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HBVDNA定量檢測(cè)

HBVDNA定量檢測(cè)HBVDNA定量檢測(cè)

1PCR基因的原理

一、PCR技術(shù)的發(fā)展及原理1971年，Kleppe等人首次在文章中準(zhǔn)確、客觀地闡述了PCR方法。1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的KaryMullis等人發(fā)明PCR技術(shù)。HBVDNA定量檢測(cè)PCR基因的原理一、PCR技術(shù)的發(fā)展及原理HBVDNA定2PCR原理PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴(kuò)增，加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù)“變性→退火→引物延伸”過程至25-40個(gè)循環(huán)，呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)大待測(cè)樣本中的核酸拷貝數(shù)。HBVDNA定量檢測(cè)PCR原理PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴(kuò)增，加熱使雙鏈DNA解3PCR的基本原理HBVDNA定量檢測(cè)PCR的基本原理HBVDNA定量檢測(cè)4PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀工作關(guān)鍵是溫度控制

HBVDNA定量檢測(cè)PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理HBVD5技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號(hào)的變化真實(shí)地反映了體系中模板的增加，通過檢測(cè)熒光信號(hào)，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。熒光實(shí)時(shí)定量PCR（real-timequantitativePCR,RQ-PCR）HBVDNA定量檢測(cè)技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號(hào)的6熒光定量PCR（fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR），又稱實(shí)時(shí)PCR，是目前較精確的進(jìn)行定量檢測(cè)PCR的方法FQ-PCR通過熒光信號(hào)對(duì)PCR過程中產(chǎn)物量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，精確計(jì)算出PCR的初始模板量HBVDNA定量檢測(cè)熒光定量PCR（fluorescencequantitat7熒光定量PCR是融合了PCR高靈敏性、DNA雜交高特異性和光譜分析的精確性，直接檢測(cè)擴(kuò)增過程中雙鏈DNA熒光信號(hào)的變化以獲得定量的結(jié)果。系統(tǒng)內(nèi)裝置有半導(dǎo)體PCR、鹵鎢燈光源激發(fā)熒光信號(hào)、光柵分光、超低溫光電耦合器（CCD）攝象機(jī)收集熒光信號(hào)、計(jì)算機(jī)軟件分析系統(tǒng)等。HBVDNA定量檢測(cè)熒光定量PCR是融合了PCR高靈敏性、DNA雜交高特異性和光8HBVDNA定量檢測(cè)HBVDNA定量檢測(cè)9HBVDNA定量檢測(cè)HBVDNA定量檢測(cè)10HBVDNA定量檢測(cè)HBVDNA定量檢測(cè)11熒光定量PCR檢測(cè)的是樣本的初始濃度，而準(zhǔn)確測(cè)定初始濃度需要在對(duì)數(shù)期進(jìn)行。Thesoftwaredisplaysthefluorescencesignalsinreal-timeimmediatelyaftereachmeasurement.Signalsfromthesamplesareobtainedasthemachinepositionsthecapillariessequentiallyovertheopticalunit.Duringthermalcycling,fluorescencecanbemeasuredoncepercycleforeverycapillaryandthefluorescencevaluesaredisplayedimmediatelyonthescreenandupdatedaftereverycycle(Fig.3).Thegenerateddataarestoredforfurtheranalysis.

熒光定量PCR在每一次循環(huán)后對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，因此能最準(zhǔn)確反映出對(duì)數(shù)期。確定準(zhǔn)確的初始濃度。軟件系統(tǒng)可以進(jìn)行參數(shù)設(shè)定、保存數(shù)據(jù)和報(bào)告結(jié)果，并將結(jié)果自動(dòng)保存在計(jì)算機(jī)中。HBVDNA定量檢測(cè)熒光定量PCR檢測(cè)的是樣本的初始濃度，而準(zhǔn)確測(cè)定初始濃度需要12相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。

HBVDNA定量檢測(cè)相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。HBVDNA定量檢測(cè)13①熒光定量技術(shù)要求在低濃度壞境。因?yàn)闊晒鈾z測(cè)定量原理是在忽略分子間相互作用的情況下建立的。如果分子濃度高了，影響作用很復(fù)雜，而PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是高濃度的，因此重復(fù)性變差也很容易理解。②由于擴(kuò)增末期，擴(kuò)增效率可能因?yàn)榇罅康陌行蛄卸a(chǎn)生不可控的影響。HBVDNA定量檢測(cè)①熒光定量技術(shù)要求在低濃度壞境。因?yàn)闊晒鈾z測(cè)定量原理是在忽略14

Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值分析實(shí)際上就是低濃度的熒光值分析。由于是低濃度，影響因素小，所以具有良好的重現(xiàn)性。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。HBVDNA定量檢測(cè)Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct15利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。HBVDNA定量檢測(cè)利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始16熒光信號(hào)的檢測(cè)方法：1、DNA結(jié)合染料技術(shù)2、水解探針技術(shù)（TaqManprobe）技術(shù)3、雜交探針技術(shù)4、分子信標(biāo)HBVDNA定量檢測(cè)熒光信號(hào)的檢測(cè)方法：HBVDNA定量檢測(cè)17ThebiggestdisadvantageofSYBRisthatitbindstoanydsDNA;thespecificproduct,non-specificproductsandprimerdimersaredetectedequallywell.

TheLightCyclerInstrumentallowsmeltingcurveanalysisOncethemeltingpointoftheproducthasbeendeterminedtheLightCyclerInstrument'sflexibleprogrammingallowstheusertoacquirefluorescenceabovethemeltingtemperatureoftheprimerdimers,butbelowthemeltingtemperatureoftheproduct.

缺點(diǎn)：存在非特異性產(chǎn)物，可以與非特異性產(chǎn)物，甚至引物二聚體結(jié)合發(fā)出熒光。可以使用熔點(diǎn)曲線分析進(jìn)行鑒別，明顯提高診斷的特異性。（F1通道）HBVDNA定量檢測(cè)ThebiggestdisadvantageofSY182、TaqMan水解探針技術(shù)HBVDNA定量檢測(cè)2、TaqMan水解探針技術(shù)HBVDNA定量檢測(cè)19HBVDNA定量檢測(cè)HBVDNA定量檢測(cè)20HBVDNA定量檢測(cè)HBVDNA定量檢測(cè)21HBVDNA定量檢測(cè)HBVDNA定量檢測(cè)22雜交探針技術(shù)對(duì)PCR產(chǎn)物定量又稱熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET需要一對(duì)引物和一對(duì)探針，探針A的3`端為熒光染料供體；探針B的5`端作為熒光染料受體。2個(gè)探針首尾相連，僅差一個(gè)堿基。檢測(cè)在退火時(shí)進(jìn)行。HBVDNA定量檢測(cè)雜交探針技術(shù)對(duì)PCR產(chǎn)物定量又稱熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RETH23AdvantagesoftheLightCyclerSystemWatchamplificationasitoccurs:real-time,on-linefluorescenceallowsyoutoseetheresultsofeverycycleassoonasPCRproceedsSavetime:extremelyrapidPCR,20minutesfor30cyclesVerifyampliconspecificity:meltingcurveanalysisprovidesdifferentiationbetweenamplificationproductsDetectmutations:changesinthemeltingcurveanalysiscanbeusedtoidentifymutationsMinimizecontamination:amplificationanddetectionareperformedinthesameclosedtube熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)1）定量準(zhǔn)確，實(shí)時(shí)監(jiān)控2）敏感性和特異性高3）簡(jiǎn)單快速，30個(gè)循環(huán)20幾分鐘就能夠完成。4）污染可能性小5）不需要常規(guī)的產(chǎn)物后期復(fù)雜處理，直接觀測(cè)結(jié)果6）可以進(jìn)行點(diǎn)突變分析，根據(jù)熔點(diǎn)曲線的不同直接分析點(diǎn)突變的情況。HBVDNA定量檢測(cè)AdvantagesoftheLightCycler24Figure3.Mutationdetectionbymeltingcurveanalysis.Toppanel:meltingcurvesofamplifiedgenefragmentsfromwild-typeandmutantindividuals.Bottompanel:negativefirstderivativesofthemeltingcurvesshowingtheuniquemeltingpeakofeachgenotype.Thegenefragmentamplifiedfromtheheterozygousindividualexhibitsameltingcurvewithboththewild-typeandmutantpeaks(redplot).

HBVDNA定量檢測(cè)Figure3.Mutationdetectionb25HBV的定量檢測(cè)標(biāo)本：病人血清200μl檢測(cè)：HBV病毒核酸載量檢測(cè)樣本：陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品、病人HBVDNA檢測(cè)步驟：HBVDNA提取；熒光定量PCR；結(jié)果分析定量PCR方法：TaqMan水解探針技術(shù)HBVDNA定量檢測(cè)HBV的定量檢測(cè)標(biāo)本：病人血清200μlHBVDNA定量檢測(cè)26標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線HBVDNA定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線HBVDNA定量檢測(cè)27標(biāo)準(zhǔn)曲線HBVDNA定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線HBVDNA定量檢測(cè)28報(bào)告結(jié)果：HBVDNA拷貝數(shù)/ml，如6.20×106拷貝數(shù)/ml或6.20E+06

參考范圍：最小檢測(cè)值，5×102拷貝數(shù)/ml（5E+02）

HBVDNA定量檢測(cè)報(bào)告結(jié)果：HBVDNA拷貝數(shù)/ml，HBVDNA定量檢測(cè)29HBVDNA定量檢測(cè)

HBVDNA定量檢測(cè)HBVDNA定量檢測(cè)

30PCR基因的原理

一、PCR技術(shù)的發(fā)展及原理1971年，Kleppe等人首次在文章中準(zhǔn)確、客觀地闡述了PCR方法。1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的KaryMullis等人發(fā)明PCR技術(shù)。HBVDNA定量檢測(cè)PCR基因的原理一、PCR技術(shù)的發(fā)展及原理HBVDNA定31PCR原理PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴(kuò)增，加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù)“變性→退火→引物延伸”過程至25-40個(gè)循環(huán)，呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)大待測(cè)樣本中的核酸拷貝數(shù)。HBVDNA定量檢測(cè)PCR原理PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴(kuò)增，加熱使雙鏈DNA解32PCR的基本原理HBVDNA定量檢測(cè)PCR的基本原理HBVDNA定量檢測(cè)33PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀工作關(guān)鍵是溫度控制

HBVDNA定量檢測(cè)PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理HBVD34技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號(hào)的變化真實(shí)地反映了體系中模板的增加，通過檢測(cè)熒光信號(hào)，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。熒光實(shí)時(shí)定量PCR（real-timequantitativePCR,RQ-PCR）HBVDNA定量檢測(cè)技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號(hào)的35熒光定量PCR（fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR），又稱實(shí)時(shí)PCR，是目前較精確的進(jìn)行定量檢測(cè)PCR的方法FQ-PCR通過熒光信號(hào)對(duì)PCR過程中產(chǎn)物量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，精確計(jì)算出PCR的初始模板量HBVDNA定量檢測(cè)熒光定量PCR（fluorescencequantitat36熒光定量PCR是融合了PCR高靈敏性、DNA雜交高特異性和光譜分析的精確性，直接檢測(cè)擴(kuò)增過程中雙鏈DNA熒光信號(hào)的變化以獲得定量的結(jié)果。系統(tǒng)內(nèi)裝置有半導(dǎo)體PCR、鹵鎢燈光源激發(fā)熒光信號(hào)、光柵分光、超低溫光電耦合器（CCD）攝象機(jī)收集熒光信號(hào)、計(jì)算機(jī)軟件分析系統(tǒng)等。HBVDNA定量檢測(cè)熒光定量PCR是融合了PCR高靈敏性、DNA雜交高特異性和光37HBVDNA定量檢測(cè)HBVDNA定量檢測(cè)38HBVDNA定量檢測(cè)HBVDNA定量檢測(cè)39HBVDNA定量檢測(cè)HBVDNA定量檢測(cè)40熒光定量PCR檢測(cè)的是樣本的初始濃度，而準(zhǔn)確測(cè)定初始濃度需要在對(duì)數(shù)期進(jìn)行。Thesoftwaredisplaysthefluorescencesignalsinreal-timeimmediatelyaftereachmeasurement.Signalsfromthesamplesareobtainedasthemachinepositionsthecapillariessequentiallyovertheopticalunit.Duringthermalcycling,fluorescencecanbemeasuredoncepercycleforeverycapillaryandthefluorescencevaluesaredisplayedimmediatelyonthescreenandupdatedaftereverycycle(Fig.3).Thegenerateddataarestoredforfurtheranalysis.

熒光定量PCR在每一次循環(huán)后對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，因此能最準(zhǔn)確反映出對(duì)數(shù)期。確定準(zhǔn)確的初始濃度。軟件系統(tǒng)可以進(jìn)行參數(shù)設(shè)定、保存數(shù)據(jù)和報(bào)告結(jié)果，并將結(jié)果自動(dòng)保存在計(jì)算機(jī)中。HBVDNA定量檢測(cè)熒光定量PCR檢測(cè)的是樣本的初始濃度，而準(zhǔn)確測(cè)定初始濃度需要41相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。

HBVDNA定量檢測(cè)相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。HBVDNA定量檢測(cè)42①熒光定量技術(shù)要求在低濃度壞境。因?yàn)闊晒鈾z測(cè)定量原理是在忽略分子間相互作用的情況下建立的。如果分子濃度高了，影響作用很復(fù)雜，而PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是高濃度的，因此重復(fù)性變差也很容易理解。②由于擴(kuò)增末期，擴(kuò)增效率可能因?yàn)榇罅康陌行蛄卸a(chǎn)生不可控的影響。HBVDNA定量檢測(cè)①熒光定量技術(shù)要求在低濃度壞境。因?yàn)闊晒鈾z測(cè)定量原理是在忽略43

Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值分析實(shí)際上就是低濃度的熒光值分析。由于是低濃度，影響因素小，所以具有良好的重現(xiàn)性。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。HBVDNA定量檢測(cè)Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct44利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。HBVDNA定量檢測(cè)利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始45熒光信號(hào)的檢測(cè)方法：1、DNA結(jié)合染料技術(shù)2、水解探針技術(shù)（TaqManprobe）技術(shù)3、雜交探針技術(shù)4、分子信標(biāo)HBVDNA定量檢測(cè)熒光信號(hào)的檢測(cè)方法：HBVDNA定量檢測(cè)46ThebiggestdisadvantageofSYBRisthatitbindstoanydsDNA;thespecificproduct,non-specificproductsandprimerdimersaredetectedequallywell.

TheLightCyclerInstrumentallowsmeltingcurveanalysisOncethemeltingpointoftheproducthasbeendeterminedtheLightCyclerInstrument'sflexibleprogrammingallowstheusertoacquirefluorescenceabovethemeltingtemperatureoftheprimerdimers,butbelowthemeltingtemperatureoftheproduct.

缺點(diǎn)：存在非特異性產(chǎn)物，可以與非特異性產(chǎn)物，甚至引物二聚體結(jié)合發(fā)出熒光?？梢允褂萌埸c(diǎn)曲線分析進(jìn)行鑒別，明顯提高診斷的特異性。（F1通道）HBVDNA定量檢測(cè)ThebiggestdisadvantageofSY472、TaqMan水解探針技術(shù)HBVDNA定量檢測(cè)2、TaqMan水解探針技術(shù)HBVDNA定量檢測(cè)48HBVDNA定量檢測(cè)HBVDNA定量檢測(cè)49HBVDNA定量檢測(cè)HBVDNA定量檢測(cè)50HBVDNA定量檢測(cè)HBVDNA定量檢測(cè)51雜交探針技術(shù)對(duì)PCR產(chǎn)物定量又稱熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET需要一對(duì)引物和一對(duì)探針，探針A的3`端為熒光染料供體；探針B的5`端作為熒光染料受體。2個(gè)探針首尾相連，僅差一個(gè)堿基。檢測(cè)在退火時(shí)進(jìn)行。HBVDNA定量檢測(cè)雜交探針技術(shù)對(duì)PCR產(chǎn)物定量又稱熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RETH52AdvantagesoftheLightCyclerSystemWatchamplificationasitoccurs:real-time,on-linefluorescenceallowsyoutoseetheresultsofeverycycleassoonasPCRproceedsSavetime:extremelyrapidPCR,20minutesfor30cyclesVerifyampliconspecificity:meltingcurveanalysisprovidesdifferentiationbetweenamplificationproductsDetectmutations:changesinthemeltingcurveanalysiscanbeusedtoidentifymutationsMinimizecontamination:amplificationanddetectionareperformedinthesameclosedtube熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)1）定量準(zhǔn)確，實(shí)時(shí)監(jiān)控2）敏感性和特異性高3）簡(jiǎn)單快速，30個(gè)循環(huán)20幾分鐘就能夠完成。4）污染可能性小5）不需要