骨髓細胞形態(tài)學檢查操作流程

骨髓細胞形態(tài)學檢查操作流程骨髓細胞形態(tài)學檢查操作流程骨髓細胞形態(tài)學檢查操作流程xxx公司骨髓細胞形態(tài)學檢查操作流程文件編號：文件日期：修訂次數：第1.0次更改批準審核制定方案設計，管理制度骨髓細胞檢驗一、骨髓的取材骨髓取材方式主要有兩種，即骨髓穿刺術及環(huán)鉆術，后者又稱骨髓活檢。特別適合用于“干抽”情況下且可看到造血組織的天然結構，能判斷造血組織與脂肪組織的比例，有助于對再生障礙時病情嚴重程度的估計，也有助于骨髓纖維化、骨髓轉移癌及MDS的診斷。骨髓穿刺部位胸骨穿刺在第二與第三肋骨之間的胸骨正中線上穿刺，穿刺針長度固定在1cm以下。脊突穿刺第三、四腰椎脊突為穿刺點，在此處進行穿刺。髂前上棘穿刺髂骨前上棘后約3cm處。髂后上棘穿刺此處骨質較薄，容易穿刺，骨髓液較豐富，若作骨髓培養(yǎng)，須取5ml~10ml骨髓液。骨髓穿刺時應注意的問題骨髓穿刺一般由臨床醫(yī)生自行操作，檢驗人員也應了解以下有關問題：穿刺前必須向患者作耐心的解釋，以盡量減少患者的恐懼心理。穿刺術必須嚴格無菌操作，盛骨髓的玻片不能接觸穿刺針頭。骨髓抽取量不宜過多，一般以少于為最好。抽量過多可導致外周血液稀釋，失去診斷意義。穿刺困難時，只要針芯有一小滴骨髓即可涂片，若需要作細菌培養(yǎng)或其他檢查，也應先抽少量涂片，然后再抽所需量。干抽的意義干抽是指多部位多次穿刺均抽不出骨髓。可見于骨髓造血細胞異常增生，如白血病、真性紅細胞增多癥等，更易見骨髓纖維化癥。肯定干抽時可用環(huán)鉆術取活檢標本，同時將環(huán)鉆針內沾有的骨髓液涂片。骨髓液稀釋此情況由于吸取骨髓液用力過大或穿刺針頭刺入骨髓血竇所致，可見涂片上骨髓小粒及脂肪滴減少，各階段細胞比例失調，中性粒細胞分葉核﹥桿狀核，無巨核細胞、組織嗜堿細胞、網狀細胞等。穿刺部位的差異骨髓造血組織分布不均，且某些病變也可限于局部，因此穿刺部位的不同，其結果可有顯著差異。如再生障礙性貧血，特別是慢性再障，往往遠心部位的髂骨最易首先受損，棘突次之，而胸骨則可再生良好。即或是同一部位的髂骨也有灶性增生現(xiàn)象，可致兩次穿刺結果不相同。某些疾病診斷陽性率也因穿刺部位而異。多發(fā)性骨髓瘤、轉移癌時，均以病變部位穿刺陽性率最高。因此對一些疑難病例最好是多部位穿刺。死亡病例若需作骨髓穿刺明確診斷時，應在死亡后半小時內進行。骨髓穿刺成功的指標在抽搐骨髓的瞬間，病人有特殊的疼痛感。在黃白色的骨髓小粒，多集中于片尾部。鏡下有骨髓內特有的細胞，如巨核細胞、幼紅細胞、漿細胞及網狀細胞等。粒細胞的桿狀核與分葉核的比值大于外周血，網織紅細胞、有核細胞值均應高于外周血。二、骨髓涂片骨髓涂片的制備是一項重要的工作，絕對不可忽視。有時骨髓取材良好，但由于玻片的不清潔或推片技術不佳，而不能得到滿意的涂片。如涂片太厚細胞重疊則無法辨認細胞的結構；涂片太薄，細胞過于分散，則影響檢查速度和準確性，甚至漏診或誤診。因此必須制備薄厚適宜、分布均勻的涂片。涂片制備取髓液一滴置于載玻片的一端，以邊緣平齊的推片（最好比載片稍窄或磨去兩角）的一端放在骨髓液的前方，逐漸后移接觸骨髓液，使骨髓沿推片散開，將推片與載片保持約30°角，平穩(wěn)地向前推進至玻片的另一端，載片上便留下一薄層骨髓液膜。圖片制成后，在空氣中揮動，使其迅速干燥，以免細胞皺縮。涂片的要求及注意事項玻片要干凈，不能用手指觸摸玻片表面。一張良好的骨髓涂片，要求厚薄適宜，頭、體、尾明顯，細胞分布均勻。骨髓內纖維蛋白原含量高，易凝固，穿刺后應立即涂片。應選擇有骨髓粒部分涂片。圖片干燥后用鉛筆在髓膜頭部寫上姓名、編號、日期。骨髓液一般不用抗凝劑，必要時可用肝素抗凝，但用量不宜過多，否則影響細胞形態(tài)。三、骨髓涂片的染色骨髓中有核細胞量多，又有許多幼稚細胞，因此染色時應注意以下問題：涂片要新鮮，涂片后立即進行染色，如不能立即染色，應先固定后保存，但也不宜保存過久，否則血漿蛋白質分解，使染色背景變藍，效果不佳。固定時間比血片稍長或另用無染料的甲醇或乙醇固定5min~10min。染液的用量應多于染血片，但不宜過濃，染色時間要長些，使幼稚細胞受色均勻，結構清楚。最好用瑞特和吉氏混合染液染色。細胞染色時間長短除與氣溫有關外，也與細胞增生情況，各批染液的性能有關，故要將染色中的涂片，在顯微鏡下觀察，待顆粒清楚，胞核與胞質分明，著色滿意后再終止染色，然后再沖洗、待干、鏡檢。染色過深的涂片，可用瑞特染液滴加于涂片上馬上沖洗。過淺可復染，此時先加緩沖液后加染液，混合后復染到需要的深度為止。四、骨髓細胞分類和骨髓現(xiàn)象觀察（一）骨髓片的低倍鏡觀察1.觀察涂片情況了解骨髓涂片厚薄是否適度，有核細胞是否較豐富，細胞分布是否均勻，細胞受色是否滿意，若涂片情況較差，應另選良好涂片，并將情況填寫記錄。2.判斷骨髓增生程度除個別情況通過骨髓有核細胞直接計數判斷增生程度外，一般均借助骨髓涂片中有核細胞與成熟紅細胞的比例進行判斷，據此可將增生程度分為5級（見表20-6）。由于穿刺吸取骨髓時，只有西式的可能而無濃縮的機會，因此檢查結果介于兩級增生程度之間時，可將其增生程度上提一級。例如在增生活躍與增生明顯活躍之間，應判斷為增生明顯活躍。對增生減低的標本，應觀察全部送檢的骨髓片，以免遺漏有代表性標本，而誤將外周血稀釋的不分涂片認為增生減低。表20-6骨髓增生程度成熟紅細胞與有核細胞之比常見原因增生極度活躍1：1白血病、紅白血病等增生明顯活躍10：1白血病、增生性貧血增生活躍20：1正常骨髓或某些貧血增生減低50：1造血功能低下增生嚴重減低300：1典型的再生障礙性貧血3.骨髓巨核細胞計數取染色后的骨髓涂片，低倍鏡尋找巨核細胞，要注意邊緣與尾部，尋找以1.5cm×3cm為一單位面積，約等于450~500低倍視野，計數其巨核細胞，如未找到巨核細胞，應再觀察其他涂片，均未發(fā)現(xiàn)方可報告未找到巨核細胞。參考值7個~35個。必要時可用油鏡進行巨核細胞分類。4.觀察有無體積較大、異形或成堆的特殊細胞。如轉移癌細胞、高雪(Gaucher)氏細胞、尼曼－皮克（Niemann－Pick）氏細胞、巨網細胞、多核巨細胞以及紅細胞有無緡錢狀等。觀察時要注意邊緣及尾部。5.了解造血島的多少及其中的細胞組成及形態(tài)。（二）油鏡檢查低倍鏡觀察全片后，用油鏡觀察個細胞系形態(tài)，在熟悉涂片的基礎上作細胞分類，在分類過程中繼續(xù)觀察細胞形態(tài)有無變化，最后分析結果。有核細胞分類一般從骨髓涂片中段開始向尾部上下來回移動分類，依次計數200個或更多的有核細胞，按細胞的種類、發(fā)育階段分別記錄，并計算其比值。有核細胞過多而重疊時，應選擇涂片染色良好、細胞分布適當的部位計數。增生明顯活躍以上的骨髓，應分數400個~500個有核細胞，增生減低有核細胞很少時，可相應減少分類細胞數。觀察各系細胞形態(tài)變化仔細觀察各細胞系的數量、細胞發(fā)育成熟度和形態(tài)是否正常。如有無大小不均、形態(tài)異常、巨幼變或巨幼樣變、分葉過多、顆粒異常、毒性變、退行性變、有絲分裂細胞增多或異常等現(xiàn)象。粒細胞系：除觀察紅細胞系增生程度，各階段細胞百分率和形態(tài)變化外，應同時注意嗜酸、嗜堿粒細胞的百分率和有無形態(tài)變異。紅細胞系：除觀察紅細胞系增生程度，各階段細胞百分率外，還應注意中、晚幼紅細胞胞質變化，晚幼紅細胞脫核情況，有無巨幼紅細胞出現(xiàn)和其他異常現(xiàn)象。貧血患者可根據臨床需要，單獨作100個~200個有核紅細胞的6級分類。巨核細胞系：對出血性疾病的患者，應依次數完骨髓片的巨核細胞數，并作形態(tài)觀察和分類計數，注意有無脫血小板現(xiàn)象，估計血小板數量及其形態(tài)、聚集性、顆粒變化等，要特別注意侏儒性巨核細胞。單核細胞、淋巴細胞、漿細胞等有無數量改變和形態(tài)異常。3．觀察成熟紅細胞形態(tài)變化要注意觀察成熟紅細胞的大小、形態(tài)、染色及結構異常等，特別是貧血的病人，對診斷和鑒別診斷有一定的意義。成熟紅細胞異常應觀察外周血片變化。4．觀察非造血細胞及異常細胞如網狀細胞、內皮細胞、組織嗜堿細胞、吞噬細胞等，因數量太少，應結合高、低倍鏡在涂片的邊緣、尾部觀察，說明是多見或是偶見，有無形態(tài)異常。并要注意觀察有無異常細胞，如惡性組織細胞及轉移癌細胞等。5．觀察核分裂現(xiàn)象數500個~1000個有核細胞，記錄各類細胞有絲分裂相的細胞數，計算分裂相的總百分率和各細胞系的比值。貧血患者可專數200個有核紅細胞，報告紅細胞系分裂相的百分率，以示紅系造血活動情況。同時注意有無各種畸形分裂現(xiàn)象。6．注意觀察有無寄生蟲如瘧原蟲、黑熱病小體及弓形體等。（三）結果計算1．計算各系各階段細胞的百分率。2．計算粒紅比值(G/E)將各階段粒細胞（包括）(四)血涂片觀察送檢骨髓時必須同時送檢血片，以供對照觀察，協(xié)助診斷。低倍鏡觀察血涂片染色是否滿意，估計有核細胞數（一般為白細胞）。作200個白細胞分類計數，并應觀察各種細胞的形態(tài)及有無幼稚細胞的出現(xiàn)，若見幼紅細胞，應說明在分類計數200個白細胞的過程中見到幾個幼紅細胞，并注意其所屬階段。觀察成熟紅細胞有無形態(tài)異常。有無其他異常細胞和侏儒性巨核細胞出現(xiàn)。觀察血小板有無數量、形態(tài)、聚集性、顆粒等異常。觀察有無血液寄生蟲。對疑有血液寄生蟲的患者，應集中注意力，仔細尋找。(五)骨髓象分析與報告1．結合有核細胞增生情況和各細胞系總百分率，估量該細胞系增生程度。2．根據各細胞系內各階段細胞的百分率，分析該細胞系發(fā)育成熟度，是否有成熟障礙、成熟過度等現(xiàn)象。3．根據細胞形態(tài)變化，分析某細胞系是否有特異性的改變。4．將細胞分類結果填寫骨髓檢驗報告單，用簡練的語言，重點突出的將骨髓和血液細胞的觀察情況填寫報告記錄。（表略）5．綜合分析骨髓象、血象及臨床資料，客觀地向臨床提出細胞學檢查的初步印象或參考意見。一般骨髓檢查的參考意見主要有以下幾種：（1）肯定性診斷：某些具有特異性細胞學變化的疾病，其臨床表現(xiàn)與細胞學特征均典型時可作肯定性診斷。如白血病、惡性組織細胞性疾病、骨髓轉移癌（瘤）、巨幼細胞性貧血、血液寄生蟲病等。（2）符合性診斷：某些無特異性細胞學變化的疾病，其臨床與骨髓象皆符合或骨髓象僅有部分改變又可解釋其臨床現(xiàn)象時，即可提出支持性意見。如缺鐵性貧血、溶血性貧血、類白血病反應，粒細胞減少癥、血小板減少癥、傳染性單核細胞增多癥等。此時尚可提出進一步作某些輔助診斷性試驗的建議。（3）疑似性診斷：骨髓發(fā)現(xiàn)少量病理細胞，但臨床尚不典型，或骨髓象非常典型，但與臨床情況不符合時，應考慮是否為疾病早期，可作動態(tài)觀察，或提示作其他輔助性診斷的試驗。（4）排除某些診斷：見于臨床已初步診斷為某些血液病，但骨髓象大致正常時，可供臨床考慮是否排除此病，但也可能是骨髓尚未反映出來的疾病早期，特別是臨床癥狀典型者，應慎重對待，尚需要作多部位多次穿刺，經仔細檢查，甚至長期追蹤觀察后，才能否定。（5）若骨髓象有某些改變，但對臨床現(xiàn)象提不出具體支持或反對意見，可直接扼要簡述骨髓象特征，必要時追蹤觀察。（六）骨髓細胞分類和骨髓象檢驗中應注意的問題1．辨認細胞時不能單憑一兩個特點下結論，應仔細觀察，全面分析判斷。不同涂片、不同染色的情況下，細胞受色的深淺、染色質著色的程度等，均不盡相同，因此判定細胞時，應結合同一涂片中各種正常細胞染色的實際情況進行分析。2．各細胞系的原始細胞雖有特征，但極相似，甚難鑒別，除應作相應的化學染色協(xié)助區(qū)別外，也可根據出現(xiàn)的幼稚細胞或成熟細胞，推測原始細胞的所屬。3．由于細胞發(fā)育是一個連續(xù)的過程，具有兩個發(fā)育階段之間特征的細胞屬于正常的過渡形式，此時一般按成熟方向擬歸于下一階段來計數。病理情況下細胞發(fā)育紊亂，胞核與胞質發(fā)育失去平衡，對失衡較輕者也按上述情況處理。發(fā)育失調相差太遠，如形態(tài)基本是原始階段的細胞，但胞質中卻出現(xiàn)幾個特異性顆粒，此時一般以胞核形態(tài)和多數特征為劃分階段的依據，但在骨髓象描述中應加以說明。4．實屬難以確定的細胞，可列入分類不明細胞欄中，但不應過多，若有一定數量，則應通過細胞化學染色或請專家會診等方法弄清楚細胞類別。實在困難時應作形態(tài)學描述或加以照相記錄，或用有關針對細胞表面標志的單抗進行區(qū)別。5．急性白血病時對退化破碎的細胞，應單獨計數，了解其出現(xiàn)的百分率和形態(tài)，用以估計原始細胞的類型。如網狀細胞樣裸核多時，支持急性單核細胞性白血病時退化細胞的百分率較高，單核細胞白血病則較低。但上述情況并不是絕對的，只能供分析細胞類型時參考。6．作骨髓象檢查的同時，應作血象觀察，二者互為對照，有利于診斷和鑒別診斷，二者的關系有以下四種情況：（1）骨髓相似，血象顯著不同：如急性失血性貧、某些溶血性貧血、缺鐵性貧血的骨髓象均屬增生性貧血，有時不易區(qū)別，但于急性失血性貧血時其血象常見血小板、中性粒細胞增多，且可見核象左移；而缺鐵性貧血時白細胞、血小板多正常或減少，成熟紅細胞常有中心染色過淺現(xiàn)象；而溶血性貧血除網織紅細胞明顯增多外，75%患者外周血可見幼紅細胞。惡性腫瘤所致類白血病反應的骨髓象所見能區(qū)別開來，而慢性粒細胞白血病時血片與骨髓片區(qū)別不顯著。神經母細胞瘤骨髓內轉移時其彌散的腫瘤細胞與急性粒細胞性白血病的原粒細胞很難區(qū)別，但前者血片中成熟粒細胞增多，僅可出現(xiàn)少數不成熟粒細胞（晚幼及中幼粒細胞），而后者則出現(xiàn)大量原粒細胞及早幼粒細胞。（2）血象相似，骨髓象有顯著不同：如傳染性單核細胞增多癥和慢性淋巴細胞白血病的血片皆可顯示小淋巴細胞明顯增多，但前者的骨髓涂片中，淋巴細胞稍增多，而后者卻顯著增多，常達60%以上。又如某些非白血性急性白血病，再生障礙性貧血以及黑熱病的血涂片皆顯示全血細胞顯著減少，但這三種病的骨髓象卻有顯著區(qū)別：急性白血病時，原始及幼稚細胞顯著增多；再生障礙性貧血時則粒、紅系減少，淋巴細胞相對增多；黑熱