蛋白質(zhì)工程第四講分離純化與分析

關(guān)于蛋白質(zhì)工程第四講分離純化與分析第1頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六一、分離純化是分析的重要過程：針對分析目的不同，對分析對象的要求和采取的措施不同。若分析過程干擾很小，特異性很高，不需要對樣品處理可直接測定。如：抗原及其抗體檢測，配體及其配基等。多數(shù)樣品常常需要處理，才能滿足檢測的要求。如：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、動力學(xué)（變復(fù)性）分析、酶學(xué)性質(zhì)研究等，純度要求很高、避免干擾分析。為了保證分析的準(zhǔn)確度，避免檢測體系中某些物質(zhì)的干擾，往往對樣品進(jìn)行處理。第2頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六二、分離分析的含義：1、分離過程本身可以是分析過程 樣品干擾嚴(yán)重，需通過分離再檢查， 分離過程和分析過程耦合，分析性色譜技術(shù)（HPLC、TLC）2、分離過程的分析——優(yōu)化純化工藝 分離過程管理：定性分析、定量分析、純度、結(jié)構(gòu)和功能分析等3、基本要求：

客觀、準(zhǔn)確性，反映分析對象（目的物質(zhì)）的真實(shí)性。4、分析方法要求： 選擇性（特異性）、精確度、靈敏度、重復(fù)性等第一節(jié)概述第3頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六三、如何理解分離純化與分析（三個(gè)層次）物質(zhì)的分析離不開分離： 分析要求樣品的純度：對樣品進(jìn)行分離純化：如蛋白質(zhì)、核酸等結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的分析；物質(zhì)分離純化過程離不開分析檢測： 分離組分的收集、純度、含量和組分分析；即分離過程管理。分離純化過程即是分析檢測過程： 電泳、HPLC/Ms、GC/Ms、薄層層析(TLC)等；分析是對事物的感知，是眼睛、是手段第4頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六一、概述1、一般原理：

依據(jù)分離對象（物質(zhì)）的溶解度、大小在相態(tài)中的分配等特性對物質(zhì)進(jìn)行分離純化。2、基本程序：樣品處理、粗分和精分（例如：蛋白質(zhì)的分離純化）3、分類：初級分離：沉淀法、膜分離、萃取法、離心法等精制純化： 吸附層析、凝膠過濾、離子交換、疏水性相互作用色譜、反向色譜、親和層析第二節(jié)分離與純化第5頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六二、初級分離（要求：靈活運(yùn)用）目的——分離對象（物質(zhì)）初步分離、濃縮、富集的過程。方法及原理：1、沉淀分級分離：鹽析分級：中性鹽（NH4SO4、Na2SO4等等），例如蛋白酶等蛋白質(zhì)類等電點(diǎn)分級：有機(jī)溶劑：熱沉淀：其它： 鹽復(fù)合物、酸堿變性、表面活性劑、 三氯乙酸、PEG、重金屬等聯(lián)合使用：鹽析—等電點(diǎn)鹽析原理示意圖第6頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六2、膜分離：膜分離方法及原理：透析，微濾，納濾，超濾，反滲透，電滲析膜材料和特性：有機(jī)膜：（醋酸纖維素、硝基纖維素、聚砜膜、聚砜酰胺膜、聚丙烯腈膜等）陶瓷膜：陶瓷材料膜組件：管式膜組件，平板式膜組件，螺旋卷式膜組件，中空纖維（毛細(xì)管）等應(yīng)用：菌體分離，小分子產(chǎn)物分離和回收，蛋白質(zhì)的分離和回收、濃縮和純化等，膜生物反應(yīng)器。3、萃?。?、離心：分類：低速離心、高速離心、超速離心分離方式：差速離心、浮力密度離心（連續(xù)梯度、非連續(xù)梯度）5、其它：鹽復(fù)合物、酸堿變性、表面活性劑、三氯乙酸、PEG、重金屬等6、聯(lián)用方法：膜過濾-鹽析—等電點(diǎn)，離心—萃取，離心-鹽析—等電點(diǎn)等等第7頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六B：精制分離—色譜分離：（A）精制過程，純度較高（B）方法和原理：流動相和固定相的分配系數(shù)不同。分配平衡很快，流動相為平推流。（1）吸附分離技術(shù)：吸附—解吸附平衡，固定相（吸附劑）—流動相（洗脫劑）分配系數(shù)不同和分配平衡。吸附—解吸附—再吸附的連續(xù)過程（固相和流動相之間連續(xù)分配的過程）吸附劑：吸附劑的選擇，表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低廉。吸附劑的選擇：根據(jù)吸附劑性質(zhì)和被分離對象的性質(zhì)選擇。極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)，非極性強(qiáng)的吸附劑易吸附非極性強(qiáng)的物質(zhì)。為了便于解吸附，對于極性大的分離對象，選擇極性小的吸附劑，反之亦然。吸附劑的選擇依靠經(jīng)驗(yàn)和多次試驗(yàn)。第8頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六吸附劑的種類：羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁等柱層析：羥基磷灰石，[Ca3(PO4)3OH2]，HA，酸性蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒等生命大分子。硅膠：含硅醇基團(tuán)（-Si-OH），氨基酸、甾體激素、皂苷類、類脂和色素等等。薄層層析：例如，硅膠薄層層析和聚酰胺薄膜薄層層析硅膠薄層層析：硅膠板，硅膠H（純硅膠），能用腐蝕性強(qiáng)的顯色劑；硅膠G（10%-15%煅石膏和5%淀粉的硅膠）；硅膠CMC（含羧甲基纖維素）；硅膠HF254(含熒光劑的硅膠H)，硅膠板的制備：玻璃板，硅膠制備（加溶劑碾磨），鋪板，活化，活化測定（約1mg蘇丹黃、蘇丹紅和靛酚藍(lán)混合物乙酸乙酯溶液點(diǎn)樣，苯做展層劑，Rf大小蘇丹黃>蘇丹紅.靛酚藍(lán)，蘇丹黃Rf）0.5，蘇丹紅和靛酚藍(lán)Rf之差在0.1—0.2)。分析程序：點(diǎn)樣，展層，顯色。第9頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六TLC色素指紋圖譜和灰度分析

圖4TLC色素指紋圖譜的圖像灰度分析曲線Fig.4IntensitycurveofpigmentfingerprintingsonTLC圖3色素的TLC指紋圖譜Fig.3ProfileofpigmentsfingerprintsonTLCa,OnceDevelopingMethod.b,

RepeatedDevelopingMethodT1→T11T11T1-4T10T9T8T7T6T5ab重復(fù)展層法：展層劑1為石油醚、正己烷、異丙醇、丙酮和甲醇比例=8-10：：：：0.25-0.35；展層劑2為石油醚：正己烷：異丙醇：丙酮，比例為10：0.95：：0.38-0.41。重復(fù)展層法呈現(xiàn)的TLC指紋圖譜能將CQV97菌株全色素分辨成11條不同顏色條帶的色素組分，從下而上依次為黃綠色、藍(lán)綠、深藍(lán)綠、綠色、紫色、黃色、黃色、紫色、紅色、紅棕色和橙黃色第10頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六聚酰胺薄膜薄層層析：DNS—氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯），靈敏度10-9~10-10mol/L。DNS-Cl和氨基酸或多肽在特定條件下反應(yīng)。DABTH-氨基酸的薄層層析分析蛋白質(zhì)序列。Edman降解試劑DABITC（4-N,N-二甲氨基偶氮苯-4’-異硫氰酸酯）進(jìn)行微量蛋白質(zhì)序列分析（2—10nmol肽樣品）。第11頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六單向紙層析第12頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六雙向紙層析第13頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六薄層層析第14頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六（2）凝膠過濾：排阻色譜或分子篩層析，根據(jù)分子顆粒大小進(jìn)行分離原理：分子在篩孔中自由擴(kuò)散、滲透，由于分子在篩孔中的分配系數(shù)不同，將分子分離。排阻的范圍為0—100%。分配系數(shù)：分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系。

Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)Vt=Vo+Vi+Vg，Vt、Vo、Vi和Vg分別為床體積、外水體積、內(nèi)水體積和介質(zhì)的體積。分離物質(zhì)的大小，0<Kav<1，Kav=0或Kav=1，不能分離。第15頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六常用介質(zhì)：交聯(lián)葡聚糖（SephadexG10—G200）；AmershamBiosciences交聯(lián)瓊脂糖（SepharoseCL-4B,CL-6B）SephacrylS系列（聚丙烯酰胺-葡聚糖）Superdex系列（高交聯(lián)瓊脂糖-葡聚糖）Bio-BeadsS-X系列（苯乙烯-二乙烯苯）Bio-GelP系列（聚丙烯酰胺）Bio-RadBio-GelA系列（瓊脂糖）TSKgelSW系列（硅膠）TSKgelToyopearlHW系列，親水性聚乙烯醇ToyoSodaTSKgelPW系列親水性聚乙烯TSKgelCW-35纖維素Cellulofine纖維素Chisso第16頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六操作程序：凝膠選擇和處理（型號和粒度、凝膠用量、凝膠處理）凝膠柱的制備（柱選擇，徑長比約為1:25—1:100，裝柱、柱鑒定），加樣和洗脫（加樣、洗脫、樣品收集，檢測）凝膠柱的再生和保存應(yīng)用：分離純化，脫鹽和濃縮，去熱源物質(zhì)、分析檢測（定性、定量、分子量）。第17頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六（3）離子交換：電荷大小陽離子交換劑：，羧甲基（-O-CH2-COO-）陰離子交換劑：氨基乙級（-O(CH2)2-NH3+）常用介質(zhì)DEAE（二乙胺基以及）—CelluloseDE-23DEAE—CelluloseDE-52DEAE-SephadexA-50（25）DEAE-SepharosCL-6bDEAE-Bio-GelACM-CelluloseDE-52CM-CelluloseDE-32CM-SephadexC-25(50)洗脫方式，梯度洗脫，線性和非線性洗脫應(yīng)用：物質(zhì)分離、測定等電點(diǎn)（PI）第18頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六第19頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六分離純化洗脫曲線和紫外吸收光譜圖3.A菌80%鹽析浮質(zhì)DEAE-52層析洗脫曲線圖4.A菌不同鹽濃度洗脫組分吸收光譜（a、b、c）。注：a、b、c中7個(gè)峰分別對應(yīng)不同NaCl濃度，：峰3、4為0.05~0.10M洗脫組分，峰5、6、7為0.1~0.15M洗脫組分，峰8為0.15~0.2M洗脫組分，峰9為0.20~0.30M洗脫峰。峰8稀釋6倍。圖7、8、9.分別為A菌Peak34、Peak7和Peak8組份分子篩層析結(jié)果。圖7圖8圖9注：圖均為280nm、380nm和480nm檢測波長下的洗脫曲線，此外圖中綠線代表鹽濃度；圖7中b為主要目標(biāo)蛋白，圖8中a為主要目標(biāo)蛋白，圖9中a為主要目標(biāo)蛋白；圖中標(biāo)注各主要目標(biāo)蛋白洗脫時(shí)間和洗脫體積，以及洗脫流速。A菌第20頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六（4）疏水性相互作用色譜，利用疏水作用不同將蛋白質(zhì)等大分子分離，利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán)（疏水性配基）的疏水吸附劑為固定相，蛋白質(zhì)等大分子與疏水吸附劑之間弱疏水作用的差異進(jìn)行物質(zhì)的分離。疏水吸附材料，含有苯基、辛基、丁基、醚基的吸附材料高鹽溶液中吸附能力強(qiáng)，降低鹽度將物質(zhì)洗脫分離。成本高，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模分離第21頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六（5）反向色譜：利用表面非極性的介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑的水溶液為流動相，或極性有機(jī)溶劑（甲醇、乙腈等），進(jìn)行物質(zhì)分離的方法。特點(diǎn)是固定相表面完全被非極性基團(tuán)覆蓋，具有強(qiáng)的疏水性。介質(zhì)：以硅膠為載體，經(jīng)硅烷化連接C4、C8、C18烷基或苯基，常用C18硅烷化類別：制備型色譜和分析型色譜，應(yīng)用：物質(zhì)的分離和檢測（定性和定量分析）第22頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六反向C18層析柱液相色譜儀層析示意圖樣品：沼澤紅假單胞菌第23頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六（6）親和層析固定相：特異性吸附材料，如酶抑制劑、抗原—抗體、A蛋白、配體—配基、過渡金屬離子（Cu、Ni、Zn、Co等離子）與O、S、N等供電子基團(tuán)形成配位鍵。與蛋白質(zhì)表面組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基、色氨酸的吲哚基發(fā)生親和作用。如Ni柱分離帶有組氨酸標(biāo)簽的工程蛋白。程序：選擇凝膠、專一性合成、分析鑒定、裝柱上樣、吸附、清洗、解析，柱再生解析劑：低pH、高鹽、競爭性洗脫劑、鹽酸胍

尿素等變性劑，再生：高濃度鹽應(yīng)用：物質(zhì)分離、測定活性第24頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六四、分離純度的鑒定方法電泳、色譜（薄層色譜、凝膠色譜）、質(zhì)譜、結(jié)晶、N-分析、熔點(diǎn)等第25頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六五、分離過程的控制及檢測1、純化方案的設(shè)計(jì)（1）目的：從原材料中提取純化目的成分（分離對象），設(shè)計(jì)方案，指導(dǎo)分離過程。（2）依據(jù)：分離對象的性質(zhì)和特點(diǎn)（溶解度、電荷、分子大小、與配體親和力等），結(jié)合分離純化方法的特點(diǎn)，對分離方法進(jìn)行比較分析，選擇出一種或幾種方法的組合。（3）原則：各種分離方法各有特色，操作程序簡繁不一；考慮分離對象的特性和結(jié)構(gòu)以及取材的特點(diǎn)，深入了解各種分離方法的原理和用途，合理、巧妙地設(shè)計(jì)純化方案，純化方案中，忌諱一種分離方法重復(fù)使用，純化效率不高，反而降低回收率。分離方案不是僵化的，在實(shí)驗(yàn)中，對方案及所選方法進(jìn)行不斷修正、調(diào)節(jié)、完善。（4）分離方法的測試——分離過程檢測 定向分離、靶向分離——都離不開分離對象的檢測與分析第26頁，共30頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)44分，星期六2、純化方法的評價(jià)理論分析的局限性：只有通過實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)；獲得提取工藝評價(jià)方法：對分離過程的每一步收集留份（洗脫留份）進(jìn)行分析檢測；測定指標(biāo)：測定2個(gè)：測定含量和活性。計(jì)算3個(gè)：比活力，純化倍數(shù)（比活性/粗提液比活性）， 收率（總活性/粗提液總活性）；如：酶（酶活/酶量），胰島素（效價(jià)/蛋白量）評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：

比活、純化倍數(shù)、收率，依據(jù)樣品來源的難易程度綜合評價(jià)3、樣品的分離純化過程及檢測分離