第九章藥品的生物檢定法-第五章色譜檢測技術(shù)課件

第五模塊生物檢測技術(shù)

第九章藥品的生物檢定法第五模塊生物檢測技術(shù)

第九章藥品的生物檢定法1知識目標

理解熱原檢查法、細菌內(nèi)毒素檢查法的含義；掌握無菌檢查法、微生物限度檢查的主要方法；理解藥物異常毒性檢查的方法技能目標能檢查藥物制劑的熱原、細菌內(nèi)毒素；能進行藥物的無菌檢查；能測定藥物的微生物限度；能檢查藥物的異常毒性學習目標知識目標學習目標2復(fù)習提問

1．什么是管碟法？管碟法操作的主要流程？2．雙碟的制備方法？復(fù)習提問1．什么是管碟法？管碟法操作的主要流程？2．雙碟的3新課大綱本節(jié)主要內(nèi)容：熱原檢查:

1.簡述2.具體操作方法內(nèi)毒素檢查:

1.簡述2.具體操作步驟

新課大綱本節(jié)主要內(nèi)容：4一、概述

－－用整體動物的體內(nèi)試驗或離休器官、組織、細胞等的體外試驗來測定藥品生物活性，以反映其臨床功能及效價的一種方法。1.生物檢定法一、概述1.生物檢定法5常見藥物的生物檢定法肝素絨促性素縮宮素胰島素洋地黃常見藥物的生物檢定法肝素絨促性素縮宮素胰島素洋地黃6二、熱原檢查法二、熱原檢查法7含熱原的注射液注入家兔體內(nèi)，引起體溫升高40度以上，甚至出現(xiàn)昏迷、休克、死亡的現(xiàn)象。2.什么是熱原反應(yīng)？含熱原的注射液注入家兔體內(nèi)，引起體溫升高40度以上，甚至出現(xiàn)83.熱原的基本性質(zhì)？水溶性、不揮發(fā)性、耐熱性、濾過性3.熱原的基本性質(zhì)？水溶性、不揮發(fā)性、耐熱性、濾過性94.污染途徑溶劑帶入原料帶入容器用具帶入制備過程污染滅菌不完全使用帶入4.污染途徑溶劑帶入105.除去方法吸附法、離子交換法、反滲透法、超濾、高溫、酸堿5.除去方法吸附法、離子交換法、反滲透法、超濾、高溫、酸堿116.檢查方法家兔致熱實驗法6.檢查方法家兔致熱實驗法127.具體步驟靜脈注入藥物，觀察家兔體溫升高情況，超過限度認為有熱原反應(yīng)供試用家兔試驗前的準備檢查法結(jié)果判斷7.具體靜脈注入藥物，觀察家兔體溫升高情況，超過限度認為有熱133只兔：1小時測1次，共3次，最高-最低＝升高的溫度結(jié)果：均升高在0.6度以下且升高的總數(shù)在1.4以下認為符合規(guī)定3只兔：1小時測1次，共3次，最高-最低＝升高的溫度14智能熱原儀智能熱原儀15第九章藥品的生物檢定法--第五章色譜檢測技術(shù)課件16溫度探頭溫度探頭17本法是利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素（單位以EU表示），以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法。三、細菌內(nèi)毒素檢查法本法是利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素（18系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測或半定量內(nèi)毒素的方法。分為濁度法和顯色基質(zhì)法。①濁度法系利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量的方法?？煞譃榻K點濁度法和動態(tài)濁度法。②顯色基質(zhì)法系利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少而測定內(nèi)毒素含量的方法?？煞譃榻K點顯色法和動態(tài)顯色法。

凝膠法光度測定法凝膠法光度測定法19內(nèi)毒素與鱟試劑起反應(yīng)產(chǎn)生凝膠，觀察到渾濁。什么是鱟試劑？什么是細菌內(nèi)毒素？1.凝膠法原理內(nèi)毒素與鱟試劑起反應(yīng)產(chǎn)生凝膠，觀察到渾濁。什么是鱟試劑？什么20①來源：G-細胞壁外膜上的脂多糖（LPS）成分，所以內(nèi)毒素是化學成分不是簡單的生命體，所以滅內(nèi)毒素時應(yīng)與其他成分區(qū)分。什么是細菌內(nèi)毒素？①來源：G-細胞壁外膜上的脂多糖（LPS）成分，所以內(nèi)毒素是21

②化學結(jié)構(gòu)：

abca(o－特異性多糖鏈)類似于抗原，親水性b核心多糖c類脂A，疏水性，是生理活性中心，實驗證明，將a和b切下來組合后與c部分產(chǎn)生的效果相當，所以認為c是生理活性部位。②化學結(jié)構(gòu)：22③特點：根據(jù)其特殊結(jié)構(gòu)，疏水基團易粘合在容器的器壁，而在水中的濃度就變低，另一方面疏水端相連結(jié)后，親水端再與別的疏水端相連而成大的集團，使其在水中的分布不均勻，所以藥典規(guī)定在使用時要經(jīng)過振蕩及混旋15分鐘，并立即做下一步操作，但這種現(xiàn)象只限于人工提純品。③特點：根據(jù)其特殊結(jié)構(gòu)，疏水基團易粘合在容器的器壁，而在水中23④與熱原的關(guān)系：廣義熱原包括內(nèi)毒素、生物酶、蛋白質(zhì)、化學物質(zhì)（后三種成分也有致熱作用，但不引起器質(zhì)性的病變），而狹義的熱原就等于內(nèi)毒素（引起器質(zhì)性的病變）。所以藥品檢測時一般認為沒有內(nèi)毒素，合格時，熱原檢測也合格。④與熱原的關(guān)系：廣義熱原包括內(nèi)毒素、生物酶、蛋白質(zhì)、化學物質(zhì)24⑤分類：分國家標準品：（簡寫RSE或NSE）效價：9000，單位Eu,由中檢所生產(chǎn)，代號981就是指98年1月生產(chǎn)。和工作標準品：（CSE和WSE）效價：100－200，也有50或70，單位Eu，到中檢所購買，是法定試劑。⑤分類：25①拉丁文TAL（東方鱟）、LAL（美洲鱟），血液是藍色（還有蟬）。被稱為是活化石，大約生活在4億年前至今，體態(tài)基本沒有變化，品種有10多種，但能作為鱟試劑（血液變形細胞溶解物的無菌冷凍干燥品）用的只有3－5個，主要生活在日本沿海、中國沿海、北美沿海，在中國是二級保護動物，在日本是特級保護動物。不能人工養(yǎng)殖。什么是鱟試劑？①拉丁文TAL（東方鱟）、LAL（美洲鱟），血液是藍色（還有26②發(fā)現(xiàn)：1962年，美國的一個研究員Bang在海灘散步，發(fā)現(xiàn)很多鱟（也叫大王蟹）死了，他拿針管吸了海水，注入一個活鱟體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其很快死亡，1963年寫了一篇“鱟的一種致死疾病”文章，向研究所反應(yīng)，爭取一些經(jīng)費以此為主要研究方向，他的助手年輕人levin和他一起研究，發(fā)現(xiàn)G-細胞壁外膜上的脂多糖（LPS）成分引起鱟致死，共同發(fā)表文章“鱟的酶反應(yīng)機理”。②發(fā)現(xiàn)：1962年，美國的一個研究員Bang在海灘散步，發(fā)現(xiàn)27③反應(yīng)機理：鱟試劑中含有C、B因子，在脂多糖存在時成為激活因子，使凝血酶原變?yōu)槟?，又使凝固蛋白原變?yōu)槟痰鞍祝ǔ赡z狀），發(fā)生這樣的生化反應(yīng)。而口服與輸入血液的劑量相比100萬倍，所以人口服內(nèi)毒素不會發(fā)生發(fā)熱反應(yīng)，另一方面口服時人體也有一種屏障作用。日本認為血中0.1Eu/ml,就會有發(fā)熱反應(yīng)。③反應(yīng)機理：鱟試劑中含有C、B因子，在脂多糖存在時成為激活28凝膠法的靈敏度低：0.5Eu/ml，規(guī)格：0.1ml定量法高，0.06Eu/ml，工藝在凝膠法基礎(chǔ)上發(fā)展而來，0.6ml，也有1.2和3.1ml。④檢測方法區(qū)別：④檢測方法區(qū)別：29內(nèi)毒素小于0.03Eu/ml的無菌注射用水，鱟試劑反應(yīng)的PH：6－8，而工業(yè)生產(chǎn)要求為PH：5－7，所以不能以企業(yè)生產(chǎn)的滅菌注射用水來作為檢查用水，必須是中檢所指定生產(chǎn)。藥典規(guī)定凝膠法小于0.03Eu/ml，定量法小于0.005Eu/ml，買時要配套，與鱟試劑買一個廠家生產(chǎn)的。關(guān)于檢查用水內(nèi)毒素小于0.03Eu/ml的無菌注射用水，鱟試劑反應(yīng)的P30內(nèi)毒素檢查法內(nèi)毒素鱟試劑檢查用水內(nèi)毒素檢查法內(nèi)毒素鱟試劑檢查用水312.定量分析方法預(yù)設(shè)限值法：OD為0.02什么是OD?2.定量分析方法預(yù)設(shè)限值法：OD為0.02什么是OD?32OD：就是吸光度，儀器采用透光率下降到95%的點作為反應(yīng)時間臨界點，將95%取負對數(shù)正好是0.02OD：就是吸光度，儀器采用透光率下降到95%的點作為反應(yīng)時間333.實驗前期工作器材準備所需試劑用具的處理3.實驗前期工作器材準備34⑴稀釋內(nèi)毒素標準品⑵制備鱟試劑⑶制備標準曲線⑷生成標準曲線4.具體操作[示例]頭孢曲松鈉注射液內(nèi)毒素測定⑴稀釋內(nèi)毒素標準品4.具體操作35⑴稀釋內(nèi)毒素標準品

0.2ml0.20.20.21.8ml水1.81.81.8100Eu/ml1010.10.01⑴稀釋內(nèi)毒素標準品36

⑵制備鱟試劑⑶制備標準曲線10支小管分加0.1ml鱟試劑2個管陰性加水8個管加內(nèi)毒素標準品

⑵制備鱟試劑10支小管分加0.1ml鱟試劑2個管陰37⑷生成標準曲線待最后一個濃度點的反應(yīng)曲線超過0.02限值后，用鼠標點中“手動停止檢測”點擊“生成標準曲線”

⑷生成標準曲線38⑸樣品稀釋與加樣樣品四個濃度稀釋8個陽性管（如：40.80.160.320）平行2個，共8個管每個管加0.1鱟試劑⑸樣品稀釋與加樣每個管加0.1鱟試劑39

陽性對照：找出最佳稀釋倍數(shù)算出頭孢曲松鈉內(nèi)毒素濃度為0.065Eu/mg,小于限值0.2Eu/mg。結(jié)果分析陰性對照：反應(yīng)時間遠小于標準曲線0.01所用反應(yīng)時間，陰性合格結(jié)果分析陰性對照：反應(yīng)時間遠小于標準曲線0.01所用反應(yīng)40本課小結(jié)本課小結(jié)41課后習題家兔熱原檢查法如何操作？

濁度法檢測細菌內(nèi)毒素的具體操作步驟？課后習題濁度法檢測細菌內(nèi)42Thankyou!Thankyou!43第五模塊生物檢測技術(shù)

第九章藥品的生物檢定法第五模塊生物檢測技術(shù)

第九章藥品的生物檢定法44知識目標

理解熱原檢查法、細菌內(nèi)毒素檢查法的含義；掌握無菌檢查法、微生物限度檢查的主要方法；理解藥物異常毒性檢查的方法技能目標能檢查藥物制劑的熱原、細菌內(nèi)毒素；能進行藥物的無菌檢查；能測定藥物的微生物限度；能檢查藥物的異常毒性學習目標知識目標學習目標45復(fù)習提問

1．什么是管碟法？管碟法操作的主要流程？2．雙碟的制備方法？復(fù)習提問1．什么是管碟法？管碟法操作的主要流程？2．雙碟的46新課大綱本節(jié)主要內(nèi)容：熱原檢查:

1.簡述2.具體操作方法內(nèi)毒素檢查:

1.簡述2.具體操作步驟

新課大綱本節(jié)主要內(nèi)容：47一、概述

－－用整體動物的體內(nèi)試驗或離休器官、組織、細胞等的體外試驗來測定藥品生物活性，以反映其臨床功能及效價的一種方法。1.生物檢定法一、概述1.生物檢定法48常見藥物的生物檢定法肝素絨促性素縮宮素胰島素洋地黃常見藥物的生物檢定法肝素絨促性素縮宮素胰島素洋地黃49二、熱原檢查法二、熱原檢查法50含熱原的注射液注入家兔體內(nèi)，引起體溫升高40度以上，甚至出現(xiàn)昏迷、休克、死亡的現(xiàn)象。2.什么是熱原反應(yīng)？含熱原的注射液注入家兔體內(nèi)，引起體溫升高40度以上，甚至出現(xiàn)513.熱原的基本性質(zhì)？水溶性、不揮發(fā)性、耐熱性、濾過性3.熱原的基本性質(zhì)？水溶性、不揮發(fā)性、耐熱性、濾過性524.污染途徑溶劑帶入原料帶入容器用具帶入制備過程污染滅菌不完全使用帶入4.污染途徑溶劑帶入535.除去方法吸附法、離子交換法、反滲透法、超濾、高溫、酸堿5.除去方法吸附法、離子交換法、反滲透法、超濾、高溫、酸堿546.檢查方法家兔致熱實驗法6.檢查方法家兔致熱實驗法557.具體步驟靜脈注入藥物，觀察家兔體溫升高情況，超過限度認為有熱原反應(yīng)供試用家兔試驗前的準備檢查法結(jié)果判斷7.具體靜脈注入藥物，觀察家兔體溫升高情況，超過限度認為有熱563只兔：1小時測1次，共3次，最高-最低＝升高的溫度結(jié)果：均升高在0.6度以下且升高的總數(shù)在1.4以下認為符合規(guī)定3只兔：1小時測1次，共3次，最高-最低＝升高的溫度57智能熱原儀智能熱原儀58第九章藥品的生物檢定法--第五章色譜檢測技術(shù)課件59溫度探頭溫度探頭60本法是利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素（單位以EU表示），以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法。三、細菌內(nèi)毒素檢查法本法是利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素（61系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測或半定量內(nèi)毒素的方法。分為濁度法和顯色基質(zhì)法。①濁度法系利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量的方法?？煞譃榻K點濁度法和動態(tài)濁度法。②顯色基質(zhì)法系利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少而測定內(nèi)毒素含量的方法。可分為終點顯色法和動態(tài)顯色法。

凝膠法光度測定法凝膠法光度測定法62內(nèi)毒素與鱟試劑起反應(yīng)產(chǎn)生凝膠，觀察到渾濁。什么是鱟試劑？什么是細菌內(nèi)毒素？1.凝膠法原理內(nèi)毒素與鱟試劑起反應(yīng)產(chǎn)生凝膠，觀察到渾濁。什么是鱟試劑？什么63①來源：G-細胞壁外膜上的脂多糖（LPS）成分，所以內(nèi)毒素是化學成分不是簡單的生命體，所以滅內(nèi)毒素時應(yīng)與其他成分區(qū)分。什么是細菌內(nèi)毒素？①來源：G-細胞壁外膜上的脂多糖（LPS）成分，所以內(nèi)毒素是64

②化學結(jié)構(gòu)：

abca(o－特異性多糖鏈)類似于抗原，親水性b核心多糖c類脂A，疏水性，是生理活性中心，實驗證明，將a和b切下來組合后與c部分產(chǎn)生的效果相當，所以認為c是生理活性部位。②化學結(jié)構(gòu)：65③特點：根據(jù)其特殊結(jié)構(gòu)，疏水基團易粘合在容器的器壁，而在水中的濃度就變低，另一方面疏水端相連結(jié)后，親水端再與別的疏水端相連而成大的集團，使其在水中的分布不均勻，所以藥典規(guī)定在使用時要經(jīng)過振蕩及混旋15分鐘，并立即做下一步操作，但這種現(xiàn)象只限于人工提純品。③特點：根據(jù)其特殊結(jié)構(gòu)，疏水基團易粘合在容器的器壁，而在水中66④與熱原的關(guān)系：廣義熱原包括內(nèi)毒素、生物酶、蛋白質(zhì)、化學物質(zhì)（后三種成分也有致熱作用，但不引起器質(zhì)性的病變），而狹義的熱原就等于內(nèi)毒素（引起器質(zhì)性的病變）。所以藥品檢測時一般認為沒有內(nèi)毒素，合格時，熱原檢測也合格。④與熱原的關(guān)系：廣義熱原包括內(nèi)毒素、生物酶、蛋白質(zhì)、化學物質(zhì)67⑤分類：分國家標準品：（簡寫RSE或NSE）效價：9000，單位Eu,由中檢所生產(chǎn)，代號981就是指98年1月生產(chǎn)。和工作標準品：（CSE和WSE）效價：100－200，也有50或70，單位Eu，到中檢所購買，是法定試劑。⑤分類：68①拉丁文TAL（東方鱟）、LAL（美洲鱟），血液是藍色（還有蟬）。被稱為是活化石，大約生活在4億年前至今，體態(tài)基本沒有變化，品種有10多種，但能作為鱟試劑（血液變形細胞溶解物的無菌冷凍干燥品）用的只有3－5個，主要生活在日本沿海、中國沿海、北美沿海，在中國是二級保護動物，在日本是特級保護動物。不能人工養(yǎng)殖。什么是鱟試劑？①拉丁文TAL（東方鱟）、LAL（美洲鱟），血液是藍色（還有69②發(fā)現(xiàn)：1962年，美國的一個研究員Bang在海灘散步，發(fā)現(xiàn)很多鱟（也叫大王蟹）死了，他拿針管吸了海水，注入一個活鱟體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其很快死亡，1963年寫了一篇“鱟的一種致死疾病”文章，向研究所反應(yīng)，爭取一些經(jīng)費以此為主要研究方向，他的助手年輕人levin和他一起研究，發(fā)現(xiàn)G-細胞壁外膜上的脂多糖（LPS）成分引起鱟致死，共同發(fā)表文章“鱟的酶反應(yīng)機理”。②發(fā)現(xiàn)：1962年，美國的一個研究員Bang在海灘散步，發(fā)現(xiàn)70③反應(yīng)機理：鱟試劑中含有C、B因子，在脂多糖存在時成為激活因子，使凝血酶原變?yōu)槟?，又使凝固蛋白原變?yōu)槟痰鞍祝ǔ赡z狀），發(fā)生這樣的生化反應(yīng)。而口服與輸入血液的劑量相比100萬倍，所以人口服內(nèi)毒素不會發(fā)生發(fā)熱反應(yīng)，另一方面口服時人體也有一種屏障作用。日本認為血中0.1Eu/ml,就會有發(fā)熱反應(yīng)。③反應(yīng)機理：鱟試劑中含有C、B因子，在脂多糖存在時成為激活71凝膠法的靈敏度低：0.5Eu/ml，規(guī)格：0.1ml定量法高，0.06Eu/ml，工藝在凝膠法基礎(chǔ)上發(fā)展而來，0.6ml，也有1.2和3.1ml。④檢測方法區(qū)別：④檢測方法區(qū)別：72內(nèi)毒素小于0.03Eu/ml的無菌注射用水，鱟試劑反應(yīng)的PH：6－8，而工業(yè)生產(chǎn)要求為PH：5－7，所以不能以企業(yè)生產(chǎn)的滅菌注射用水來作為檢查用水，必須是中檢所指定生產(chǎn)。藥典規(guī)定凝膠法小于0.03Eu/ml，定量法小于0.005Eu/ml，買時要配套，與鱟試劑買一個廠家生產(chǎn)的。關(guān)于檢查用水內(nèi)毒素小于0.03Eu/ml的無菌注射用水，鱟試劑反應(yīng)的P73內(nèi)毒素檢查法內(nèi)毒素鱟試劑檢查用水內(nèi)毒素檢查法內(nèi)毒素鱟試劑檢查用水742.定量分析方法預(yù)設(shè)限值法：OD為0.02什么是OD?2.定量分析方法預(yù)設(shè)限值法：OD為0.02什么是OD?75OD：就是吸光度，儀器采用透光率下降到95%的點作為反應(yīng)時間臨界點，將95%取負對數(shù)正好是0.02OD：就是吸光度，儀器采用透光率下降到95%的點作為反