發(fā)酵工藝學課件

發(fā)酵工藝學

第一篇

發(fā)酵機制及發(fā)酵控制第一章緒論一、發(fā)酵工程發(fā)展史1、傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù):自然發(fā)酵

外國

●公元前4000~3000年，古埃及人釀造酒、醋

●公元前2000年，古希臘人和古羅馬人釀葡萄酒

●公元前三世紀，古巴比倫人用谷物釀啤酒中國

●距今4200~4000年前，龍山文化時期即有酒器出現(xiàn)

●公元前1000多年前有酒、醋等的甲骨文文字記載

傳統(tǒng)自然發(fā)酵的主要產(chǎn)品有：酒(白酒、黃酒、清酒、果酒、啤酒等)、醋、醬油、泡菜、奶酒、干酪、腐乳、納豆等2、純培養(yǎng)技術(shù)的建立---第一個轉(zhuǎn)折期奠基人：安東尼.列文虎克、巴斯德、柯赫等

本時期產(chǎn)品：酵母、酒精、丙酮、有機酸、酶制劑等，主要為厭氧發(fā)酵和表面固體發(fā)酵的初級代謝產(chǎn)物。3、深層培養(yǎng)技術(shù)的建立---第二個轉(zhuǎn)折期1928年英國細菌學家弗萊明發(fā)現(xiàn)點青霉可產(chǎn)抑制葡萄球菌的青霉素。1945年大規(guī)模生產(chǎn)，采用深層培養(yǎng)技術(shù)。鏈霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四環(huán)素等出現(xiàn)其他發(fā)酵產(chǎn)品也相繼出現(xiàn)本時期產(chǎn)品：抗生素類、氨基酸類、酶制劑類4、人工誘變育種、基因工程菌---第三個轉(zhuǎn)折期

●核苷酸、有機酸及部分抗生素用誘變育種的方法使產(chǎn)量大幅度提高。

●構(gòu)建的基因工程菌可產(chǎn)生菌體本身不能產(chǎn)生的產(chǎn)物(如胰島素、生長激素、細胞因子及多種單克隆抗體等)或使產(chǎn)量大幅度提高。5、發(fā)酵動力學、發(fā)酵的連續(xù)化自動化工程技術(shù)的建立

二、發(fā)酵工藝的應(yīng)用

1、在食品工業(yè)中的應(yīng)用

●食品加工：單細胞蛋白：假單胞菌、假絲酵母、曲霉、地霉、螺旋藻等

●含醇飲料：以糖類及淀粉類物質(zhì)為原料生產(chǎn)的各種酒類

●發(fā)酵乳制品：奶酒、乳酪、酸乳

●調(diào)味品和發(fā)酵食品：味精、肌苷酸、鳥苷酸、醬、醋、腐乳、飴糖、泡菜等

●甜味劑：葡萄糖、果葡糖漿、甘露糖醇等

●食品添加劑：酵母、賴氨酸、檸檬酸、色素、葡萄糖氧化酶、Vc、乳鏈菌肽(防腐劑)、匹馬霉素(食品保護劑)

2、在醫(yī)藥衛(wèi)生中的應(yīng)用

(1)、抗生素●抗細菌抗生素：頭孢菌素、氯霉素、紅霉素、螺旋霉素等●抗真菌抗生素：兩性霉素B、殺假絲菌素、制霉菌素等●抗原蟲抗生素：煙古霉素、古曲霉素●抗腫瘤抗生素：放線菌素、博來菌素、絲裂菌素、內(nèi)瘤菌素、光神霉素等●起免疫抑制作用的抗生素：環(huán)孢菌素A等

(2)、氨基酸(3)、維生素：VB2、VB12、VC、VA的前體(4)、甾體激素：可的松、潑尼松、膚輕松、確氨舒松等

(5)、生物制品：各種疫苗、類毒素等(6)、治療用酶：蛋白酶、核酸酶、尿激酶、SOD等(7)、酶抑制劑：(8)、其他：核酸類藥物如：肌苷、輔酶A、AMP、ATP、FAD3、在輕工業(yè)中的應(yīng)用

各種糖酶、蛋白酶、果膠酶、脂肪酶等4、在農(nóng)工業(yè)中的應(yīng)用微生物殺蟲劑：病毒殺蟲劑、細菌殺蟲劑、真菌殺蟲劑、動物殺蟲劑防治植物病害微生物：如細菌、放線菌、真菌及殺稻瘟菌春日霉素、慶豐霉素等第二章菌種篩選及選育第一節(jié)活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選篩選步驟：

樣品采集樣品預處理增殖培養(yǎng)菌種初篩菌種復篩性能鑒定傳代穩(wěn)定性實驗菌株終選一、樣品采集土壤：分布廣泛，特別是一些極端環(huán)境，另外，生物物質(zhì)的種類不同，地點應(yīng)不同水體中：江、河、湖、海其他：動物、植物等

三、菌種的分離(一)、選擇性壓力分離法

選擇性壓力分離法：利用不同微生物生長繁殖對環(huán)境及營養(yǎng)的要求不同，如：溫度、pH、滲透壓、氧氣、碳源、氮源及其他特殊條件，使其利于某類或某種微生物的生長而不利于其他種類微生物的生存，以使目的菌占優(yōu)勢而得以分離出來的方法。1、分離不同微生物采用不同的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件

用于選擇性分離放線菌的幾種培養(yǎng)基

培養(yǎng)基占優(yōu)勢的菌株含膠態(tài)幾丁質(zhì)、礦物鹽鏈霉菌屬、微單孢菌屬基質(zhì)減半的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基嗜熱放線菌葡萄糖、天冬酰胺、馬杜拉放線菌、小雙孢菌含2、分離不同產(chǎn)物的微生物采用不同的培養(yǎng)基分離各種酶類、分離固氮菌3、恒化式富集培養(yǎng)技術(shù)基質(zhì)濃度對A、B兩種不同菌生長速率的影響(二)、隨機分離法

隨機分離法：某些微生物的產(chǎn)物對產(chǎn)生菌的篩選沒有任何選擇性好處，常隨機地分離所需菌種。選擇準則：

1)制備系列培養(yǎng)基，其中有各類型的養(yǎng)分成為生長限制因素2)避免使用易同化的C(葡萄糖)或N（NH4+），它們易引起分解代謝物阻遏3)確定含有所需的輔因子(一些金屬離子)4)加入緩沖液減少pH的變化

1、抗生素產(chǎn)生菌的分離方法有：抑菌圈法、稀釋法、擴散法、生物自顯影法等2、抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離

1)利用微生物篩選作用于DNA的抗腫瘤藥物生化誘導分析法2)利用DNA修復能力突變株進行抗腫瘤藥物篩選3、酶抑制劑產(chǎn)生菌的分離

篩選原理：如果某種化合物能在體外抑制某種關(guān)鍵的人體酶，它就可能在體內(nèi)產(chǎn)生藥理作用。一般選擇與生理和病理關(guān)系明確的酶為靶酶進行篩選。4、抗病毒藥物產(chǎn)生菌的分離

利用作用于核酸法：如用雞胚線維芽細胞的噬菌斑形成法.用小平板測定由病毒引起的細胞變性效果

檢測病毒復制中特有的DNA復制酶和核酸合成酶的酶抑制劑5、生長因子產(chǎn)生菌的分離

如氨基酸和核酸產(chǎn)生菌6、多糖產(chǎn)生菌的分離1、步驟

出發(fā)菌株菌種純化制備斜面孢子或菌懸液

活菌計數(shù)活菌計數(shù)性能初測

誘變處理平板涂布

初篩

復篩傳代穩(wěn)定性實驗放大試驗菌種保藏并用于生產(chǎn)2、誘變育種要點(1)、出發(fā)菌株選擇依據(jù)：

1）選用來自于生產(chǎn)的自發(fā)突變菌株；2）選有利于進一步研究的菌株；3）選用幾次誘變處理均能提高產(chǎn)量的菌株；4）選用形態(tài)發(fā)生變異以后的菌株等致死率確定性能精測(2)、誘變方法的選擇●可采用單一的物理、化學誘變因素處理、兩種或兩種以上的誘變劑先后處理，或者同時使用，或者一種誘變劑重復使用。

●誘變過程（以紫外線誘變?yōu)槔?/p>

開燈預熱20min（使光波穩(wěn)定）加5mL菌懸液于φ6cm培養(yǎng)皿距燈30cm處照射無光下置幾代時間涂布培養(yǎng)注意問題：a波長：257.3nm，紫外線燈的功率固定為15W，燈與處理物之間的距離也固定在30cm。b處理后的菌懸液增殖培養(yǎng)期間，可用黑紙包住盛有處理菌液的玻璃器皿?！駝┝康倪x擇從過去的99%--99.9%降至70%--80%，甚至更低。

在攪拌下無可見光有紅光bN-甲基Nˊ硝基-N-亞硝基胍(NTG)通常在濃度為300μg／mL、溫度為28℃、時間為60min的條件下進行處理，容易得到高產(chǎn)菌株。c航天育種所謂航天育種即利用空間環(huán)境高真空、微重力和強輻射的特點，在宇宙封線輻射的作用下，使生物的遺傳性狀發(fā)生變異，從而選育出優(yōu)良菌種。利用返地衛(wèi)星或高主氣球搭載植物種子進行航天育種，

四、雜交育種(一)、細菌的雜交育種

1、雜交方式：細菌接合、F因子轉(zhuǎn)導、R因子轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)導等。2、選擇標記：營養(yǎng)缺陷、抗生素抗性、溫度敏感、發(fā)酵性能3、方法：將帶兩個以上不同選擇性遺傳標記的兩個菌株雜交，如：A+B-和A-B+，雜交中會出現(xiàn)A+B-、A-B+、A+B+和A-B-四種重組類型，采用排斥親本及A-B-，只允許A+B+生長的培養(yǎng)條件。(二)、放線菌的雜交育種1、雜交原理

●異核現(xiàn)象●接合現(xiàn)象

●

異核系的形成

aba一個親本有完整的染色體組，另一個不完整b兩個親本都有不完整的染色體組，但在不同區(qū)域出現(xiàn)缺失●

重組體的形成

2、雜交方法

(1)混合培養(yǎng)法

親本Ⅰ親本Ⅱ混合菌絲異核體親本分離子部分合子異核系重組體a．選擇性平板法：所使用的兩親株必須是互補的營養(yǎng)缺陷型。將用來進行重組的兩親株混合，接種到豐富的完全培養(yǎng)基斜面上(若其中一株產(chǎn)生孢子慢時，可多接一些)，孢子形成后制成單孢子懸浮液，然后在選擇性培養(yǎng)基平板上進行分離，長出的菌落即為各種類型的重組體。b．異核系分析法：將混合培養(yǎng)后所制得的單孢子懸浮液，分離在基本培養(yǎng)基平板上，其中長成的小而豐富的菌落即為異核系。將異核系在分離在完全培養(yǎng)基上，長出的菌落即為分離子。(2)平板雜交法

●方法：將菌落培養(yǎng)在非選擇培養(yǎng)基上，當菌落形成孢子以后，用影印培養(yǎng)法將菌落印至已鋪有試驗菌孢子(107～109孢子/mL)的完全培養(yǎng)基平板上，再培養(yǎng)至孢子形成。然后把這上面的孢子影印到一系列選擇性培養(yǎng)基上，便于各種重組體子代的生長。

●特點：優(yōu)點是能迅速地進行大量雜交，尤其是確定大量菌落與一個共同試驗菌配對時的致育力更為方便。平板雜交法適用于迅速研究大量表型相似菌株的遺傳，一般一個培養(yǎng)皿可以排列20個菌株與一株配對菌株雜交。(三)、霉菌的雜交育種１、準性生殖過程(見微生物)２、霉菌的雜交技術(shù)

(1)、選擇直接親本●原始親本：用來進行雜交的兩個野生型菌株叫原始親本●直接親本：原始親本經(jīng)誘變得到各種突變型菌株。假設(shè)這種菌株是用來作為形成異核體的親本，就叫直接親本?！襁z傳標記：營養(yǎng)突變型，抗藥性突變型，形態(tài)突變型

(2)、異核體的形成形成方法有：①完全培養(yǎng)基液體混合培養(yǎng)法；②完全培養(yǎng)基斜面混合培養(yǎng)法；③液體有限培養(yǎng)基混合培養(yǎng)法；④有限培養(yǎng)基平板異核叢形成法；⑤基本培養(yǎng)基斜面銜接接種法；⑥基本培養(yǎng)基平板穿刺法等。

(3)、雙倍體的檢出

檢出方法：①用擴大鏡觀察異核體菌落的表面，若有野生型顏色的斑點和扇面，可用接種針將其孢子挑出，進行分離純化，即得雜合雙倍體。②將異核體菌絲打碎，在基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基平板上進行分離，經(jīng)培養(yǎng)長出異核菌落。在個別異核菌落上長出野生型原養(yǎng)性的斑點和扇面，將其挑出進行分離純化即可。③將大量異核體孢子分離于基本培養(yǎng)基平板上(1X10６～2X10６孢子／皿)從中長出野生型原養(yǎng)性菌落，將其挑出分離純化，即得雜合雙倍體。

(4)、分離子的檢出

①將雜合雙倍體單孢子分離于完全培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)至菌落成熟，檢查大量雙倍體菌落，在一些菌落上有突變顏色(隱性標記)的斑點或扇面出現(xiàn)。每個菌落接一個斑點或扇面的孢子于完全培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)后經(jīng)過純化和鑒別得分離子。②用選擇性培養(yǎng)基篩選分離子。(四)、酵母的雜交育種

1、獲得單倍體細胞：單倍體和二倍體可從形態(tài)上識別(思考？)2、雜交育種交配方式：

●孢子與孢子交配

●單倍體細胞與孢子交配

●細胞間交配對于不同的出發(fā)菌株，應(yīng)采用不同的交配方式。最好是采用具有不同遺傳標記的細胞進行交配。

3、雜交育種實例

●卡爾酵母可用糖類產(chǎn)生酒精和二氧化碳，但只能發(fā)酵約80％的糖。糖化酵母能發(fā)酵糊精，雜交得發(fā)酵糊精產(chǎn)酒精的雜種。此雜種生產(chǎn)的啤酒口味欠佳，再與卡爾酵母回交，得到糖轉(zhuǎn)化率90％的雜種再與能利用異麥芽糖的野生酵母雜交，產(chǎn)生糖轉(zhuǎn)化率100％的新雜種。如此多次進行互交和選擇，得到將糖充分轉(zhuǎn)化生產(chǎn)“淡”啤酒的雜交酵母

●日本研究者將能產(chǎn)生殺傷因子的殺傷酵母與清酒釀造酵母雜交，得到抗野生殺傷菌株侵襲的菌種。并反復回交，培育出一株嗜冷的對殺傷因子免疫的葡萄酒酵母。五、原生質(zhì)體融合技術(shù)1、原生質(zhì)體融合技術(shù)優(yōu)點●去除了細胞壁的障礙，親株基因組直接融合、交換實現(xiàn)重組，不需要有已知的遺傳系統(tǒng)。即使是相同接合型的真菌細胞也能發(fā)生原生質(zhì)體相互融合，并可對原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染。●原生質(zhì)體融合后兩親株的基因組之間有機會發(fā)生多次交換，產(chǎn)生各種基因組合而得到多種類型的重組子。參與融合的親株數(shù)可多至三個、四個，般常規(guī)雜交無法達到。●重組頻率特別高。如放線菌10-2~10-1絲狀真菌10-3~10-2●可以和其他育種方法相結(jié)合，把由其他方法得到的優(yōu)良性狀通過原生質(zhì)體融合再組合到一個單株中。●可以用溫度、藥物、紫外線等處理、鈍化親株的一方或雙方，然后使之融合，再在再生菌落中篩選重組子。這樣往往可以提高篩選效率。2、原生質(zhì)體融合的一般步驟鈍化的親株Ⅰ鈍化的親株Ⅱ具遺傳標記的親株Ⅰ具遺傳標記的親株Ⅱ菌絲培養(yǎng)菌絲培養(yǎng)酶解細胞壁酶解細胞壁原生質(zhì)體Ⅰ原生質(zhì)體Ⅱ再生再生再生菌落性狀測定再生頻率測定再生頻率測定再生菌落性狀測定誘變?nèi)诤螾EG處理直接選擇法間接選擇法融合子多次接種均在基本培養(yǎng)基或選擇培養(yǎng)基生長菌落接種完全培養(yǎng)基生長但基本培養(yǎng)基或選擇培養(yǎng)基不生長的菌落雜種性狀測定操作要點1）原生質(zhì)體制備●革蘭氏陽性細菌：枯草桿菌和巨大芽孢桿菌的細胞壁用溶菌酶進行消化，乳鏈球菌細胞壁需要用溶菌酶和細菌溶菌酶共同消化，黃色短桿菌的原生質(zhì)體制備是先加青霉素培養(yǎng)1.5h后，再用酶消化?！穸锾m氏陰性細菌：EDTA加溶菌酶，或甘氨酸—溶菌酶—EDTA，或在含青霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)等條件下制備原生質(zhì)體?！矜溍咕涸诤拾彼岬呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)后，用溶菌酶消化?！窠湍妇航臃N在巰基乙醇和EDTA的溶液中培養(yǎng)，再用細胞壁溶解酶消化獲得?；蛘哂梦伵Ｃ富蚶w維素酶消化時，添加巰基乙醇來提高原生質(zhì)體形成率?！衩咕簬锥≠|(zhì)酶、蝸牛酶、纖維素酶、硫酸脂酶、瑪瑙螺酶。2）原生質(zhì)體融合和再生●融合：化學因子：一般用聚乙二醇(polyethyle