生理指標(biāo)測(cè)定方法

1葉綠素含量測(cè)定取樣0.2g左右，剪碎，放入黑色膠卷盒中加20ml等量丙酮乙醇混合液（0號(hào)調(diào)零管：20ml等量丙酮乙醇混合液），48h以后，待材料變白，取上清夜于440、645、663nm處測(cè)其OD值。計(jì)算：葉綠素a含量=12.7d663-2.69d645葉綠素b含量=22.9d645-4.68d663葉綠素總含量=20.2d645+8.02d663類胡羅卜素含量=4.7d440-0.27（葉綠素a含量+葉綠素b含量）2脯氨酸含量的測(cè)定配藥：（1）3%磺基水楊酸溶液：6g——200ml（2）2.5%酸性茚三酮顯色液：冰乙酸和6mol/l磷酸經(jīng)3：2混合，作為溶劑進(jìn)行配制。冰乙酸90ml85%磷酸（15mol/l）24ml用去離子水定溶至60ml茚三酮3.75g測(cè)定：（1）脯氨酸提?。喝〔煌幚淼募羲槿~片0.5g，分別置于大試管中，加入5ml%磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提10min.（2）取出試管，待冷卻至室溫后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml顯色液（0號(hào)調(diào)零管：2ml冰乙酸+3ml顯色液+2ml去離子水），于沸水浴中加熱40min.（3）取出冷卻后向各試管加入5ml甲笨充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置，待分層后吸取甲笨層，以0號(hào)管為對(duì)照在波長520nm下比色。計(jì)算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出測(cè)定液中脯氨酸濃度，按下式計(jì)算樣品中脯氨酸含量。Y=（C*V）/（A*W）式中：C――提取液中脯氨酸含量（由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得），ug;提取液總體積，mlA――測(cè)定時(shí)所吸取的體積，ml;W樣品量，g；脯氨酸含量（干重或鮮重），ug/g.SOD,POD,MDA酶和可溶性蛋白質(zhì)的配藥：3個(gè)重復(fù)，1SOD1pH7.8磷酸緩沖液：（a）14.4gNa2HPO4-12H2O溶于400mL水中取366mL；（b）6.24gNaH2PO4-2H2O溶于400mL水中取34mL;兩液混成400mL，即為pH7.8磷酸緩沖液。

104mmol/L蛋氨酸（甲硫氨酸）：稱取0.39g蛋氨酸，用蒸餾水定容至25mL容量瓶中300umol/LNBT（氮蘭四唑）：稱取0.0125gNBT，用蒸餾水定容至50mL.0.8mmol/LEDTA：稱取0.012mgEDTA，用蒸餾水定容至50mL容量瓶中(a)(b)反應(yīng)液：配藥用量pH7.8磷酸緩沖液：2ml100ml104mmol/L蛋氨酸（甲硫氨酸）0.5ml25ml300(a)(b)反應(yīng)液：配藥用量pH7.8磷酸緩沖液：2ml100ml104mmol/L蛋氨酸（甲硫氨酸）0.5ml25ml300umol/LNBT(氮蘭四唑)1ml50ml0.8mol/LEDTA：0.5ml25ml2POD1pH7.0的10mmol/L磷酸緩沖液稱取1.56gNaH2PO4-2H2O,定容于1000ml容量瓶中，取390ml.320uM/L核黃素：稱取0.012g核黃素，用蒸餾水定容至100mL容量瓶中稱取3.5gNa2HPO4-12H2O定容于1000ml容量瓶中。取610ml.混合后即為1000mlpH7.0的磷酸緩沖液.240mmol/LHO220.3ml-----100ml用蒸餾水配制320mmol/L愈創(chuàng)木酚0.1ml--50ml用蒸餾水配制420%三氯乙酸10g--50ml用蒸餾水配制反應(yīng)液：配藥用量磷酸緩沖液(pH7)愈創(chuàng)木酚40mmol/LH2O22.91ml0.05ml0.02ml291ml5ml2ml(1)10%三氯乙酸(TCA)10g——100ml（2）0.6%硫代巴比妥酸（TBA）先加少量的氫氧化鈉（1mol/l）溶解，再用10%的三氯乙酸定溶。0.6g5ml95ml4可溶性蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)G-250：稱0.1g考馬斯亮藍(lán)G—250，溶于50ml90%乙醇中，加85%的磷酸中100ml，最后用蒸餾水定溶至1000ml，貯于棕色瓶中，此溶液常溫下可放置一個(gè)月。酶液制備：取洗凈的鮮材料0.5g置于冰浴的研缽中，先加2mLpH7.8的磷酸緩沖液，充分研磨至無粗纖維為止倒入離心管中，再用3mL（2+1）磷酸緩沖液洗凈研缽并入離心管，在10000轉(zhuǎn)離心20分鐘，上清液即為SOD、POD粗提液。1SOD測(cè)定取4mL反應(yīng)液，加入50uL的酶提取液再加50uL核黃素，另作6支不加酶液的處理（用緩沖液代替）作為最大光化還原管（0號(hào)調(diào)零管：pH7.8的磷酸緩沖液），立即置于4000LX的熒光燈（光照培養(yǎng)箱全光照：H1。溫度為室溫即可）下進(jìn)行光還原反應(yīng)，15分鐘后，用黑紙遮光，終止反應(yīng)。并用0號(hào)調(diào)零管調(diào)零點(diǎn)，在560nm波長下比色測(cè)定OD值。按下式計(jì)算SOD活性。(對(duì)照OD值一樣品OD值)*樣品體積SOD活性=對(duì)照OD值*樣品鮮重大測(cè)定時(shí)樣品用量POD測(cè)定取3mL反應(yīng)液，加入20uL的酶提取液于小管中，充分混合后，在34C恒溫水浴中反應(yīng)三分鐘。然后加20%三氯乙酸20uL，終止酶活性。以pH7.0的磷酸緩沖液調(diào)零點(diǎn)，在470nm波長下測(cè)其光密度。樣品ODPOD的OD值=*稀釋倍數(shù)MDA測(cè)定取酶液2ml加2ml0.6%的TBA于試管中(0號(hào)調(diào)零管：2ml+2mlTBA)，搖勻后沸水浴中加熱15min，冷卻后，4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10min.取上清液于532、600、450nm處測(cè)其OD值，以0號(hào)調(diào)零管調(diào)零。MDA濃度=6.45*(OD532-OD600)-0.56*OD450(pmol?LT)MDA含量=MDA濃度*提取液體積(5ml)/鮮重(0.5g)(pmol/gFW)可溶性蛋白質(zhì)測(cè)定取酶液1ml加5ml考馬斯亮藍(lán)G-250于試管中(0號(hào)調(diào)零管：5ml考馬斯亮藍(lán)G-250+1mlpH7.8的磷酸緩沖液)，充分混合，放置15min，.取上清液于于593nm處測(cè)其OD值，以5ml考馬斯