植物生理實驗報告

本科學生綜合性實驗報告項目組長高銘遠學號07070241011成員杜廣宇、杜沙沙、段司宇、馮慧彬、宮亞坡專業(yè)生物技術班級1班實驗項目名稱小麥耐鹽生理指標測定指導教師及職稱開課學期2008至2009學年2學期上課時間2009年4月22日植物耐鹽性生理指標的測定一、實驗目的及要求通過本實驗的學習，使學生掌握脯氨酸含量、過氧化物酶活性和丙二醛含量測定方法，掌握單因子方差分析，培養(yǎng)學生離心機和分光光度計的使用技能，為今后撰寫畢業(yè)論文打下良好的基礎。二、實驗主要儀器和試劑儀器：離心機；分光光度計；恒溫水浴鍋試劑：酸性茚三酮溶液；冰醋酸；標準脯氨酸溶液；3%磺基水楊酸；過氧化物酶測定反應液；pH6.0磷酸緩沖液10%TCA；0.6%TBA三、實驗原理植物在鹽脅迫下,植物可通過積累一定量的脯氨酸降低水勢，維持植物體內(nèi)的水分平衡,保證植物的正常生長。脯氨酸本身是一種水溶性最大的氨基酸，，它可以防止原生質體的水分散失，在植物細胞生理干旱時，它的增加有助于細胞或組織保持水分。用磺基水楊酸提取植物樣品時，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下比色，從標準曲線上查出脯氨酸的含量。植物在鹽脅迫下，活性氧含量會明顯增加，對植物體產(chǎn)生毒害，而過氧化物酶會清除植物體內(nèi)多余的活性氧。過氧化物酶廣泛存在于植物的各個組織器官中。在有過氧化氫存在的條件下，過氧化物酶可以使愈創(chuàng)木酚氧化，產(chǎn)生茶褐色物質，在470nm處有最大吸收峰，可根據(jù)單位時間內(nèi)A470的變化值，計算POD活性大小。植物在鹽脅迫下，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛是其產(chǎn)物之一，通常將其作為脂質過氧化指標，用于表示細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應的強弱。丙二醛（MDA）是常用的膜脂過氧化指標，在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸（TBA）反應生成紅棕色的三甲川（3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮），其最大吸收波長在532nm。但是測定植物組織中MDA時受多種物質的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應產(chǎn)物的最大吸收波長在450nm，532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時可溶性糖增加，因此測定植物組織中MDA-TBA反應物質含量時一定要排除可溶性糖的干擾。四、實驗步驟（一）實驗材料的培養(yǎng)小麥種子吸脹8h后消毒、4°C下春化30天，采用砂培法種植，至三葉期，作為供試材料。（二）鹽脅迫處理用100mmol/LNaCl對小麥進行鹽脅迫，以未進行鹽脅迫為對照，以進行鹽脅迫為處理，鹽脅迫3d后分別測定脯氨酸含量、過氧化物酶活性和丙二醛含量，對照和處理分別重復3次。（三）脯氨酸含量測定標準曲線的制作用100ug/ml脯氨酸配制成2、4、6、8、10ug/ml的標準溶液。取標準溶液各2ml,加2ml3%磺基水楊酸，2ml冰醋酸和4ml2.5%茚三酮試劑于具塞試管中，置沸水浴中顯色1h，冷卻后與波長520nm測定A值，以A值為縱坐標，脯氨酸濃度（ug/ml）為橫坐標繪制標準曲線。脯氨酸的提取稱取小麥葉片0.5g，加3%磺基水楊酸5ml研磨提取，勻漿移至試管中，在沸水浴中提取10min，冷卻后，5000rpm離心20min，上清液即為脯氨酸粗提液。反應體系取上清液2ml，并加入1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮，混勻置于沸水浴中顯色0.5h。以2ml磺基水楊酸，1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮為對照。在可見分光光度計下520nm處測得A值。脯氨酸的含量的計算從標準曲線查得脯氨酸濃度，計算出樣品中脯氨酸的含量，以每克材料鮮重含脯氨酸的微克數(shù)表示（Ug/g）o（四）過氧化物酶活性的測定過氧化物酶的提取稱取小麥葉片0.2g，加5mlpH6.0的磷酸緩沖液，再加入0.02gPVP-30（除去酚類物質的毒害，防止醍類物質的干擾）及少量石英砂研磨。4°C,5000rpm離心15分鐘，上清液為酶粗提取液反應體系50Ul酶粗提取液加入4ml反應液，在可見分光光度計下470nm處測A值，放入后立即記時，每隔1min記一次數(shù)值，連續(xù)記錄三次，取平均值。酶活力定義過氧化物酶活性以每克鮮重每分鐘在470nm下A值的變化值，設每變化0.01A為一個酶活力單位。過氧化物酶活性=U/min?g（五）丙二醛含量測定丙二醛提取小麥葉片0.5g，加入10%三氯乙酸（TCA）5mL（分兩次加）和少量石英砂充分研磨，勻漿液以5000r/min離心20min，上清液即為樣品提取液。反應體系取2mL提取液，分別加入2mL0.6%TBA液，混勻，在試管上加蓋塞，置于沸水浴中沸煮15min，迅速冷卻，離心。取上清液測定532nm和450nm下的A值。以2mL水代替提取液調零。MDA含量計算：根據(jù)C=6.45XA532—0.56XA顆，計算出樣品提取液中丙二醛的濃度C，然后再計算出每克樣品中丙二醛的含量（訓ol/g（FW）。五、實驗結果標準液濃度（ug/ml）00.40.81.21.62.0

112O7,4O112O7,4O516O58?

O12O4O0.02-0匕111110。.511.5225脯氨酸濃度(us/ml)脯氨酸含量117.7393±7.393901a488.0333±231.259b原始數(shù)據(jù)：脯氨酸含量117.7393±7.393901a488.0333±231.259b對照處理A值含量或活性A值含量或活性（FW）（FW）脯氨酸1.0.0471.109.67191.0.1171.279.0875含量2.0.0512.119.35282.0.1872.448.50303.0.0533.124.19333.0.3063.736.5095POD1.A值1.A值活性0.448,0.569,0.684,0.7860.877，1.112，1.322，1.511差值0.121，0.115，0.1021.11266.67差值0.235，0.210，0.1891.21133.332.A值2.A值0.541，0.717,0.875，1.0211.112，1.389，1.622，1.807差值0.176，0.158，0.1462.16000差值0.277，0.233，0.1852.23166.673.A值3.A值0.701，0.880，1.046，1.1961.139，1.434，1.676，1.869差值0.179，0.166，0.1503.16500差值0.295，0.242，0.1933.24333.33丙二醛1.A450=0.408A532=0.1961.51.7861.A450=0.544A532=0.2021.49.913含量2.A450=0.397A532=0.1992.53.06152.A450=0.447A532=0.2012.52.30653.A450=0.443A532=0.2053.53.70853.A450=0.504A532=0.1863.45.873單因子方差分析結果：對^POD活性14588.89±2887.97a22877.78±1619.443b丙二醛含量52.852±0.978222a49.36417±3.251676a六、結果分析本次實驗所得結果中，脯氨酸含量和POD活性測得結果差異顯著，但丙二醛含量所測結果對照組與鹽處理組差異并不十分明顯，綜合分析有以下原因：由于本次實驗時間較長，前后相差一個月左右，致使三次測定中實驗材料存在差異。麥苗所取部位不同，如葉部和莖部中脯氨酸含量、POD活性和丙二醛含量存在的差異可能影響實驗結果。試驗中，研磨不充分、石英砂和PVP加入不適量、每次水浴加熱時間控制不精確等，都可能影響分光光度計測得結果，從而影響實驗結果。由于測定丙二醛含量是，由多人測量，可能存在的誤差較大，導致丙二醛含量兩組差異不顯著。實驗中存在一系列的機械誤差，也可能是影響實驗結果。七、思考題：為什么使用砂培法培養(yǎng)實驗材料？沙培介質的通氣性較好，可以保證根際有較好的通氣性。沙子的粒徑較小，持水量較多，擴散范圍大，根系能充分吸水吸肥，且根系水平方向伸展。每次都用新鮮營養(yǎng)液，較好的維持養(yǎng)分平衡，減少調控營養(yǎng)液的麻煩。持水量大，工業(yè)次數(shù)可減少，每天供液1—2次即可。水和肥料的用量較多，吸收利用率也不高，易于產(chǎn)生鹽類積累。雖不易較精確控制，但仍可以調節(jié)PH。分光光度法要求A值在多大范圍內(nèi)，數(shù)據(jù)才可靠，如何調整？在實際分析工作中，溶液的吸光度控制在0.2?0.7時