藥監(jiān)系統(tǒng)官方培訓(xùn) 王知堅(jiān) 益生菌相關(guān)藥物的質(zhì)量分析與控制 浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院

含益生菌成分藥品質(zhì)量分析現(xiàn)狀和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)探討浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院王知堅(jiān)浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院浙江省藥品監(jiān)督管理局直屬公益一類(lèi)事業(yè)單位4個(gè)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（藥品微生物檢測(cè)與預(yù)警重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）國(guó)家級(jí)藥品包裝材料檢驗(yàn)中心（浙江省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）家級(jí)口岸藥品檢驗(yàn)所、

2011協(xié)同創(chuàng)新中心核心成員單一期建筑面積23

90m2二期食品檢驗(yàn)檢測(cè)大樓擬建13500m21100余臺(tái)（套），

2億元260余名，其中高級(jí)

稱(chēng)67人，碩士及

以上人員占比超過(guò)60%目錄>12行業(yè)現(xiàn)狀質(zhì)量分析現(xiàn)狀34國(guó)內(nèi)外法討質(zhì)量控制方向1行業(yè)現(xiàn)狀含益生菌成分

品分類(lèi)現(xiàn)狀含益生菌成分藥品10?國(guó)產(chǎn)含益生菌成分藥品42個(gè)品種?進(jìn)口含益生菌成分藥品10個(gè)品種國(guó)產(chǎn)藥品進(jìn)口藥品42含益生菌藥品分類(lèi)管理情況國(guó)藥準(zhǔn)字Z國(guó)藥準(zhǔn)字B國(guó)藥準(zhǔn)字H國(guó)藥準(zhǔn)字S?

共計(jì)1個(gè)品類(lèi)?

共計(jì)1個(gè)文號(hào)?

共計(jì)1個(gè)品類(lèi)?

共計(jì)2個(gè)文號(hào)?

共計(jì)13個(gè)品類(lèi)?

共計(jì)38個(gè)文號(hào)共計(jì)35個(gè)品類(lèi)共計(jì)54個(gè)文號(hào)??東三省13家北京5家山東10家前言基本要求制造檢定保存、運(yùn)輸及有效期《

國(guó)藥典》三部微生態(tài)活菌制品總論生物制品含益生藥品分《中國(guó)藥典》四部通則<1105>非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法：除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。應(yīng)符合制劑通則項(xiàng)下相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)/微生物限度檢查《新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》等標(biāo)準(zhǔn)/中藥/保健藥品分類(lèi)不同導(dǎo)致執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)不同計(jì)數(shù)培性檢查法計(jì)數(shù)方法

用性薄濾法<105>非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法法“培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

點(diǎn)計(jì)平板上供試

檢查生長(zhǎng)的菌落數(shù)”結(jié)斷“培養(yǎng)基上的總菌落數(shù)”無(wú)法進(jìn)行合理且符合規(guī)定的方法適用性試驗(yàn)<1107>非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)含益生菌成分藥品無(wú)法滿足相關(guān)微生物限度標(biāo)準(zhǔn)1.增加稀釋液或培養(yǎng)基體積2.加入適宜的中和劑<1106>非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)<1105>抗菌活性的或滅活劑去除或滅活3.采用薄

過(guò)濾法.上述幾種方法的聯(lián)合使用若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)

除供試品的抑菌活性

見(jiàn)非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢査：微生物計(jì)需使用抑制益生菌生長(zhǎng)但不影響控制菌生長(zhǎng)的滅活劑，可操作性低數(shù)法(105)中的“抗菌滅活”

]，并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。活性的化學(xué)藥品地標(biāo)升國(guó)標(biāo)16冊(cè)白葡萄球菌片含量測(cè)定：總磷量、無(wú)機(jī)磷、有機(jī)磷缺少益生菌含量測(cè)定相關(guān)內(nèi)容，質(zhì)量控制存在不足2質(zhì)量現(xiàn)狀分析案例1—胰酶散全國(guó)評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種復(fù)方胰酶散-按化學(xué)藥品管理的含益生菌復(fù)方制劑，活菌來(lái)自乳酶生。乳酶生-二部藥典收載的

化學(xué)原料藥管理的益生菌制品，包含活微生物為屎腸球菌。不合格樣品：有益生菌，有雜菌。乳酶生0.1g/袋粉酶0.1g/袋胰酶0.1g/袋案例1—胰酶散產(chǎn)品：胰酶散（國(guó)藥準(zhǔn)字H13023859

）我國(guó)1980年開(kāi)始在各省進(jìn)行注冊(cè)生產(chǎn)。曾用名胖得生?，F(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)為《化學(xué)藥品地標(biāo)升國(guó)標(biāo)第9冊(cè)》，國(guó)外藥典無(wú)收載。國(guó)內(nèi)共有19家生產(chǎn)企業(yè)，20個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)。途：用于小兒消化不良及營(yíng)養(yǎng)障礙應(yīng)符合《中國(guó)藥典》片劑通則下的相關(guān)要求。即通則<110>非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中相關(guān)內(nèi)容。不合格項(xiàng)目：微生物計(jì)數(shù)?

需氧菌總數(shù)（TAMC）?

霉菌和酵總數(shù)（TYMC）案例1—胰酶散微生物計(jì)數(shù)方法適用性：◆

檢測(cè)條件：1:10供試液，0.2ml/皿，涂布◆

培養(yǎng)基：TSA、SDA、玫瑰紅鈉瓊脂◆

測(cè)試結(jié)果

TSA、SDA上，活菌生長(zhǎng)，標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株回收率大于90%。

瑰紅鈉瓊脂上，活菌不生長(zhǎng)，標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株回收率大于90%。案例1—胰酶散微生物限度檢查結(jié)果案例1—胰酶散需氧菌總數(shù)Max

2000cfu/g霉菌和

母菌總數(shù)Max

200cfu/g屎腸球菌6樣品Min

10

cfu/g：：：1234920010

00滿足要求4000440045048006900400滿足要求滿足要求0560050004301400015000440023000600滿足要求滿足要求滿足要求滿足要求滿足要求滿足要求06781009540032003001011121345008004800250059005300滿足要求滿足要求案例1—胰酶散胰酶散中雜菌類(lèi)別◆

細(xì)菌─泛菌屬（分散泛菌、septica、alhagi）─地衣芽胞桿菌未見(jiàn)較強(qiáng)致病菌，多為分布在空氣、環(huán)境、土壤中的微生物淀粉芽胞桿菌◆

霉菌─曲霉屬（灰綠曲霉、花斑曲霉、赭曲霉、鄔氏黃絲曲

）─出芽短梗霉菌◆

酵母菌─粘質(zhì)紅酵母─淺白隱球酵母案例2—腸泰合劑?

腸泰合劑

制劑概況

生產(chǎn)企業(yè)：重慶賽諾

執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：

WS-11511（ZD-1511）-2002

劑型：合劑，口服液

規(guī)格：10ml/支

包裝規(guī)格：6支/盒，10支/盒

成份：紅參、白術(shù)、茯苓、甘草、雙歧桿菌培養(yǎng)液、陳皮糖漿。

兒科消化

良常用藥案例2—腸泰合劑需氧菌總數(shù)序號(hào)鑒定結(jié)果cfu/ml1234568910111213141516171819202122040505080植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌植物乳桿菌/1101402607701700190023002400340037006200<1010

雙

歧

桿

菌

嚴(yán)

格

厭

氧

特

性

，不干擾需氧條件計(jì)數(shù)雜菌。

樣品檢出菌

=

雜菌////<10<10<10<102/案例2—腸泰合劑MRS瓊脂培養(yǎng)基（GB4789.35）

(ISO

29981-TOS丙酸鹽

119#培養(yǎng)基瓊脂

（企業(yè)用）?

腸泰合劑

雙歧桿菌分離檢

標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：適宜培養(yǎng)基，沒(méi)有明確。

培養(yǎng)條件：37℃，厭氧袋培養(yǎng)

雙歧桿菌屬測(cè)試菌株生長(zhǎng)良好：CC6068、嬰兒雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌

pH3.0的樣品環(huán)境中，雙歧桿菌存在不穩(wěn)定。2010)蛋白胨10g牛肉粉5g酵母粉4g葡萄糖20g酪蛋白水解物10g

大豆蛋白胨5g/胰蛋白胨5g酵母粉10g葡萄糖10g酵母粉1g/吐溫801.0mL磷酸氫二鉀2g//磷酸氫二鉀4.8g磷酸氫二鉀0.04g磷酸二氫鉀0.04g/磷酸二氫鉀3gL-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g丙酸鈉15g半胱氨酸鹽酸鹽0.5g醋酸鈉5g當(dāng)采取GB及ISO推薦的培養(yǎng)基檢查時(shí)，23批腸泰合劑中均未分離到雙歧桿菌活菌。檸檬酸三銨2g硫

銨3g氯化鎂0.0192g硫酸鎂0.2g硫酸錳0.05g硫酸鎂0.2g/低聚半乳糖混合物10g瓊脂15氯化鈣0.008g碳酸氫鈉0.4g/氯化鈉0.08g瓊脂15g水1000mLpH6.2瓊脂15~20g水1000mLpH7.0水1000mLpH6.3案例2—腸泰合劑出處種標(biāo)準(zhǔn)收錄?

中成藥品種，WS-11511(ZD-1511)-2018修訂內(nèi)容中未涉及微生物內(nèi)容。/屬雙歧桿菌屬雙歧桿菌科雙歧桿菌目放線菌綱?

2004版標(biāo)準(zhǔn)，2018版標(biāo)準(zhǔn)中并未明確生產(chǎn)菌種的種名，只標(biāo)稱(chēng)雙歧桿菌?？颇?

企業(yè)對(duì)于菌

的生產(chǎn)過(guò)程控制意識(shí)不足。?

2019年

企業(yè)聯(lián)系相關(guān)專(zhuān)業(yè)領(lǐng)域進(jìn)行生產(chǎn)調(diào)整。綱門(mén)放線菌門(mén)案例3—復(fù)合乳酸菌膠囊?

104批樣品中均存在鼠李糖乳桿菌和屎腸球菌。?

隨著室溫放置時(shí)間延長(zhǎng)，菌數(shù)不斷下降。樣品檢出伯杰氏手冊(cè)伯杰氏手冊(cè)膠囊標(biāo)準(zhǔn)收錄膠囊標(biāo)

樣品檢出

膠囊標(biāo)出處1984年乳酸乳桿菌重命名準(zhǔn)收錄

（小菌落）

準(zhǔn)收錄

乳酸鏈球菌

（大菌落）重命名種屬德氏乳桿菌乳酸亞種乳酸乳球菌乳酸亞種乳桿菌嗜乳桿菌

鼠李糖乳桿菌

乳酸鏈球菌屎腸球菌乳桿菌屬乳桿菌科鏈球菌屬

乳

菌屬

腸球菌屬鏈球菌科

腸球菌科科目綱門(mén)乳桿菌目芽孢桿菌綱厚壁菌門(mén)案例3—復(fù)合乳酸菌膠囊?

企業(yè)、三部微生態(tài)制劑

藥典委員會(huì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)。?

2019.1公示的標(biāo)準(zhǔn)中，修訂了菌種名稱(chēng)，增訂了“雜菌”檢查的要求。3國(guó)內(nèi)外法規(guī)探討中國(guó)藥典《中國(guó)藥典》2015年版三部，包含：?

前言?

基本要求?

造?

檢定?

保存、運(yùn)輸及有效期附錄1

已批

上市的微生態(tài)活菌制品附錄2

微生態(tài)活菌制品活菌數(shù)測(cè)定方法附錄3

微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法中國(guó)藥典雜菌檢查法（計(jì)數(shù)及控制菌

查）種子批到成品的檢定活

數(shù)測(cè)定方法種子批的檢定：生化反應(yīng)：按通則3605“細(xì)菌生化養(yǎng)基”選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基或其他事宜方法進(jìn)行，結(jié)果應(yīng)符合原始菌種的特性。選擇性瓊脂培

基是指最適宜制劑（或菌粉）中活菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。須經(jīng)批準(zhǔn)后方可使用?？刂凭鷻z查

—定性測(cè)定產(chǎn)品中

否污染特定致病菌或者條件致病菌；非致病性雜菌

—

定量測(cè)定產(chǎn)品中污染的雜菌；真菌計(jì)數(shù)

—定量測(cè)定產(chǎn)品中污染的真菌；?培??美國(guó)藥典〈64〉

PROBIOTIC

TESTSIDENTIFICATION?

ENUMERATION?

PERFORMANCE

TESTS?

CON

AMINANTS?

ADDITIONALREQUIREMENTS美國(guó)藥典菌種鑒定程序不產(chǎn)芽孢菌的鑒定法：用特異性引物鑒定乳酸菌和雙歧桿菌美國(guó)藥典活菌計(jì)數(shù)目前，本章收載了乳酸菌和雙歧桿菌的計(jì)數(shù)方法。其他益生菌株的計(jì)數(shù)方法，入芽孢菌、非芽孢菌、酵母菌或霉菌后續(xù)也將在本章中收載。也可采用其他微生物替代方法進(jìn)行計(jì)數(shù)試驗(yàn)，與USP<1223>接軌，一些新技術(shù)及替代方法也可被用于活菌計(jì)數(shù)只要證明是等效的。美國(guó)藥典歐洲藥典?

LIVE

BIOTHERAPEUTICPRODUCTSFORHUMANUSE?

2.6.36.

MICROBIOLOGICALEXAMINATIONOFLIVEBIOTHERAPEUTICPRODUCTS:TESTS

FORENUMERATIONMICROBIALCONTAMINANTS?

2.6.38.

MICROBI

LOGICALEXAMINATIONOFLIVEBIOTHERAPEUTICPRODUCTS:TESTS

FORSPECIFIEDMICRO-ORGANISMS歐洲藥典特征鑒定包括確定該菌株的表型和基因型，采用宏觀和微觀方法、生測(cè)試、分子遺傳學(xué)測(cè)試、測(cè)序或質(zhì)譜分析。株水平的鑒定歐洲藥典通過(guò)適當(dāng)?shù)奈⑸镉?jì)數(shù)試驗(yàn)，以CFU為單位來(lái)確定活性微生物數(shù)量。果以CFU/g、CFU/mL或CFU/unit示；應(yīng)不小于規(guī)定值或在規(guī)定的范圍內(nèi)。經(jīng)批準(zhǔn)，可以活細(xì)胞數(shù)/mL表示?；罹?jì)數(shù)方法應(yīng)經(jīng)相應(yīng)的方法適用性試驗(yàn)歐洲藥典雜菌計(jì)數(shù)檢查法，若活菌生物制劑（LBP）會(huì)干擾雜菌計(jì)數(shù)，則可按照右圖進(jìn)行優(yōu)化。合理且驗(yàn)證的其他方法也可被使用。歐洲藥典控制菌檢查采用2.6.6已驗(yàn)證的方法消除活菌或

他物質(zhì)的影響，如仍有干擾，則根據(jù)右圖所示進(jìn)行優(yōu)化。歐洲藥典若雜菌檢查方法不適用，則采取檢測(cè)是否存在特定的致病性微生物來(lái)代替雜數(shù)試驗(yàn)。歐洲藥典菌株必須具有穩(wěn)定的表型和基因型。菌株的抗菌素耐受性明確，任何可能從某種微生物轉(zhuǎn)移到相關(guān)微生物菌群

耐藥性須進(jìn)行調(diào)查和排除。在安全性方面，必須對(duì)毒力因子的存在進(jìn)行調(diào)查和評(píng)估。對(duì)菌株安全性的要求與中國(guó)藥典三部微生態(tài)活菌制品總論基本一致食品、保健食品相關(guān)法規(guī)聯(lián)合于2012年1月3日提出用作食品成分的益生菌推薦標(biāo)準(zhǔn)，并將其包括在新的附錄

XV中細(xì)菌17個(gè)屬酵母15個(gè)屬35個(gè)屬真菌3個(gè)屬美國(guó)USP及FCC食品、保健食品相關(guān)法規(guī)鑒定菌數(shù)配套相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范進(jìn)行約束安全性標(biāo)簽與效力美國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)運(yùn)行模式活性與遺傳穩(wěn)定性純度定期更新備案信息和標(biāo)準(zhǔn)方法國(guó)際保藏/參考菌株株傳代程序采用“企業(yè)備

制”運(yùn)輸和貯存美國(guó)USP及FCC食品、保健食品相關(guān)法規(guī)EFSA建立安全資格認(rèn)證QP，對(duì)添加到酵母11屬14種食品中的微生物實(shí)施上市前風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估細(xì)菌15屬74種通過(guò)安全資質(zhì)認(rèn)證的益生菌菌株88種EFSA（歐洲食品安全局）2016版食品、保健食品相關(guān)法規(guī)分類(lèi)學(xué)地位：通常要求其鑒定到種水平QPS菌種相關(guān)信息：使用歷史，科學(xué)文獻(xiàn)，臨床工業(yè)應(yīng)用，生態(tài)學(xué)及其他適當(dāng)因素估內(nèi)容致病性

：不具產(chǎn)毒特性最終用途EFSA（歐洲食品安全局）2016版食品、保健食品相關(guān)法規(guī)不得攜帶臨床用抗生素的耐藥性基因獲得性耐藥基因包括但不限于以下36種tetvanDaphvatbla

V

ManEaadblaKPCvanGarmblaCTX-MvanLrmtvanAvanMermvanBaaclnuvgaeremefmremsrmphcatlinlsacfruldhfrfloflexqepqnＲoqxAB食品、保健食品相關(guān)法規(guī)否分類(lèi)地位明確是知識(shí)體系完善是否計(jì)劃用途是否與傳統(tǒng)用途相似？計(jì)劃用途是否與人或動(dòng)物直接接觸？是是否已知的致病變體？是否是否產(chǎn)生有害代謝物？否是否是是其他危害？（如環(huán)境、耐藥性）毒性能否排除或人/動(dòng)物其他危害？（如環(huán)境、耐藥性）致病性能被排除

？接觸不多？是是否否否可界定的可界定的否是否否是QPS不適用QPSQPS不適用QPS不適用QPS（根據(jù)其他應(yīng)用）食品、保健食品相關(guān)法規(guī)有效

科學(xué)

開(kāi)放EFSA（歐洲食品安全局）2016版食品、保健食品相關(guān)法規(guī)衛(wèi)生部辦公廳

《可用于食品的菌種名單》食品、保健食品相關(guān)法規(guī)衛(wèi)生部辦公廳

《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》食品、保健食品相關(guān)法規(guī)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局

《益生菌類(lèi)保健食品申報(bào)與審評(píng)規(guī)定（試行）》食品、保健食品相關(guān)法規(guī)050307010904080206國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局

《益生菌類(lèi)保健食品申報(bào)與審評(píng)規(guī)定（試行）》4質(zhì)量控制方向完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定◆

解決同類(lèi)產(chǎn)品歸屬不同類(lèi)別管理帶來(lái)的質(zhì)量差異對(duì)不同類(lèi)產(chǎn)品統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)要求益生菌計(jì)數(shù)開(kāi)展方法適用性試驗(yàn)，盡量真實(shí)的反應(yīng)樣品中的活菌數(shù)培

基選擇策略——多聯(lián)的制品必要時(shí)考慮培養(yǎng)基的選擇性（對(duì)某些微生物有抑制）；盡量選擇非選擇的培養(yǎng)基；同類(lèi)培養(yǎng)基結(jié)果一致時(shí)選擇已獲得、性?xún)r(jià)比高的培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件選擇策略——培養(yǎng)溫度可以比較《中國(guó)藥典》四部通則需氧菌總培養(yǎng)時(shí)間選擇策略——通供

液制備過(guò)繪制活菌數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間變化趨勢(shì)圖確定適宜的培養(yǎng)時(shí)間。數(shù)培度和國(guó)選擇策略——比較不同混勻方式；加入表面活性劑等。其他因素標(biāo)中同類(lèi)菌培養(yǎng)溫度；培養(yǎng)方式根據(jù)菌種特性選擇確定即可。益生菌計(jì)數(shù)供試液的制備供試液的制備混合方式稀釋度無(wú)菌稱(chēng)取3.0g制品或菌粉（膠囊取內(nèi)容物），加入27.0

l稀釋液中，充分搖勻。稀釋液使用滅菌生理

化鈉溶液或其他適宜的稀釋液。選擇策略混勻方式需考慮（手搖、均質(zhì)袋均質(zhì)、刀片勻漿、渦旋）；混勻時(shí)間；當(dāng)存在輔料影響計(jì)數(shù)結(jié)果時(shí)（快速沉降），可以考慮

當(dāng)加入表面活性劑?；旌蠒r(shí)間添加劑益生菌計(jì)數(shù)例：蠟樣芽胞桿菌片活菌計(jì)數(shù)加玻璃珠振蕩器振30min加玻璃珠振蕩器振60min計(jì)數(shù)結(jié)果差異大，重復(fù)性差先手工研磨后加玻璃珠振蕩器振30min靜置2

in后加玻璃珠振蕩器振30min益生菌計(jì)數(shù)例：蠟樣芽胞桿菌片活菌計(jì)數(shù)勻漿杯7500rpm勻漿40s勻漿杯3000rpm勻漿3min?

各方法計(jì)數(shù)結(jié)果均比較穩(wěn)定?

加入表面活性劑吐溫80計(jì)數(shù)結(jié)果增加加1%吐溫后，勻漿杯7500rpm勻漿40s加1%吐

后，勻漿杯3000rpm勻漿3min益生菌計(jì)數(shù)◆

供試品制備對(duì)結(jié)果的影響計(jì)數(shù)結(jié)果差異大重復(fù)性差常規(guī)方法制備供試液計(jì)數(shù)結(jié)果增加重復(fù)性得以改善入玻璃珠后手工震蕩制備供試液計(jì)數(shù)結(jié)果增加重復(fù)性良好供試液中加入表面活性劑益生菌計(jì)數(shù)◆

稀釋度選擇對(duì)結(jié)果的影響微生物的分布以水中微生物分布為例。整瓶混合好的水中共含有30個(gè)細(xì)菌，將整瓶水平均分成10等份，每份平均含3個(gè)細(xì)菌，但實(shí)際每份細(xì)菌的數(shù)量在0～7范圍內(nèi)。水中微生物分布圖益生菌計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果為AB低稀釋級(jí)2.5×108

cfu/g10-6稀釋級(jí)計(jì)數(shù)結(jié)果為253、237計(jì)數(shù)結(jié)果為高稀釋級(jí)1.8×108

cfu/g10

稀釋級(jí)計(jì)數(shù)結(jié)果為14、21益生菌鑒定某些微生物有蔓延或者不規(guī)則生長(zhǎng)的特性益生菌計(jì)數(shù)保障產(chǎn)品活菌存供試液制備、培養(yǎng)基選擇等因素活

，例如壓片時(shí)

頭的壓力生產(chǎn)工藝檢驗(yàn)方法產(chǎn)品本身本身含菌的種類(lèi)及其性質(zhì)等例：芽孢類(lèi)微生態(tài)制劑的芽孢率對(duì)益生菌計(jì)數(shù)結(jié)果影響大益生菌計(jì)數(shù)探索方案探索獲得全部營(yíng)養(yǎng)體（芽孢率小于1%）以及全部芽孢的實(shí)驗(yàn)條件顯微鏡檢作為試驗(yàn)樣本經(jīng)典100℃加熱法流式細(xì)胞

術(shù)建立該產(chǎn)品的芽孢率測(cè)定方法益生菌計(jì)數(shù)60%50%40%系列120%10%0%051520253035時(shí)間（h）顯微鏡觀察芽孢率隨

床培養(yǎng)變化趨

圖全部營(yíng)養(yǎng)體（芽孢率小于1%）流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果注：P5為芽孢，P6為營(yíng)養(yǎng)體益生菌計(jì)數(shù)9008007006005000120100806040200系列1系列1300200100005152025303505101520253035時(shí)間（S）時(shí)）100℃加熱全部營(yíng)養(yǎng)體活菌化趨勢(shì)圖00℃加熱樣品活菌數(shù)變化趨勢(shì)圖益生菌計(jì)數(shù)圖1為樣品采用SYBRgreen+PI雙染后流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果；圖2為樣品僅采用SYBRgreen單染后流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果；圖3為搖床振蕩培養(yǎng)25h后SYBRgreen+PI雙染流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果；圖圖2圖4為搖床振蕩培養(yǎng)25h后SYBRgreen單染流式細(xì)胞儀的測(cè)定結(jié)果圖3圖4益生菌鑒定生化鑒定復(fù)雜多聯(lián)產(chǎn)品成分易相互影響01

0203

04對(duì)于常

語(yǔ)微生物活菌制品的菌，對(duì)其進(jìn)行鑒定往往需要三十種以化反應(yīng)，成本高、操作復(fù)雜。對(duì)于多聯(lián)產(chǎn)品，其成分較為復(fù)雜，難以對(duì)每一種成分進(jìn)行完全的分離培養(yǎng)。生化反應(yīng)不穩(wěn)定成本高、耗時(shí)長(zhǎng)對(duì)于株水平的生化反應(yīng)存在不穩(wěn)定性，

定合適的傳統(tǒng)生化鑒定需進(jìn)行大量的生化反應(yīng)，且從培養(yǎng)到鑒定需要數(shù)天。質(zhì)量管

標(biāo)準(zhǔn)。益生菌

定技術(shù)難點(diǎn)菌種鑒定◆

株水平的鑒定?

脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)ulsedFieldGel

Electrophoresis(PFGE)?

核糖體分型技術(shù)Ribotyping(RiboPrinter)?

全基因組測(cè)序Whole

Genome

Sequencing(WGS)?

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記Random

AmplifiedPolymorphic

DNA(RAPD)?

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性AmplifiedFragmentLengthPolymorphism(AFLP