現(xiàn)性較差來源：儀器分析網(wǎng)離子交換色譜法（IEC）采用高效陰離子交換色譜分離硫酸慶大霉9HPLC—蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC—ELSD)

近年來出現(xiàn)的蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)由于其響應值不依賴被測物質(zhì)的光學性質(zhì)，任何揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被檢測，并且物理性質(zhì)相似的物質(zhì)其響應因子基本一致，靈敏度是示差折光檢測器的2-10倍，現(xiàn)已逐漸成為目前常用的通用型檢測器。在用HPLC-ELSD法測定硫酸小諾霉素(C2b)注射液時發(fā)現(xiàn)有些樣品含有慶大霉素C1a雜質(zhì)；在分析慶大霉素C組分時發(fā)現(xiàn)有的樣品在C2與C2a峰之間有小諾霉素(C2b)雜質(zhì)峰。由此看出，蒸發(fā)光散射檢測器的應用已為全面分析無紫外吸收的氨基糖苷類抗生素的質(zhì)量提供了一種新的手段。但本法也有一些不足之處，例如靈敏度比紫外檢測的低(2—3個數(shù)量級)．數(shù)據(jù)處理相對繁瑣。HPLC—蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC—ELSD)

近年來出10薄層色譜法(TLC)

TLC作為一種定性的方法鑒別氨基糖苷類抗生素已被各國藥典廣泛采用。掃描密度計與TLC技術相結合產(chǎn)生的高效薄層色譜法(HPTLC)因其靈敏度、分離度和準確度都有很大提高，已用于藥物定量分析。TLC具有使用范圍廣，樣品預處理簡單，優(yōu)化展開劑的組成方便等優(yōu)點，隨著吸附劑高效化，定量分析儀器化、自動化，TLC仍然是不可替代的一種分析方法。薄層色譜法(TLC)

TLC作為一種定性的方法鑒別氨基糖苷11高效毛細管電泳法(HPCE)

HPCE是一類以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相色譜分離技術。根據(jù)分離模式的不同，又可分為毛細管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細管等電聚焦(CIEF)、毛細管凝膠電泳(CEC)，膠束電動毛細管色譜(MEKC)等。氨基糖苷類抗生素的HPCE檢測方法，最為常用的是柱前及柱內(nèi)衍生的CZE技術，然后進行紫外檢測。高效毛細管電泳法(HPCE)

HPCE是一類以毛細管12二、免疫法(IA)

IA是近年發(fā)展起來的一種用于體內(nèi)藥物監(jiān)測的分析方法，將分析方法與免疫原理相結合，進行超微量分析，具有靈敏度高、特異性強、用樣少等優(yōu)點。根據(jù)對抗原標記方法不同，IA可分為放射免疫法(RIA)，酶免疫法(EIA)，熒光免疫法(FIA)，化學發(fā)光免疫法(CLIA)，毛細管電泳免疫分析法（CEIA)和濁度免疫分析法。二、免疫法(IA)

IA是近年發(fā)展起來的一種用于體內(nèi)藥物監(jiān)測13三、流動注射法(FIA)

流動注射法(FIA)是一種自動分析法，適用于醫(yī)院制劑的快速檢驗及中間體質(zhì)量控制。用恒流量泵使硫酸鐵銨試劑和載液(水)流過內(nèi)徑為0.5lmm的四氟乙烯泵管，與進樣口注量的一定濃度硫酸鏈霉素水溶液在反應圈中混合，反應呈包，于520nm處用721分光光計測A，通過對數(shù)轉(zhuǎn)換器，在記錄儀上獲得相應的峰高。硫酸鏈霉素呈色原理：硫酸鏈霉素在NaOH中水解成麥芽酚，與Fe3+呈色，在520nm處有最大吸收峰。三、流動注射法(FIA)流動注射法(FIA)是一種14四、絡合物光度法

絡合物光度法利用金屬離子或有機試劑與氨基糖苷類抗生素形成有色絡合物，如依文思藍、曲利本紅、曲利本藍、滂胺天藍等。應用的方法有顯色法、褪色法和雙波長疊加法對其進行含量測定。四、絡合物光度法絡合物光度法利用金屬離子或有機試劑與氨基糖15如依文思藍所例；

硫酸新霉素、卡那霉素、慶大霉素和妥布霉素4種氨基糖苷類抗生素均為飽和烴的取代衍生物，分子結構中只含σ鍵和非鍵電子(n)，而σ一σ*，n一σ*

躍遷需要的能量較高，其吸收光譜帶位于遠紫外區(qū)。在200~800nm波長范圍幾乎無吸收。依文思藍(EB)系酸性雙偶氮染料，它具有大的共軛體系，在紫外—可見光區(qū)產(chǎn)生強烈吸收，其最大吸收波長為609nm。當上述4種氨基糖昔類抗生素與EB染料反應形成絡合物后，其最大吸收波峰視其抗生素不同而分別紅移幾或幾十納米，吸光度有不同程度的增大，但在染料最大吸收波長附近，即產(chǎn)生褪色反應

如依文思藍所例；

硫酸新霉素、卡那霉素、慶大霉素和妥布霉素416苯胺藍

在酸性條件下，苯胺藍的多個磺酸基上的質(zhì)子離解而以陰離子狀態(tài)存在，此時卡那霉素則以陽離子形式存在，兩者共存時，由于靜電引力和電荷轉(zhuǎn)移作用形成復合物使水溶苯胺藍溶液褪色。苯胺藍在酸性條件下，苯胺藍的多個磺酸基上的質(zhì)子17五、脈沖極譜法

原理鏈毒素由鏈霉胍、鏈霉糖和N—甲基—L—葡萄糖胺三部分以糖苷鍵彼此相連構。鏈霉胍結構中含有兩個—C＝NH，在滴汞電極上可以發(fā)生氧化還原反應產(chǎn)生陰極波。實驗選用滴汞電極為工作電極，滴汞間隔為15秒鐘，Ag-AgCl電極為參比電極，內(nèi)裝1.0mol/L的KCl參比溶液。選用微鉑電極為輔助電極，以穩(wěn)定電極電壓。藥物濃度在200~700u/ml時，藥物濃度與導數(shù)峰電流呈線性關系，且線性關系極為顯著。五、脈沖極譜法原理鏈毒素由鏈霉胍、鏈霉糖和N—甲基—L18六、吸附伏安法

B-R+(CH3)2CHCH0體系中，該類抗生素的吸附伏安行為認為其電極反應過程為化學反應(Schiff堿反應)——吸附富集(在-1.35v左右)——不可逆還原過程，測得參加反應的電子數(shù)為2，氫離子數(shù)為1，并導出了反應方程式。對不同醛作衍生化劑的情況作比較發(fā)現(xiàn)，在陰極掃描過程中，以異丁醛衍生化劑所得的還原峰，比相應的甲醛、乙醛衍生物的還原峰靈敏度高，峰形對稱，重現(xiàn)性好。傅曉航張黎明異丁醛存在下氨基糖苷類抗生素吸附伏安法研究浙江樹人大學學報第3卷第2期2003年3月六、吸附伏安法

B-R+(CH3)2CHCH0體系中，該類抗19其他方法

旋光法---旋光法快速測定硫酸卡那霉素注射液的含量黃而娟等旋光法快速測定硫酸卡那雷素注射液的含量吉林畜牧獸醫(yī)2004年第4期在氨基糖苷類抗生素的定性檢測方面，核磁共振波譜(NMR)作為一種新型的技術已被用于此類物質(zhì)的構型研究。其他方法旋光法---旋光法快速測定硫酸卡那霉素注射液的含量20在該類抗生素的體內(nèi)藥物監(jiān)測方面，自動的免疫試劑盒仍然是首選的方法。色譜技術和毛細管電泳技術以其專一性強、分辨率高，操作簡便等特點，將逐步取代微生物法等準確度低、精密度差的方法。隨著MS技術在定量方面的進一步完善，和LC、GC聯(lián)用，將成為此類藥物分析中一種必不可少的檢測手段，最具有前景的將是CE-MS聯(lián)用技術。在該類抗生素的體內(nèi)藥物監(jiān)測方面，自動的免疫試劑盒仍然是首選的21That’sall

ThankyouThat’sallThankyou22抗生素類藥物的質(zhì)量分析方法（一）

氨基糖苷類抗生素抗生素類藥物的質(zhì)量分析方法（一）23概況抗生素是指在低濃度下即能殺滅或抑制其他病原微生物的藥物，按其結構可以分為β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類及其他抗生素。氨基糖苷類抗生素是由氨基環(huán)醇與氨基糖縮合而成的一類多羥基抗生素，是臨床上常用的一類廣譜抗生素?？赏ㄟ^微生物發(fā)酵或半合成而制得。目前藥典收載的品種主要有：鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、依替米星、慶大霉素、新霉素等概況抗生素是指在低濃度下即能24結構——慶大霉素結構——慶大霉素25結構——鏈霉素結構——鏈霉素26一、藥典方法

中國藥典(2000年版)，美國藥典(25版)、英國藥典(2000年版)對氨基糖苷類抗生素的含量測定大多采用微生物法，有關物質(zhì)的檢查大多采用薄層色譜法或反相高效液相色譜法。微生物法作為一種經(jīng)典的方法，仍被各國藥典所采用。本法系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用，采用量反應平行線原理設計，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價。微生物法所需設備簡單，價格低廉，但影響因素復雜，操作費時。以下介紹本組同學查閱的其他方法：一、藥典方法中國藥典(2000年版)，美國藥典(25版)27一、色譜分析法氣相色譜法(GC)

高效液相色譜法(HPLC)

離子交換色譜法（IEC）薄層色譜法(TLC)

高效毛細管電泳法(HPCE)一、色譜分析法氣相色譜法(GC)28氣相色譜法(GC)

氨基糖苷類抗生素為非揮發(fā)性化合物，且在紫外可見光區(qū)無吸收，須先進行衍生化，使其適于分析。HoebusL等用六甲基二硅烷柱前衍生測定大觀霉素，用填充柱氣相色譜法，氫火焰離子化檢測器檢測，在75％一125％的濃度范圍內(nèi)，呈良好的線性，雜質(zhì)的定量限為0.1％。PreuL等選擇適當?shù)难苌噭?，采用毛細管氣相色譜。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術分析氨基糖苷類抗生素也是應用比較廣泛的一種聯(lián)用技術。

氣相色譜法(GC)

氨基糖苷類抗生素為非揮發(fā)性化合物29高效液相色譜法(HPLC)

HPLC測定此類藥物含量大多采用反相色譜或離子對色譜系統(tǒng)，根據(jù)檢測手段的不同可分為紫外檢測、熒光檢測、電化學檢測及質(zhì)譜檢測等。柱前衍生反相HPLC是此類藥物最為常用的一種測定方法。中國藥典采用鄰苯二甲醛(0PA)柱前衍生化，紫外檢測硫酸慶大霉素C組份。同時，有報道用柱后衍生，熒光檢測食品中的鏈霉素殘留量。為了避免使用衍生化試劑，可以采用靈敏度較高的電化學檢測器及采用LC-MS聯(lián)用技術。LC-MS將HPLC的高分離效能和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度及豐富的結構信息相結合，已成為重要的分離分析方法之一。高效液相色譜法(HPLC)HPLC測定此類藥物含量大30離子交換色譜法（IEC）采用高效陰離子交換色譜分離硫酸慶大霉素、硫酸新霉素和硫酸奈替米星及其雜質(zhì)，然后采用積分脈沖安培檢測進行直接測定，不需衍生，簡便快速。缺點：檢測器的靈敏度對藥物中的微量雜質(zhì)仍顯不足，體系對有些組分的分離不盡理想，重現(xiàn)性較差來源：儀器分析網(wǎng)離子交換色譜法（IEC）采用高效陰離子交換色譜分離硫酸慶大霉31HPLC—蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC—ELSD)

近年來出現(xiàn)的蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)由于其響應值不依賴被測物質(zhì)的光學性質(zhì)，任何揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被檢測，并且物理性質(zhì)相似的物質(zhì)其響應因子基本一致，靈敏度是示差折光檢測器的2-10倍，現(xiàn)已逐漸成為目前常用的通用型檢測器。在用HPLC-ELSD法測定硫酸小諾霉素(C2b)注射液時發(fā)現(xiàn)有些樣品含有慶大霉素C1a雜質(zhì)；在分析慶大霉素C組分時發(fā)現(xiàn)有的樣品在C2與C2a峰之間有小諾霉素(C2b)雜質(zhì)峰。由此看出，蒸發(fā)光散射檢測器的應用已為全面分析無紫外吸收的氨基糖苷類抗生素的質(zhì)量提供了一種新的手段。但本法也有一些不足之處，例如靈敏度比紫外檢測的低(2—3個數(shù)量級)．數(shù)據(jù)處理相對繁瑣。HPLC—蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC—ELSD)

近年來出32薄層色譜法(TLC)

TLC作為一種定性的方法鑒別氨基糖苷類抗生素已被各國藥典廣泛采用。掃描密度計與TLC技術相結合產(chǎn)生的高效薄層色譜法(HPTLC)因其靈敏度、分離度和準確度都有很大提高，已用于藥物定量分析。TLC具有使用范圍廣，樣品預處理簡單，優(yōu)化展開劑的組成方便等優(yōu)點，隨著吸附劑高效化，定量分析儀器化、自動化，TLC仍然是不可替代的一種分析方法。薄層色譜法(TLC)

TLC作為一種定性的方法鑒別氨基糖苷33高效毛細管電泳法(HPCE)

HPCE是一類以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相色譜分離技術。根據(jù)分離模式的不同，又可分為毛細管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細管等電聚焦(CIEF)、毛細管凝膠電泳(CEC)，膠束電動毛細管色譜(MEKC)等。氨基糖苷類抗生素的HPCE檢測方法，最為常用的是柱前及柱內(nèi)衍生的CZE技術，然后進行紫外檢測。高效毛細管電泳法(HPCE)

HPCE是一類以毛細管34二、免疫法(IA)

IA是近年發(fā)展起來的一種用于體內(nèi)藥物監(jiān)測的分析方法，將分析方法與免疫原理相結合，進行超微量分析，具有靈敏度高、特異性強、用樣少等優(yōu)點。根據(jù)對抗原標記方法不同，IA可分為放射免疫法(RIA)，酶免疫法(EIA)，熒光免疫法(FIA)，化學發(fā)光免疫法(CLIA)，毛細管電泳免疫分析法（CEIA)和濁度免疫分析法。二、免疫法(IA)

IA是近年發(fā)展起來的一種用于體內(nèi)藥物監(jiān)測35三、流動注射法(FIA)

流動注射法(FIA)是一種自動分析法，適用于醫(yī)院制劑的快速檢驗及中間體質(zhì)量控制。用恒流量泵使硫酸鐵銨試劑和載液(水)流過內(nèi)徑為0.5lmm的四氟乙烯泵管，與進樣口注量的一定濃度硫酸鏈霉素水溶液在反應圈中混合，反應呈包，于520nm處用721分光光計測A，通過對數(shù)轉(zhuǎn)換器，在記錄儀上獲得相應的峰高。硫酸鏈霉素呈色原理：硫酸鏈霉素在NaOH中水解成麥芽酚，與Fe3+呈色，在520nm處有最大吸收峰。三、流動注射法(FIA)流動注射法(FIA)是一種36四、絡合物光度法

絡合物光度法利用金屬離子或有機試劑與氨基糖苷類抗生素形成有色絡合物，如依文思藍、曲利本紅、曲利本藍、滂胺天藍等。應用的方法有顯色法、褪色法和雙波長疊加法對其進行含量測定。四、絡合物光度法絡合物光度法利用金屬離子或有機試劑與氨基糖37如依文思藍所例；

硫酸新霉素、卡那霉素、慶大霉素和妥布霉素4種氨基糖苷類抗生素均為飽和烴的取代衍生物，分子結構中只含σ鍵和非鍵電子(n)，而σ一σ*，n一σ*

躍遷需要的能量較高，其吸收光譜帶位于遠紫外區(qū)。在200~800nm波長范圍幾乎無吸收。依文思藍(EB)系酸性雙偶氮染料，它具有大的共軛體系，在紫外—可見光區(qū)產(chǎn)生強烈吸收，其最大吸收波長為609nm。當上述4種氨基糖昔類抗生素與EB染料反應形成絡合物后，其最大吸收波峰視其抗生素不同而分別紅移幾或幾十納米，吸光度有不同程度的增大，但在染料最大吸收波長附近，即產(chǎn)生褪色反應

如依文思藍所例；

硫酸新霉素、卡那霉素、慶大霉素和妥布霉素438苯胺藍

在酸性條件下，苯胺藍的多個磺酸基上的質(zhì)子離解而以陰離子狀態(tài)存在，此時卡那霉素則以陽離子形式存在，兩者共存時，由于靜電引力和電荷轉(zhuǎn)移作用形成復合物使水溶苯胺藍溶液褪色。苯胺藍在酸性條件下，苯胺藍的多個磺酸基上的質(zhì)子39五、脈沖極譜法

原理鏈毒素由鏈霉胍、鏈霉糖和N—甲基—L—葡萄糖胺三部分以糖苷鍵彼此相連構。鏈霉胍結構中含有兩個—C＝NH，在滴汞電極上可以發(fā)生氧化還原反應產(chǎn)生陰極波。實驗選用滴汞電極