基因工程菌培養(yǎng)課件

基因工程菌培養(yǎng)1基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌培養(yǎng)1基因工程菌培養(yǎng)什么是基因工程菌？為什么要構(gòu)建基因工程菌？遺傳性狀的改良代謝途徑的加工

生物反應(yīng)器2基因工程菌培養(yǎng)什么是基因工程菌？2基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的構(gòu)建

宿主菌：大腸桿菌作為外源基因表達的宿主,遺傳背景清楚,技術(shù)操作簡單,培養(yǎng)條件簡單,大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟,是應(yīng)用最廣泛,最成功的表達體系

外源基因：質(zhì)粒3基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的構(gòu)建3基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌生長的特點：外源基因與宿主的互相影響產(chǎn)物，資源的爭奪基因工程菌與普通微生物發(fā)酵有什么區(qū)別？

4基因工程菌培養(yǎng)4基因工程菌培養(yǎng)微生物發(fā)酵主要收獲的是它們的初級或次級代謝產(chǎn)物，細(xì)胞生長并非主要目標(biāo)?；蚬こ叹囵B(yǎng)是為了獲得最大量的基因表達產(chǎn)物。這類物質(zhì)是相對獨立于細(xì)胞染色體之外的重組質(zhì)粒上的外源基因所合成的、細(xì)胞并不需要的蛋白質(zhì)。5基因工程菌培養(yǎng)微生物發(fā)酵主要收獲的是它們的初級或次級代謝產(chǎn)基因工程菌發(fā)酵的設(shè)備氣升式發(fā)酵罐的優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單，不易污染，能耗低，操作簡單，低剪切力,適合高濃度發(fā)酵?；蚬こ叹鶎羟辛Ω鼮槊舾校╳hy？）6基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌發(fā)酵的設(shè)備氣升式發(fā)酵罐的優(yōu)點：6基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的高密度發(fā)酵在基因工程菌的發(fā)酵中，菌體的增殖和產(chǎn)物的表達都是在對數(shù)期內(nèi)完成的，因此，發(fā)酵工藝的改進就集中在如何延長工程菌的對數(shù)生長時間，縮短衰亡時間高密度發(fā)酵工藝是基因工程菌發(fā)酵的主要生產(chǎn)工藝7基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的高密度發(fā)酵在基因工程菌的發(fā)酵中，菌體的增殖和產(chǎn)高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的要求高密度發(fā)酵要獲得高生物量和高濃度表達產(chǎn)物,需投入幾倍于生物量的基質(zhì)以滿足細(xì)菌迅速生長繁殖及大量表達基因產(chǎn)物的需要。成分的要求：使用甘油的原因？濃度的要求8基因工程菌培養(yǎng)高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的要求8基因工程菌培養(yǎng)在培養(yǎng)基中加入重組蛋白表達的前體氨基酸和一些能量物質(zhì)有利于蛋白表達量的提高。比如利用重組大腸桿菌生產(chǎn)谷胱甘肽(ＧＳＨ)時,在發(fā)酵開始和進行12ｈ后,各添加2.0ｇ/Ｌ腺苷三磷酸(ＡＴＰ)和9ｍｍｏｌ/Ｌ前體氨基酸,可以使細(xì)胞濃度和ＧＳＨ的產(chǎn)量分別比不添加這兩種物質(zhì)提高24%和1.4倍9基因工程菌培養(yǎng)在培養(yǎng)基中加入重組蛋白表達的前體氨基酸和一些能量物質(zhì)有利于蛋培養(yǎng)方式分批補料培養(yǎng)方式補充營養(yǎng)稀釋代謝產(chǎn)物分離與培養(yǎng)耦合固定化培養(yǎng)技術(shù)固定化技術(shù)與連續(xù)培養(yǎng)，透析培養(yǎng)相結(jié)合是基因工程菌發(fā)酵的發(fā)展方向10基因工程菌培養(yǎng)培養(yǎng)方式分批補料培養(yǎng)方式10基因工程菌培養(yǎng)接種量的控制接種量對基因表達的影響不大,但對菌體生長影響較明顯。接種量小(0.5%～4%)時,比生長速率大,對數(shù)生長期持續(xù)時間長;接種量大(>8%)時,細(xì)菌較快地達到了穩(wěn)定期,持續(xù)生長時間短,自溶也較快。11基因工程菌培養(yǎng)接種量的控制接種量對基因表達的影響不大,但對菌體生長影響較明接種量過小，延遲期太長較接種量大，可縮短生長延遲期，菌體迅速繁衍，很快進入對數(shù)生長期，適于表達外源基因。接種量過高，使菌體生長過快，代謝物積累過多，反而會抑制后期菌體的生長。12基因工程菌培養(yǎng)接種量過小，延遲期太長12基因工程菌培養(yǎng)發(fā)酵中溶解氧的控制純氧？富氧！添加提高傳氧能力的VHb蛋白，添加H2O2，血紅蛋白，小球藻。溶氧過高或局部過高，會使某些微生物氧中毒13基因工程菌培養(yǎng)發(fā)酵中溶解氧的控制純氧？富氧！13基因工程菌培養(yǎng)pH值的控制在高密度發(fā)酵條件下,細(xì)胞產(chǎn)生大量的乙酸和ＣＯ2,可使ｐＨ值顯著降低。常用于控制ｐＨ的酸堿有ＨＣｌ,ＮａＯＨ和氨水等,其中氨水常被使用,因為它還具有補充氮源的作用。但有研究發(fā)現(xiàn),ＮＨ4+濃度對大腸桿菌的生長有很大影響,當(dāng)ＮＨ4+濃度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ時會嚴(yán)重抑制大腸桿菌的生長。

14基因工程菌培養(yǎng)pH值的控制在高密度發(fā)酵條件下,細(xì)胞產(chǎn)生大量的乙酸和ＣＯ2,培養(yǎng)溫度高溫提高生長速度低溫增加重組菌穩(wěn)定性對于溫度敏感重組菌,發(fā)酵過程一般分為生長和表達兩個階段,分別維持不同的培養(yǎng)溫度。但也會因為升溫而引起質(zhì)粒的丟失,而減少重組蛋白量。

15基因工程菌培養(yǎng)培養(yǎng)溫度高溫提高生長速度15基因工程菌培養(yǎng)誘導(dǎo)劑及誘導(dǎo)時間控制乳糖操縱子，IPTG誘導(dǎo)劑的添加量及誘導(dǎo)時菌體密度的高低都會影響到外源蛋白的表達水平。濃度較低時,外源蛋白的表達水平隨著誘導(dǎo)劑濃度的升高而不斷升高;當(dāng)濃度超過一定限度時,就會影響菌體代謝及蛋白表達水平。誘導(dǎo)時間的選擇也是影響外源蛋白表達的一個重要因素。一般控制在菌體的對數(shù)生長期或?qū)?shù)中后期。

16基因工程菌培養(yǎng)誘導(dǎo)劑及誘導(dǎo)時間控制乳糖操縱子，IPTG16基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的不穩(wěn)定性及對策基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性：結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，降解導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失分配不穩(wěn)定性整個重組DNA分子從受體細(xì)胞中丟失。

質(zhì)?？截悢?shù)的影響17基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的不穩(wěn)定性及對策基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在質(zhì)粒的拷貝數(shù)的影響外源蛋白的合成速率取決于質(zhì)?？截悢?shù)，在高拷貝數(shù)下，結(jié)構(gòu)物質(zhì)如氨基酸的供應(yīng)成為限制因素，導(dǎo)致細(xì)胞的代謝活力下降，高生長數(shù)率時質(zhì)?？截悢?shù)下降，但穩(wěn)定性增加。

18基因工程菌培養(yǎng)質(zhì)粒的拷貝數(shù)的影響18基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產(chǎn)生機制

受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解外源基因的高效表達嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長代謝重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時的不均勻分配受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排19基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產(chǎn)生機制

受體細(xì)胞中的限制修飾系影響質(zhì)粒穩(wěn)定的因素與質(zhì)粒穩(wěn)定有關(guān)的基因及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)自身對其穩(wěn)定性的影響宿主對質(zhì)粒穩(wěn)定的影響質(zhì)?？截悢?shù)重組質(zhì)粒的表達對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響培養(yǎng)條件的影響（培養(yǎng)基，溫度，pH等等）

20基因工程菌培養(yǎng)影響質(zhì)粒穩(wěn)定的因素與質(zhì)粒穩(wěn)定有關(guān)的基因及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)自身對其穩(wěn)定穩(wěn)定基因工程菌的措施改進重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)選擇適當(dāng)宿主增加外界環(huán)境壓力調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件

21基因工程菌培養(yǎng)穩(wěn)定基因工程菌的措施改進重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)21基因工程菌培養(yǎng)施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素藥物和食品生產(chǎn)時禁止使用抗生素加入大量的抗生素會使生產(chǎn)成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素，只能維持一定時間添加抗生素選擇壓力對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定無能為力載體上的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組份培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高22基因工程菌培養(yǎng)施加選擇壓力22基因工程菌培養(yǎng)分階段控制培養(yǎng)因外源基因表達造成質(zhì)粒不穩(wěn)定時，可以考慮將發(fā)酵過程分階段控制兩階段培養(yǎng)法：⑴先使菌體生長至一定密度；⑵再誘導(dǎo)外源基因的表達23基因工程菌培養(yǎng)分階段控制培養(yǎng)23基因工程菌培養(yǎng)控制目的基因的過量表達使用可控型啟動子控制目的基因的定時表達及表達程度控制質(zhì)粒的定時增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)

優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝培養(yǎng)基組成：采用天然培養(yǎng)基培產(chǎn)時質(zhì)粒穩(wěn)定件較用合成培養(yǎng)基為高培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定24基因工程菌培養(yǎng)控制目的基因的過量表達24基因工程菌培養(yǎng)選擇合適拷貝數(shù)的菌株在質(zhì)粒穩(wěn)定基礎(chǔ)上，應(yīng)盡可能提高細(xì)胞內(nèi)質(zhì)?？截悢?shù)。在工業(yè)生產(chǎn)中易于操作的方法是在培養(yǎng)的不同階段，采用不同培養(yǎng)溫度達到提高拷貝數(shù)目的，在前培養(yǎng)階段采用低溫，以減少細(xì)胞負(fù)荷，此時拷貝數(shù)較低，而比生長速率升高，在主培養(yǎng)中途升高溫度，質(zhì)?？截悢?shù)增加，目的基因產(chǎn)量提高。25基因工程菌培養(yǎng)選擇合適拷貝數(shù)的菌株25基因工程菌培養(yǎng)改進質(zhì)粒結(jié)構(gòu)插入促進穩(wěn)定的DNA片段，刪去多余的部分；去除含有轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)的DNA片段，使用溫度敏感性質(zhì)粒。26基因工程菌培養(yǎng)改進質(zhì)粒結(jié)構(gòu)26基因工程菌培養(yǎng)固定化固定化可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性基因重組大腸桿菌進行固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及目的產(chǎn)物的表達率都有了很大提高。在大規(guī)模生產(chǎn)中往往采用固定化方法不同的宿主菌及質(zhì)粒在固定化系統(tǒng)中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。27基因工程菌培養(yǎng)固定化27基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的安全性問題美、日等國都制定了有關(guān)DNA重組實驗的準(zhǔn)則，即在試管內(nèi)用酶等構(gòu)建異種DNA的重組分子，并用它轉(zhuǎn)入活細(xì)胞中的實驗，以及使用重組體的實驗應(yīng)遵循的規(guī)程。其目的是保證實驗的安全和推動重組DNA的研究。這些準(zhǔn)則參照了防止病原微生物污染的措施，以及根據(jù)對實驗安全度的評定，采用物理密封(P1~P4)和生物學(xué)密封(B1和B2)兩種方法。28基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的安全性問題美、日等國都制定了有關(guān)DNA重組實驗的物理密封是將重組菌封閉于設(shè)備內(nèi)，以防止傳染給實驗人員和向外界擴散。實驗規(guī)模在20L以下時，物理密封由密封設(shè)施、實驗室設(shè)計和實驗注意事項組成。密封程度分為P1、P2、P3和P4級，數(shù)字越大，密封水平越高。29基因工程菌培養(yǎng)物理密封是將重組菌封閉于設(shè)備內(nèi)，以防止傳染給實驗人員和向外界生物學(xué)密封要求用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時用不能轉(zhuǎn)移至其它活細(xì)胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴散。按密封程度分B1和B2級，B2級的密封要求最嚴(yán)格。30基因工程菌培養(yǎng)生物學(xué)密封要求用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時用不企業(yè)中進行重組菌培養(yǎng)時的設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)有LS-1和LS-2。LS-2相當(dāng)嚴(yán)格，工業(yè)生產(chǎn)起碼應(yīng)在LS-1的設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)下培養(yǎng)。LS-1標(biāo)準(zhǔn)要點是：(1)使用防止重組菌體外漏，能在密閉狀態(tài)下進行內(nèi)部滅菌的培養(yǎng)裝置；(2)培養(yǎng)裝置的排氣由除菌器排出；(3)使用易產(chǎn)氣溶膠的設(shè)備時，要安裝可收集氣溶膠的安全箱等。設(shè)計用于基因重組菌的培養(yǎng)裝置時，不僅要考慮外部雜菌的侵入，還要防止重組菌的外漏。此外，培養(yǎng)后的菌體分離、破碎等處理也必須在安全柜內(nèi)進行，或是采用密閉型的設(shè)備。31基因工程菌培養(yǎng)企業(yè)中進行重組菌培養(yǎng)時的設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)有LS-1和LS-2。LS在普通通氣攪拌罐中可能發(fā)生外漏的部位和操作。歸納起來有：排氣，機械密封，接種，取樣，培養(yǎng)后的滅菌(通入濕熱蒸氣)，排液(輸至下一工序)。32基因工程菌培養(yǎng)在普通通氣攪拌罐中可能發(fā)生外漏的部位和操作。歸納起來有基因工程菌發(fā)酵的后處理技術(shù)傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)品和基因工程產(chǎn)品在提取和精制上的不同，主要表現(xiàn)在下列方面：(1)傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品多為小分子，其理化性能，如平衡關(guān)系等數(shù)據(jù)都已知，因此放大比較有根據(jù)；相反，基因工程產(chǎn)品都是大分子，必要數(shù)據(jù)缺乏，放大多憑經(jīng)驗。33基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌發(fā)酵的后處理技術(shù)傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)品和基因工程產(chǎn)品在提?。?）基因工程產(chǎn)品大多處于細(xì)胞內(nèi)，提取前需將細(xì)胞破碎，增添了很多困難。而且發(fā)酵液中產(chǎn)物濃度也較稀，雜質(zhì)又多，加上一般大分子較小分子不穩(wěn)定(如對剪切力)，故提取較困難，常需利用高分辨力的精制方法，如色層分離等。（3）基因工程產(chǎn)蛋白提取的要求純度更高，對于安全性的要求更為嚴(yán)格。34基因工程菌培養(yǎng)（2）基因工程產(chǎn)品大多處于細(xì)胞內(nèi)，提取前需將細(xì)胞破碎，增添了細(xì)胞的破碎

蛋白質(zhì)的濃縮與分離35基因工程菌培養(yǎng)細(xì)胞的破碎35基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌高密度發(fā)酵技術(shù)是基因工程技術(shù)生產(chǎn)應(yīng)用的基礎(chǔ),其產(chǎn)品在化工、食品、環(huán)保、醫(yī)藥等方面都存在極大的潛在能力。但能否實現(xiàn)高密度培養(yǎng)及高目標(biāo)產(chǎn)物濃度,是工程菌能否以較低成本實現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)的決定性因素。因此,必須結(jié)合高密度發(fā)酵的各個工藝條件,簡化操作工藝,降低工業(yè)成本,最終使目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)的規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化得以實現(xiàn)。36基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌高密度發(fā)酵技術(shù)是基因工程技術(shù)生產(chǎn)應(yīng)用的基礎(chǔ),其產(chǎn)品基因工程菌培養(yǎng)37基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌培養(yǎng)1基因工程菌培養(yǎng)什么是基因工程菌？為什么要構(gòu)建基因工程菌？遺傳性狀的改良代謝途徑的加工

生物反應(yīng)器38基因工程菌培養(yǎng)什么是基因工程菌？2基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的構(gòu)建

宿主菌：大腸桿菌作為外源基因表達的宿主,遺傳背景清楚,技術(shù)操作簡單,培養(yǎng)條件簡單,大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟,是應(yīng)用最廣泛,最成功的表達體系

外源基因：質(zhì)粒39基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的構(gòu)建3基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌生長的特點：外源基因與宿主的互相影響產(chǎn)物，資源的爭奪基因工程菌與普通微生物發(fā)酵有什么區(qū)別？

40基因工程菌培養(yǎng)4基因工程菌培養(yǎng)微生物發(fā)酵主要收獲的是它們的初級或次級代謝產(chǎn)物，細(xì)胞生長并非主要目標(biāo)?；蚬こ叹囵B(yǎng)是為了獲得最大量的基因表達產(chǎn)物。這類物質(zhì)是相對獨立于細(xì)胞染色體之外的重組質(zhì)粒上的外源基因所合成的、細(xì)胞并不需要的蛋白質(zhì)。41基因工程菌培養(yǎng)微生物發(fā)酵主要收獲的是它們的初級或次級代謝產(chǎn)基因工程菌發(fā)酵的設(shè)備氣升式發(fā)酵罐的優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單，不易污染，能耗低，操作簡單，低剪切力,適合高濃度發(fā)酵。基因工程菌往往對剪切力更為敏感（why？）42基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌發(fā)酵的設(shè)備氣升式發(fā)酵罐的優(yōu)點：6基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的高密度發(fā)酵在基因工程菌的發(fā)酵中，菌體的增殖和產(chǎn)物的表達都是在對數(shù)期內(nèi)完成的，因此，發(fā)酵工藝的改進就集中在如何延長工程菌的對數(shù)生長時間，縮短衰亡時間高密度發(fā)酵工藝是基因工程菌發(fā)酵的主要生產(chǎn)工藝43基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的高密度發(fā)酵在基因工程菌的發(fā)酵中，菌體的增殖和產(chǎn)高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的要求高密度發(fā)酵要獲得高生物量和高濃度表達產(chǎn)物,需投入幾倍于生物量的基質(zhì)以滿足細(xì)菌迅速生長繁殖及大量表達基因產(chǎn)物的需要。成分的要求：使用甘油的原因？濃度的要求44基因工程菌培養(yǎng)高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的要求8基因工程菌培養(yǎng)在培養(yǎng)基中加入重組蛋白表達的前體氨基酸和一些能量物質(zhì)有利于蛋白表達量的提高。比如利用重組大腸桿菌生產(chǎn)谷胱甘肽(ＧＳＨ)時,在發(fā)酵開始和進行12ｈ后,各添加2.0ｇ/Ｌ腺苷三磷酸(ＡＴＰ)和9ｍｍｏｌ/Ｌ前體氨基酸,可以使細(xì)胞濃度和ＧＳＨ的產(chǎn)量分別比不添加這兩種物質(zhì)提高24%和1.4倍45基因工程菌培養(yǎng)在培養(yǎng)基中加入重組蛋白表達的前體氨基酸和一些能量物質(zhì)有利于蛋培養(yǎng)方式分批補料培養(yǎng)方式補充營養(yǎng)稀釋代謝產(chǎn)物分離與培養(yǎng)耦合固定化培養(yǎng)技術(shù)固定化技術(shù)與連續(xù)培養(yǎng)，透析培養(yǎng)相結(jié)合是基因工程菌發(fā)酵的發(fā)展方向46基因工程菌培養(yǎng)培養(yǎng)方式分批補料培養(yǎng)方式10基因工程菌培養(yǎng)接種量的控制接種量對基因表達的影響不大,但對菌體生長影響較明顯。接種量小(0.5%～4%)時,比生長速率大,對數(shù)生長期持續(xù)時間長;接種量大(>8%)時,細(xì)菌較快地達到了穩(wěn)定期,持續(xù)生長時間短,自溶也較快。47基因工程菌培養(yǎng)接種量的控制接種量對基因表達的影響不大,但對菌體生長影響較明接種量過小，延遲期太長較接種量大，可縮短生長延遲期，菌體迅速繁衍，很快進入對數(shù)生長期，適于表達外源基因。接種量過高，使菌體生長過快，代謝物積累過多，反而會抑制后期菌體的生長。48基因工程菌培養(yǎng)接種量過小，延遲期太長12基因工程菌培養(yǎng)發(fā)酵中溶解氧的控制純氧？富氧！添加提高傳氧能力的VHb蛋白，添加H2O2，血紅蛋白，小球藻。溶氧過高或局部過高，會使某些微生物氧中毒49基因工程菌培養(yǎng)發(fā)酵中溶解氧的控制純氧？富氧！13基因工程菌培養(yǎng)pH值的控制在高密度發(fā)酵條件下,細(xì)胞產(chǎn)生大量的乙酸和ＣＯ2,可使ｐＨ值顯著降低。常用于控制ｐＨ的酸堿有ＨＣｌ,ＮａＯＨ和氨水等,其中氨水常被使用,因為它還具有補充氮源的作用。但有研究發(fā)現(xiàn),ＮＨ4+濃度對大腸桿菌的生長有很大影響,當(dāng)ＮＨ4+濃度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ時會嚴(yán)重抑制大腸桿菌的生長。

50基因工程菌培養(yǎng)pH值的控制在高密度發(fā)酵條件下,細(xì)胞產(chǎn)生大量的乙酸和ＣＯ2,培養(yǎng)溫度高溫提高生長速度低溫增加重組菌穩(wěn)定性對于溫度敏感重組菌,發(fā)酵過程一般分為生長和表達兩個階段,分別維持不同的培養(yǎng)溫度。但也會因為升溫而引起質(zhì)粒的丟失,而減少重組蛋白量。

51基因工程菌培養(yǎng)培養(yǎng)溫度高溫提高生長速度15基因工程菌培養(yǎng)誘導(dǎo)劑及誘導(dǎo)時間控制乳糖操縱子，IPTG誘導(dǎo)劑的添加量及誘導(dǎo)時菌體密度的高低都會影響到外源蛋白的表達水平。濃度較低時,外源蛋白的表達水平隨著誘導(dǎo)劑濃度的升高而不斷升高;當(dāng)濃度超過一定限度時,就會影響菌體代謝及蛋白表達水平。誘導(dǎo)時間的選擇也是影響外源蛋白表達的一個重要因素。一般控制在菌體的對數(shù)生長期或?qū)?shù)中后期。

52基因工程菌培養(yǎng)誘導(dǎo)劑及誘導(dǎo)時間控制乳糖操縱子，IPTG16基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的不穩(wěn)定性及對策基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性：結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，降解導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失分配不穩(wěn)定性整個重組DNA分子從受體細(xì)胞中丟失。

質(zhì)?？截悢?shù)的影響53基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的不穩(wěn)定性及對策基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在質(zhì)粒的拷貝數(shù)的影響外源蛋白的合成速率取決于質(zhì)?？截悢?shù)，在高拷貝數(shù)下，結(jié)構(gòu)物質(zhì)如氨基酸的供應(yīng)成為限制因素，導(dǎo)致細(xì)胞的代謝活力下降，高生長數(shù)率時質(zhì)粒拷貝數(shù)下降，但穩(wěn)定性增加。

54基因工程菌培養(yǎng)質(zhì)粒的拷貝數(shù)的影響18基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產(chǎn)生機制

受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解外源基因的高效表達嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長代謝重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時的不均勻分配受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排55基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性的的產(chǎn)生機制

受體細(xì)胞中的限制修飾系影響質(zhì)粒穩(wěn)定的因素與質(zhì)粒穩(wěn)定有關(guān)的基因及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)自身對其穩(wěn)定性的影響宿主對質(zhì)粒穩(wěn)定的影響質(zhì)粒拷貝數(shù)重組質(zhì)粒的表達對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響培養(yǎng)條件的影響（培養(yǎng)基，溫度，pH等等）

56基因工程菌培養(yǎng)影響質(zhì)粒穩(wěn)定的因素與質(zhì)粒穩(wěn)定有關(guān)的基因及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)自身對其穩(wěn)定穩(wěn)定基因工程菌的措施改進重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)選擇適當(dāng)宿主增加外界環(huán)境壓力調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件

57基因工程菌培養(yǎng)穩(wěn)定基因工程菌的措施改進重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)21基因工程菌培養(yǎng)施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素藥物和食品生產(chǎn)時禁止使用抗生素加入大量的抗生素會使生產(chǎn)成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素，只能維持一定時間添加抗生素選擇壓力對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定無能為力載體上的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組份培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高58基因工程菌培養(yǎng)施加選擇壓力22基因工程菌培養(yǎng)分階段控制培養(yǎng)因外源基因表達造成質(zhì)粒不穩(wěn)定時，可以考慮將發(fā)酵過程分階段控制兩階段培養(yǎng)法：⑴先使菌體生長至一定密度；⑵再誘導(dǎo)外源基因的表達59基因工程菌培養(yǎng)分階段控制培養(yǎng)23基因工程菌培養(yǎng)控制目的基因的過量表達使用可控型啟動子控制目的基因的定時表達及表達程度控制質(zhì)粒的定時增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)

優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝培養(yǎng)基組成：采用天然培養(yǎng)基培產(chǎn)時質(zhì)粒穩(wěn)定件較用合成培養(yǎng)基為高培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定60基因工程菌培養(yǎng)控制目的基因的過量表達24基因工程菌培養(yǎng)選擇合適拷貝數(shù)的菌株在質(zhì)粒穩(wěn)定基礎(chǔ)上，應(yīng)盡可能提高細(xì)胞內(nèi)質(zhì)?？截悢?shù)。在工業(yè)生產(chǎn)中易于操作的方法是在培養(yǎng)的不同階段，采用不同培養(yǎng)溫度達到提高拷貝數(shù)目的，在前培養(yǎng)階段采用低溫，以減少細(xì)胞負(fù)荷，此時拷貝數(shù)較低，而比生長速率升高，在主培養(yǎng)中途升高溫度，質(zhì)?？截悢?shù)增加，目的基因產(chǎn)量提高。61基因工程菌培養(yǎng)選擇合適拷貝數(shù)的菌株25基因工程菌培養(yǎng)改進質(zhì)粒結(jié)構(gòu)插入促進穩(wěn)定的DNA片段，刪去多余的部分；去除含有轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)的DNA片段，使用溫度敏感性質(zhì)粒。62基因工程菌培養(yǎng)改進質(zhì)粒結(jié)構(gòu)26基因工程菌培養(yǎng)固定化固定化可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性基因重組大腸桿菌進行固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及目的產(chǎn)物的表達率都有了很大提高。在大規(guī)模生產(chǎn)中往往采用固定化方法不同的宿主菌及質(zhì)粒在固定化系統(tǒng)中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。63基因工程菌培養(yǎng)固定化27基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的安全性問題美、日等國都制定了有關(guān)DNA重組實驗的準(zhǔn)則，即在試管內(nèi)用酶等構(gòu)建異種DNA的重組分子，并用它轉(zhuǎn)入活細(xì)胞中的實驗，以及使用重組體的實驗應(yīng)遵循的規(guī)程。其目的是保證實驗的安全和推動重組DNA的研究。這些準(zhǔn)則參照了防止病原微生物污染的措施，以及根據(jù)對實驗安全度的評定，采用物理密封(P1~P4)和生物學(xué)密封(B1和B2)兩種方法。64基因工程菌培養(yǎng)基因工程菌的安全性問題美、日等國都制定了有關(guān)DNA重組實驗的物理密封是將重組菌封閉于設(shè)備內(nèi)，以防止傳染給實驗人員和向外界擴散。實驗規(guī)模在20L以下時，物理密封由密封設(shè)施、實驗室設(shè)計和實驗注意事項組成。密封程度分為P1、P2、P3和P4級，數(shù)字越大，密封水平越高。65基因工程菌培養(yǎng)物理密封是將重組菌封閉于設(shè)備內(nèi)，以防止傳染給實驗人員和向外界生物學(xué)密封要求用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時用不能轉(zhuǎn)移至其它活細(xì)胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴散。按密封程度分B1和B2級