植物生理實(shí)驗(yàn)報(bào)告

本科學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告項(xiàng)目組長(zhǎng)高銘遠(yuǎn)學(xué)號(hào)07070241011成員杜廣宇、杜沙沙、段司宇、馮慧彬、宮亞坡專業(yè)生物技術(shù)班級(jí)1班實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目名稱小麥耐鹽生理指標(biāo)測(cè)定指導(dǎo)教師及職稱開(kāi)課學(xué)期2008至2009學(xué)年2學(xué)期上課時(shí)間2009年4月22日植物耐鹽性生理指標(biāo)的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙笸ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)，使學(xué)生掌握脯氨酸含量、過(guò)氧化物酶活性和丙二醛含量測(cè)定方法，掌握單因子方差分析，培養(yǎng)學(xué)生離心機(jī)和分光光度計(jì)的使用技能，為今后撰寫畢業(yè)論文打下良好的基礎(chǔ)。二、實(shí)驗(yàn)主要儀器和試劑儀器：離心機(jī)；分光光度計(jì)；恒溫水浴鍋試劑：酸性茚三酮溶液；冰醋酸；標(biāo)準(zhǔn)脯氨酸溶液；3%磺基水楊酸；過(guò)氧化物酶測(cè)定反應(yīng)液；pH6.0磷酸緩沖液10%TCA；0.6%TBA三、實(shí)驗(yàn)原理植物在鹽脅迫下,植物可通過(guò)積累一定量的脯氨酸降低水勢(shì)，維持植物體內(nèi)的水分平衡,保證植物的正常生長(zhǎng)。脯氨酸本身是一種水溶性最大的氨基酸，，它可以防止原生質(zhì)體的水分散失，在植物細(xì)胞生理干旱時(shí)，它的增加有助于細(xì)胞或組織保持水分。用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí)，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長(zhǎng)下比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出脯氨酸的含量。植物在鹽脅迫下，活性氧含量會(huì)明顯增加，對(duì)植物體產(chǎn)生毒害，而過(guò)氧化物酶會(huì)清除植物體內(nèi)多余的活性氧。過(guò)氧化物酶廣泛存在于植物的各個(gè)組織器官中。在有過(guò)氧化氫存在的條件下，過(guò)氧化物酶可以使愈創(chuàng)木酚氧化，產(chǎn)生茶褐色物質(zhì)，在470nm處有最大吸收峰，可根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)A470的變化值，計(jì)算POD活性大小。植物在鹽脅迫下，往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，丙二醛是其產(chǎn)物之一，通常將其作為脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)，用于表示細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度和植物對(duì)逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱。丙二醛（MDA）是常用的膜脂過(guò)氧化指標(biāo)，在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成紅棕色的三甲川（3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮），其最大吸收波長(zhǎng)在532nm。但是測(cè)定植物組織中MDA時(shí)受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)在450nm，532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時(shí)可溶性糖增加，因此測(cè)定植物組織中MDA-TBA反應(yīng)物質(zhì)含量時(shí)一定要排除可溶性糖的干擾。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)小麥種子吸脹8h后消毒、4°C下春化30天，采用砂培法種植，至三葉期，作為供試材料。（二）鹽脅迫處理用100mmol/LNaCl對(duì)小麥進(jìn)行鹽脅迫，以未進(jìn)行鹽脅迫為對(duì)照，以進(jìn)行鹽脅迫為處理，鹽脅迫3d后分別測(cè)定脯氨酸含量、過(guò)氧化物酶活性和丙二醛含量，對(duì)照和處理分別重復(fù)3次。（三）脯氨酸含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用100ug/ml脯氨酸配制成2、4、6、8、10ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液各2ml,加2ml3%磺基水楊酸，2ml冰醋酸和4ml2.5%茚三酮試劑于具塞試管中，置沸水浴中顯色1h，冷卻后與波長(zhǎng)520nm測(cè)定A值，以A值為縱坐標(biāo)，脯氨酸濃度（ug/ml）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。脯氨酸的提取稱取小麥葉片0.5g，加3%磺基水楊酸5ml研磨提取，勻漿移至試管中，在沸水浴中提取10min，冷卻后，5000rpm離心20min，上清液即為脯氨酸粗提液。反應(yīng)體系取上清液2ml，并加入1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮，混勻置于沸水浴中顯色0.5h。以2ml磺基水楊酸，1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮為對(duì)照。在可見(jiàn)分光光度計(jì)下520nm處測(cè)得A值。脯氨酸的含量的計(jì)算從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得脯氨酸濃度，計(jì)算出樣品中脯氨酸的含量，以每克材料鮮重含脯氨酸的微克數(shù)表示（Ug/g）o（四）過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定過(guò)氧化物酶的提取稱取小麥葉片0.2g，加5mlpH6.0的磷酸緩沖液，再加入0.02gPVP-30（除去酚類物質(zhì)的毒害，防止醍類物質(zhì)的干擾）及少量石英砂研磨。4°C,5000rpm離心15分鐘，上清液為酶粗提取液反應(yīng)體系50Ul酶粗提取液加入4ml反應(yīng)液，在可見(jiàn)分光光度計(jì)下470nm處測(cè)A值，放入后立即記時(shí)，每隔1min記一次數(shù)值，連續(xù)記錄三次，取平均值。酶活力定義過(guò)氧化物酶活性以每克鮮重每分鐘在470nm下A值的變化值，設(shè)每變化0.01A為一個(gè)酶活力單位。過(guò)氧化物酶活性=U/min?g（五）丙二醛含量測(cè)定丙二醛提取小麥葉片0.5g，加入10%三氯乙酸（TCA）5mL（分兩次加）和少量石英砂充分研磨，勻漿液以5000r/min離心20min，上清液即為樣品提取液。反應(yīng)體系取2mL提取液，分別加入2mL0.6%TBA液，混勻，在試管上加蓋塞，置于沸水浴中沸煮15min，迅速冷卻，離心。取上清液測(cè)定532nm和450nm下的A值。以2mL水代替提取液調(diào)零。MDA含量計(jì)算：根據(jù)C=6.45XA532—0.56XA顆，計(jì)算出樣品提取液中丙二醛的濃度C，然后再計(jì)算出每克樣品中丙二醛的含量（訓(xùn)ol/g（FW）。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ug/ml）00.40.81.21.62.0

112O7,4O112O7,4O516O58?

O12O4O0.02-0匕111110。.511.5225脯氨酸濃度(us/ml)脯氨酸含量117.7393±7.393901a488.0333±231.259b原始數(shù)據(jù)：脯氨酸含量117.7393±7.393901a488.0333±231.259b對(duì)照處理A值含量或活性A值含量或活性（FW）（FW）脯氨酸1.0.0471.109.67191.0.1171.279.0875含量2.0.0512.119.35282.0.1872.448.50303.0.0533.124.19333.0.3063.736.5095POD1.A值1.A值活性0.448,0.569,0.684,0.7860.877，1.112，1.322，1.511差值0.121，0.115，0.1021.11266.67差值0.235，0.210，0.1891.21133.332.A值2.A值0.541，0.717,0.875，1.0211.112，1.389，1.622，1.807差值0.176，0.158，0.1462.16000差值0.277，0.233，0.1852.23166.673.A值3.A值0.701，0.880，1.046，1.1961.139，1.434，1.676，1.869差值0.179，0.166，0.1503.16500差值0.295，0.242，0.1933.24333.33丙二醛1.A450=0.408A532=0.1961.51.7861.A450=0.544A532=0.2021.49.913含量2.A450=0.397A532=0.1992.53.06152.A450=0.447A532=0.2012.52.30653.A450=0.443A532=0.2053.53.70853.A450=0.504A532=0.1863.45.873單因子方差分析結(jié)果：對(duì)^POD活性14588.89±2887.97a22877.78±1619.443b丙二醛含量52.852±0.978222a49.36417±3.251676a六、結(jié)果分析本次實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果中，脯氨酸含量和POD活性測(cè)得結(jié)果差異顯著，但丙二醛含量所測(cè)結(jié)果對(duì)照組與鹽處理組差異并不十分明顯，綜合分析有以下原因：由于本次實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，前后相差一個(gè)月左右，致使三次測(cè)定中實(shí)驗(yàn)材料存在差異。麥苗所取部位不同，如葉部和莖部中脯氨酸含量、POD活性和丙二醛含量存在的差異可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)中，研磨不充分、石英砂和PVP加入不適量、每次水浴加熱時(shí)間控制不精確等，都可能影響分光光度計(jì)測(cè)得結(jié)果，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由于測(cè)定丙二醛含量是，由多人測(cè)量，可能存在的誤差較大，導(dǎo)致丙二醛含量?jī)山M差異不顯著。實(shí)驗(yàn)中存在一系列的機(jī)械誤差，也可能是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。七、思考題：為什么使用砂培法培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)材料？沙培介質(zhì)的通氣性較好，可以保證根際有較好的通氣性。沙子的粒徑較小，持水量較多，擴(kuò)散范圍大，根系能充分吸水吸肥，且根系水平方向伸展。每次都用新鮮營(yíng)養(yǎng)液，較好的維持養(yǎng)分平衡，減少調(diào)控營(yíng)養(yǎng)液的麻煩。持水量大，工業(yè)次數(shù)可減少，每天供液1—2次即可。水和肥料的用量較多，吸收利用率也不高，易于產(chǎn)生鹽類積累。雖不易較精確控制，但仍可以調(diào)節(jié)PH。分光光度法要求A值在多大范圍內(nèi)，數(shù)據(jù)才可靠，如何調(diào)整？在實(shí)際分析工作中，溶液的吸光度控制在0.2?0.7時(shí)