現(xiàn)代儀器分析論文高效液相色譜法應(yīng)用現(xiàn)狀與展望

高效液相色譜法應(yīng)用現(xiàn)狀與展望摘要本文概述了高效液相色譜(HPLC)的系統(tǒng)組成、分類、工作原理及特點(diǎn)，并展望了高效液相色譜法的應(yīng)用與發(fā)展前景。關(guān)鍵詞流動(dòng)相；液相色譜；色譜柱Applicationsandprospectsofhighperformanceliquidchromatography1WangJun(SchoolofChemstryandChemcialEngeering,GuizhouUniversity,Guiyang,550025)AbstractThisarticleprovidesanoverviewofthehighperformanceliquidchromatography(HPLC)system,classification,workingprinciplesandcharacteristics,andlooksforwardtotheprospectoftheapplicationanddevelopmentofhigh-performanceliquidchromatography.Keywordsmobilephase;liquidchromatography;column0.引言高效液相色譜分析(HPLC)是以高壓液體為流動(dòng)相的液相色譜分析法，是20世紀(jì)60年代末發(fā)展起來的一項(xiàng)新穎快速的分離分析色譜技術(shù)。它是在經(jīng)典的液體柱色譜法的基礎(chǔ)上，采用高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，引入氣相色譜理論后發(fā)展起來的。其基本方法是用高壓泵將具有一定極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑泵入裝有填充劑的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注入的樣品被流動(dòng)相帶入色譜柱內(nèi)進(jìn)行分離后依次進(jìn)入檢測(cè)器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)或進(jìn)行數(shù)據(jù)處理而得到分析結(jié)果。HPLC幾乎在所有學(xué)科領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用，可以用于絕大多數(shù)物質(zhì)成分的分離分析。1.高效液相色譜法概述1.1儀器結(jié)構(gòu)與原理[1]HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測(cè)器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、預(yù)柱或保護(hù)柱、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動(dòng)餾分收集裝置。其基本原理是用高壓泵將具有一定極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑泵入裝有填充劑的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注入的樣品被流動(dòng)相帶入色譜柱內(nèi)進(jìn)行分離后依次進(jìn)入檢測(cè)器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)或進(jìn)行數(shù)據(jù)處理而得到分析結(jié)果。其基本組成如下圖1高效液相色譜儀基本組成1.2高效液相色譜分析的分類[2]高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液-固吸附色譜法、液-液分配色譜法(正相與反相)離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法、體積排阻色譜法以及親和色譜法。液-固吸附色譜法：使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上的分離原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個(gè)吸附-解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度為5卩m?10pm。適用于分離分子量為200?1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。液-液分配色譜法：使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個(gè)分配平衡過程。離子交換色譜法：固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面末端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基(稱陽離子交換樹脂)或季氨基(陰離子交換樹脂)。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。離子對(duì)色譜法：又稱偶離子色譜法，是液-液色譜法的分支。它是根據(jù)被測(cè)組分離子與離子對(duì)試劑離子形成中性的離子對(duì)化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。體積排阻色譜法：固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。它利用分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。親和色譜法：將在不同基體上鍵合多種不同特性的配位體作為固定相，具有不同pH的緩沖溶液作流動(dòng)相，依據(jù)生物大分子(氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核堿、核苷、核苷酸、核酸、酶等)與基體上鍵聯(lián)的配位體之間存在的特異性親和作用能力的差別，而實(shí)現(xiàn)對(duì)具有生物活性的生物分子的分離。2．高效液相色譜法應(yīng)用現(xiàn)狀高效液相色譜分析(HPLC)幾乎在所有學(xué)科領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用，可以用于絕大多數(shù)物質(zhì)成分的分離分析。祁彥、占春瑞等［3］運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定了大豆中13種三嗪類除草劑多殘留量。建立了同時(shí)檢測(cè)大豆中13種三嗪類除草劑多殘留量的反相高效液相色譜(RP-HPLC)方法。樣品經(jīng)乙腈提取，凝膠滲透色譜和中性氧化鋁SPE柱凈化，然后采用RP-HPLC二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定，外標(biāo)法定量。方法簡(jiǎn)便、快速，凈化效果較好，可同時(shí)滿足進(jìn)、出口大豆中多種除草劑殘留量的檢驗(yàn)工作需要。董雪玲、劉大錳等［4］運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定大氣顆粒物中的雜環(huán)胺，建立了大氣顆粒物中雜環(huán)胺的高效液相色譜稔測(cè)方法。采用ODSC協(xié)色譜柱(250mmX4.6mm,5um)，乙腈?0.01mol/L三乙胺緩沖溶液液(pH4.0)為流動(dòng)相，實(shí)現(xiàn)了6種雜環(huán)胺的基線分離和4種雜環(huán)胺的高靈敏度熒光檢測(cè)。樊苑牧、俞雪鈞等［5］運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定含脂羊毛中滅蠅胺和環(huán)蟲腈。建立了高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定含脂羊毛中的滅蠅胺和環(huán)蟲腈的方法及HPLC-MS/MS確證方法。取得了良好的效果。吳燕華、劉文力等［6］運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定蘋果中的酚類物質(zhì)。利用高效液相色譜法分析了紅星、秦冠、小國光、黃元帥和富士5個(gè)蘋果品種果皮和果肉中小分子酚類物質(zhì)的分布情況。色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為甲醇和水，在此色譜條件下，各組分均得到良好分離。謝瑩、杭太俊等［7］運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定中藥中齊墩果酸和熊果酸含量。建立多種中藥中熊果酸與齊墩果酸含量測(cè)定方法，并確證兩種成分的存在形式，得出了可同時(shí)測(cè)定熊果酸與齊墩果酸含量，可用于藥材質(zhì)量控制的結(jié)論。鄭屹、陳賽慧等[8]運(yùn)用高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞能量代謝物質(zhì)。建立了高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定細(xì)胞中ATP、ADP和AMP含量的方法，以比較高糖培養(yǎng)的MRC-5細(xì)胞和D-半乳糖誘導(dǎo)的擬衰老MRC-5細(xì)胞能量代謝水平。結(jié)果表明高效液相色譜法可檢測(cè)出不同狀態(tài)細(xì)胞能量物質(zhì)的差異，其具有操作簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，可以作為線粒體能量代謝功能的評(píng)估方法之一。劉俊、吉曉佳等[9]運(yùn)用高效液相色譜法檢測(cè)植物組織中多胺含量。對(duì)反相高效液相色譜技術(shù)測(cè)定苯甲?；喟返姆椒ㄟM(jìn)行了探討，確定和研究了苯甲?；磻?yīng)的最佳溫度、時(shí)間和影響苯甲?；喟贩€(wěn)定性的因素，優(yōu)化了多胺的色譜分析條件。曹淑瑞、劉治勇等[10]運(yùn)用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了食品中6種對(duì)羥基苯甲酸酯。建立了同時(shí)檢測(cè)食品中6種對(duì)羥基苯甲酸酯的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（HPLC-DAD）定量分析方法。樣品用乙腈提取，經(jīng)LC-C18固相萃取柱凈化，采用AgilentC18色譜柱分離，甲醇／水溶液梯度洗脫，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。實(shí)驗(yàn)效果良好。3．高壓液相色譜的優(yōu)勢(shì)和不足液相色譜法最大的特點(diǎn)是可以分離不可揮發(fā)或受熱后不穩(wěn)定的有機(jī)物，而且比氣相色譜流動(dòng)相的選擇余地大。由于HPLC的具有色譜柱可以反復(fù)使用，流動(dòng)相可選擇范圍寬，流出組分容易收集，分離效率高，分析速度快，靈敏度高，操作自動(dòng)化，適用范圍廣（樣品不需氣化，只需制成溶液即可），定量分析方法的準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，在《中國藥典》中該法已成為中藥制劑含量測(cè)定最常用的分析方法。它與氣相色譜法配合使用，幾乎可以承擔(dān)絕大部分的有機(jī)物分離測(cè)試任務(wù)。高效液相色譜法總結(jié)起來有“四高一廣”的特點(diǎn)：（1） 高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對(duì)載液加高壓。（2） 高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在15?30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。（3） 高效：分離效能高。可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。（4） 高靈敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng,進(jìn)樣量在UL數(shù)量級(jí)。（5） 應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。高壓液相色譜不足之處是定性能力較差。4.應(yīng)用前景展望由于高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動(dòng)相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合，HPLC所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時(shí)測(cè)定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能，能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展，有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離。HPLC可以成為解決生化分析問題最有前途的方法。HPLC具有的高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用，流出組分易收集等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機(jī)分析等各種領(lǐng)域。高效液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個(gè)重要的發(fā)展方向。液相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等;液相色譜-紅外光譜連用也發(fā)展很快，如在環(huán)境污染分析測(cè)定水中的烴類、海水中的不揮發(fā)烴類，使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。參考文獻(xiàn)[1-2]馮玉紅?現(xiàn)代儀器分析實(shí)用教程[M].北京:北京大學(xué)出版社,2008.18-23.祁彥、占春瑞，等?高效液相色譜法測(cè)定了大豆中13種三嗪類除草劑多殘留量J].分析化學(xué)研究報(bào)告2006,34(6):787-790．董雪玲、劉大錳，等.高效液相色譜法測(cè)定大氣顆粒物中的雜環(huán)胺J].分析化學(xué)研究報(bào)告2009,37(10):1415-1420．樊苑牧、俞雪鈞，等?高效液相色譜法測(cè)定含脂羊毛中滅蠅胺和環(huán)蟲腈J].分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)2010,38(1):113-116．吳燕華、劉文力，等.高效液相色譜法測(cè)定蘋果中的酚類物質(zhì) [J].分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)2002，30(7):826-828．⑺謝瑩、杭太