導學案2：凝膠色譜法分離血紅蛋白

凝膠色譜法分離血紅蛋白導學案課題凝膠色譜法分離血紅蛋白課型新授教學目標1.嘗試對血液中血紅蛋白的提取和分離2.提取生物大分子的基本過程和方法教學重難點重點：凝膠色譜法的原理和方法。難點：樣品的預處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填【導學誘思】思考1：分離生物大分子的基本思路是什么？思考2：蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？思考3：高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)的何種作用，作用結果是什么被破壞？思考4：人們用雞的紅細胞提取DNA，用人的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？一、基礎知識：㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：1．概念：根據(jù)被分離蛋白質(zhì)的，利用具有網(wǎng)狀結構的凝膠的分子篩作用，來分離蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠顆粒相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)（1）（2）（3）（4）（5）B凝膠顆粒相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)（1）（2）（3）（4）（5）BA多孔板3．具體過程：A.的蛋白質(zhì)由于作用進入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留；的蛋白質(zhì)被排阻在凝膠顆粒外面，在了里之間迅速通過。B.（1）混合物上柱；（2）洗脫開始，的蛋白質(zhì)擴散進入凝膠顆粒內(nèi)；的蛋白質(zhì)被排阻于凝膠顆粒之外；（3）的蛋白質(zhì)被滯留；的蛋白質(zhì)被向下移動。（4）不同的蛋白質(zhì)分子完全分開；（5）的蛋白質(zhì)行程較短，已從中洗脫出來，的蛋白質(zhì)還在行進中。㈡緩沖溶液：1．概念：在一定的范圍內(nèi)，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。2．作用：能夠抵制的對溶液的的影響，維持pH基本不變。3．緩沖溶液的配制通常由種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的就可以制得使用的緩沖液。思考：說出人體血液中緩沖對？思考：在血紅蛋白整個實驗室中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結構和功能，便于觀察（紅色）和材料的科學研究（活性）㈢電泳：1．概念：指發(fā)生遷移的過程。2．原理：許多重要的生物大分子，如等都具有在下，這些基團會帶上。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子以及分子本身、的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。陰極陽極加入待分離的樣品帶電性質(zhì)、分子大小和形狀的不同，使分子遷移速度不同陰極陽極加入待分離的樣品帶電性質(zhì)、分子大小和形狀的不同，使分子遷移速度不同分子向陽極移動緩沖液瓊脂膠溶液槽凝膠電泳原理示意圖①電泳②電泳。測定（）通常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙稀酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中加入。SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于。二實驗操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理——粗分離——純化——純度鑒定1.樣品處理（1）紅細胞的洗滌①目的：去除②方法：離心（速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果），然后用膠頭吸管吸出上層透明的，將下層的紅細胞液體倒入再加入用的質(zhì)量分數(shù)為％的氯化鈉溶液洗滌⑤低速離心（低速短時間）⑥重復4、5步驟次，直至上清液中已沒有，表明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數(shù)過少。（2）血紅蛋白的釋放加到體積，再加40％體積的溶解細胞膜），置于上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白.（3）分離血紅蛋白溶液：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min，試管中的溶液分為4層:第1層（最上層）：甲苯層第2層（中上層）：的沉淀層，色薄層固體第3層（中下層）：的水溶液層，的液體第4層（最下層）：其它雜質(zhì)的沉淀層（4）透析2.凝膠色譜制作1）凝膠色譜柱的制作①取長40厘米，內(nèi)徑厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。a.選擇合適的的橡皮塞，中間打孔；b.在橡皮塞頂部切出鍋底狀的，在的頭部切下長的一段，插入橡皮塞孔內(nèi)，上部不得超過橡皮塞的凹穴底面。c.剪尼龍網(wǎng)小圓片覆蓋在上，用的尼龍紗將橡皮塞包好，插到玻璃管一端。d.色譜柱下端用移液頭部做，連接一細的，并用螺旋夾控制尼龍管的，另一端放入收集的收集器內(nèi)③頂塞的制作：插入安裝了玻璃管的橡皮塞④組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結構。2）凝膠色譜柱填料的處理（1）凝膠的選擇：。（2）方法：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于中充分溶脹后，配成。（3）凝膠色譜柱的裝填方法①固定：將色譜柱處置固定在支架上②裝填：將一次性的緩慢倒入內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。③洗滌平衡裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為）充分12小時。3）樣品加入與洗脫（1）加樣前：打開下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩慢下降到與平齊，關閉出口（2）加透析樣品①調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：用將1ml的樣品加到色譜柱的③樣品滲入凝膠床：④洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫⑤收集：待接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每收集一試管連續(xù)收集思考：與其它真核細胞相比，紅細胞有什么特點？這一特點對你進行蛋白質(zhì)的分離有什么意義？血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。思考：你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即（）；然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的（）；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行（）。－聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷的蛋白質(zhì)是否達到要求，需要進行蛋白質(zhì)純度的鑒定。SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度電泳方法步驟1）根據(jù)廠家說明書安裝電泳用的玻璃板2）SDS—聚丙烯酰胺凝膠制備3）樣品處理：4）把凝膠固定于電泳裝置上5）加樣：按順序加樣，加樣量通常為10—25μL。樣品可以多加幾個，例如，血漿樣品紅細胞破碎后（即進行凝膠色譜分離之前）的樣品和凝膠色譜分離之后的樣品6）電泳7）剝膠8）染色9）脫色10）觀察結果SDS電泳的成功關鍵之一是電泳過程中，待別是樣品制備過程中蛋白質(zhì)與SDS的結合程度。三實驗結果分析與評價觀察血液樣品離心后是否分層，如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。討論：如何測定蛋白質(zhì)的分子量？使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時，可選用一組已知分子量的標準蛋白同時進行電泳，根據(jù)已知分子量的標準蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對數(shù)作標準曲線，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。課堂練習1.用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時，分子量大的蛋白質(zhì)（）A．路程較長，移動速度較慢B．路程較長，移動速度較快C．路程較短，移動速度較慢D．路程較短，移動速度較快2.蛋白質(zhì)提取和分離分為哪幾步（）A．樣品處理、凝膠色譜操作、SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳B．樣品處理、凝膠色譜操作、純化C．樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定D．樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定3.在血紅蛋白的整個提取過程中，不斷用磷酸緩沖液處理的目的是（）A．磷酸緩沖液會加速血紅蛋白的提取過程B．血紅蛋白是一種兩性物質(zhì)，需要酸中和C．防止血紅蛋白被O2氧化D．讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持其結構和功能4．在盛有紅褐色的Fe(OH)3，膠體的U形管的兩個管口，各插一個電極，通直流電后，發(fā)現(xiàn)陰極附近