抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件

抗體酶（abzyme

）（catalyticantibody

）抗體酶（abzyme）1

知識要點1、什么是抗體酶？2、抗體和酶的特點比較3、抗體酶的作用特點4、抗體酶的制備5、抗體酶的應(yīng)用前景知識要點1、什么是抗體酶？2什么是抗體酶？●在免疫球蛋白的易變區(qū)賦予酶的屬性，成為具有催化活性的抗體●生物學(xué)與化學(xué)的研究成果在分子水平上交叉的產(chǎn)物●抗體的多樣性+酶分子的高效催化=新酶設(shè)計●酶反應(yīng)過渡態(tài)類似物作為半抗原免疫動物產(chǎn)生有催化活性的抗體，采用單克隆抗體技術(shù)獲得這種具有酶特性的抗體。什么是抗體酶？●在免疫球蛋白的易變區(qū)賦予酶的屬性，成為具有催3基本概念①

免疫？②抗體？③抗原？④半抗原？⑤多克隆抗體？⑥

單克隆抗體？基本概念①免疫？4免疫系統(tǒng)和免疫球蛋白功能

免疫是人類和脊椎動物最重要的防御機(jī)制，免疫系統(tǒng)能在分子水平上識別“自我”和“非我”，然后破壞那些被鑒定為非我的成分。在生理水平上免疫系統(tǒng)對入侵的反應(yīng)或應(yīng)答是多種類型的蛋白質(zhì)、分子和細(xì)胞之間的一套復(fù)雜而協(xié)同的相互作用，如果從個別蛋白質(zhì)水平來看，免疫反應(yīng)可以看作是一種配體與蛋白質(zhì)可逆結(jié)合的生化系統(tǒng)。1．抗原、抗體和免疫球蛋白的概念2．免疫球蛋白的類別3．免疫球蛋白結(jié)構(gòu)和免疫系統(tǒng)4．多克隆抗體和單克隆抗體免疫系統(tǒng)和免疫球蛋白功能免疫是人類和脊椎動物最5什么是“免疫球蛋白”？(immunoglobulin)具有抗體活性的動物蛋白,是一種糖蛋白。主要存在于血漿中，也見于其他體液、組織和一些分泌液中。人血漿內(nèi)的免疫球蛋白大多數(shù)存在于丙種球蛋白（γ-球蛋白）中。可分為五類，即免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）。其中IgG是最主要的免疫球蛋白，約占人血漿丙種球蛋白的70%，分子量約15萬，含糖2～3%。IgG分子由4條肽鏈組成。其中分子量為2.5萬的肽鏈，稱輕鏈，分子量為5萬的肽鏈，稱重鏈。輕鏈與重鏈之間通過二硫鍵（—S—S—）相連接。免疫球蛋白是機(jī)體受抗原（如病原體）刺激后產(chǎn)生的，其主要作用是與抗原起免疫反應(yīng)，生成抗原-抗體復(fù)合物，從而阻斷病原體對機(jī)體的危害，使病原體失去致病作用。另一方面，免疫球蛋白有時也有致病作用。臨床上的過敏癥狀如花粉引起的支氣管痙攣，青霉素導(dǎo)致全身過敏反應(yīng)，皮膚蕁麻疹（俗稱風(fēng)疹塊）等都是由免疫球蛋白制劑能增強(qiáng)人體抗病毒的能力，可作藥用。如注射人血清或人胎盤中提取的丙種球蛋白制劑可防治麻疹、傳染性肝炎等傳染病。

什么是“免疫球蛋白”？6人免疫球蛋白的分類

IgGIgAIgMIgDIgE重鏈類別輕鏈類別或或或或或鏈的組成

人免疫球蛋白的分類7抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件8免疫球蛋白IgG的一級結(jié)構(gòu)

免疫球蛋白IgG的一級結(jié)構(gòu)

9IgG結(jié)構(gòu)IgG結(jié)構(gòu)10

IgM的一級結(jié)構(gòu)IgM的一級結(jié)構(gòu)11IgG的空間結(jié)構(gòu)

IgG的空間結(jié)構(gòu)

12IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格

IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格

13多克隆抗體和單克隆抗體

如果給動物注射抗原,雖然抗原與各種抗體產(chǎn)生細(xì)胞的親和性有所不同,但是還是有大量抗體產(chǎn)生細(xì)胞將與之結(jié)合,結(jié)果血液中出現(xiàn)的抗體源于數(shù)種不同的細(xì)胞克隆，這些抗體就是多克隆抗體（polyclonalantibodies）。如果可以分離到抗體產(chǎn)生細(xì)胞的單克隆，然后使所有的抗體均來自同樣的克隆，這樣制備的抗體稱為單克隆抗體（monoclonalantibodies）。由于單抗細(xì)胞的壽命有限，嚴(yán)重限制了單抗的常規(guī)制備。1975年，Milsetein和Kohler創(chuàng)建了不受限制地大量制備針對特異抗原的單抗技術(shù)，將可產(chǎn)生專一性抗體的B淋巴細(xì)胞與具有無限繁殖能力的惡性淋巴瘤細(xì)胞（骨髓瘤細(xì)胞）融合，融合體稱為雜交瘤細(xì)胞，它既可以永久地培養(yǎng)，又可分泌大量的均一的抗體。由于用這個技術(shù)產(chǎn)生的抗體具有很高的專一性，現(xiàn)已成為研究的常用工具。多克隆抗體和單克隆抗體如果給動物注射抗原,雖然14抗體和酶的特點比較

酶

抗體底物結(jié)合專一性比較高非常高底物結(jié)合形變?nèi)菀鬃冃尾灰鬃冃畏N類比較多非常多物質(zhì)轉(zhuǎn)變活性高無

如何將抗體轉(zhuǎn)變成酶？抗體和酶的特點比較15

抗體酶研究背景●1948年LinusPauling提出了酶的過渡態(tài)催化理論,認(rèn)為酶和底物結(jié)合不是在基態(tài)上，因為酶與基態(tài)底物的結(jié)合十分困難，需要克服很大的能障。過渡態(tài)結(jié)構(gòu)十分容易與酶結(jié)合，因為酶結(jié)構(gòu)經(jīng)過底物誘導(dǎo)等，親和力最強(qiáng)。十分容易越過能障，加速催化速度。所以酶具有催化速度快和高選擇性（專一性）抗體酶研究背景16①

在沒有催化劑存在的情況下，能障（即活化能）是S和S?之間的能量差。在有酶催化時，能障是ES和ES?間的能量差。這種能量差越小，過渡態(tài)就越容易達(dá)到，過渡態(tài)的濃度越高，反應(yīng)速度就越快。②ES?具有的自由能顯然比S?的低。①在沒有催化劑存在的情況下，能障（即活化能）是S和S?之間17

ES與過渡態(tài)（ES?）是不同的概念。酶促反應(yīng)速度由ES和ES?之間的能量差決定！這個差值越小，酶促反應(yīng)速度就越快。在有催化劑存在下，ES和ES?之間的能量差顯著減小ES與過渡態(tài)（ES?）是不同的概念。酶促反應(yīng)18

ES復(fù)合物是不穩(wěn)定的，它容易解離成E＋S。在ES復(fù)合物中，底物與酶的結(jié)合并不是處于最適狀態(tài)，即不是處于完全互補(bǔ)的狀態(tài)。換句話說，酶活性部位的基團(tuán)以及能與底物發(fā)生弱的相互作用的氨基酸殘基并未全部參與到同底物的結(jié)合中去。只有當(dāng)ES進(jìn)行轉(zhuǎn)變，進(jìn)入到轉(zhuǎn)換態(tài)ES?，才能使底物處于一種最適的結(jié)合狀態(tài)。

這就是說，底物與過渡態(tài)的酶是互補(bǔ)的!ES復(fù)合物是不穩(wěn)定的，它容易解離成E＋S。19

應(yīng)當(dāng)注意！轉(zhuǎn)換態(tài)本身是不穩(wěn)定的，但由于轉(zhuǎn)換態(tài)與酶的互補(bǔ)結(jié)合是由眾多的相互作用所釋放出的能量(即所謂結(jié)合能)使轉(zhuǎn)換態(tài)變得穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)注意！轉(zhuǎn)換態(tài)本身是不穩(wěn)定的，但由于轉(zhuǎn)換態(tài)20●在70～80年代，W.P.Jencks預(yù)言，抗某個反應(yīng)過渡態(tài)的抗體具有催化該反應(yīng)的能力?！?975年前后，抗體酶處于探索的開始階段，一般采用誘導(dǎo)法、引入法進(jìn)行嘗試，一般效率很低，

有的還測定不出活性。主要原因是具有催化活性的抗體太少，在大量的抗體中只有少數(shù)幾個有活性，甚至都沒有活性。●1975年時，G.Kohler&C.Milstein

發(fā)明了單克隆抗體技術(shù)后，就有了后來的抗體酶?！裨?0～80年代，W.P.Jencks預(yù)言，抗某個反應(yīng)過21

●1986年，美國的Schultz小組研究“對硝基苯酚磷酸膽堿脂（pNPPC）”相應(yīng)的羧酸二酯水解反應(yīng)的過渡態(tài)類似物時，推測用這個過渡態(tài)類似物作半抗原

這樣的分析，后來的確從中 選出了兩株有催化活性的單 克隆抗體,一株MOPC167的 水解速度達(dá)到了1.2x104倍。 經(jīng)過測定，這個抗體酶符合米氏方程，具有底物專一性需要一定的溫度等酶的催化特征。

●1986年，美國的Schultz小組研究“對硝基苯22抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件23結(jié)果表明底物類似物的結(jié)構(gòu)與抗體酶有關(guān)。另一實驗：合成一個含吡啶甲酸的磷酸酯化合物

用這個過渡態(tài)類似物作半抗原免役小鼠，得到12株單抗。結(jié)果表明底物類似物的結(jié)構(gòu)與抗體酶有關(guān)。24結(jié)果：

3株有抗體酶活性，其中一株6D4能與半抗原分子結(jié)合外，還能催化不含吡啶甲酸的相應(yīng)磷酸酯化合物水解，速度快103倍，具有底物專一性和對pH的依賴性。用半抗原可以競爭性地抑制這個反應(yīng)。還發(fā)現(xiàn)單抗的結(jié)合位點的氨基酸改變，可以影響它的催化活性。后來，有了成功的經(jīng)驗后，抗體酶的研究文章越來越多。結(jié)果：25抗體酶的作用特點：●在專一性方面超過或相當(dāng)于我們講的普通酶?！裨诜磻?yīng)速度方面接近普通酶，目前在總體上要

低一些。

▲原因：抗體酶沒有結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)等動態(tài)變化；產(chǎn)物釋放困難；底物、產(chǎn)物的交換困難?？贵w酶的作用特點：26抗體酶的制備一、酶蛋白誘導(dǎo)法二、半抗原誘導(dǎo)法三、抗體分子修飾法（引入法）抗體酶的制備一、酶蛋白誘導(dǎo)法27O–C–A.酯酶的底物–酯B.酯的羧基碳原子受到親核攻擊形成四面體過渡態(tài)C.設(shè)計的磷酸酯類似物,作為抗原去免疫實驗動物磷酸酯類似物(半抗原)對酯水解反應(yīng)有催化作用的單克隆抗體免疫免疫反應(yīng)誘導(dǎo)法制備具有酯酶活性的抗體OA.酯酶的底B.酯的羧基碳原子受到親核攻擊形成28

酶蛋白誘導(dǎo)法（拷貝法）●用已知的酶作為抗原對動物進(jìn)行第一次免疫,獲得該酶的抗體;再用這種抗體作為抗原進(jìn)行第二次免疫獲得抗抗體,抗抗體實際上就是具有原來酶活性的抗體酶。優(yōu)點:可以大量生產(chǎn)單克隆的抗體酶缺點:有相當(dāng)大的盲目性和偶然性，并不能產(chǎn)生新酶。酶第一次免疫抗酶抗體第二次免疫抗體酶拷貝法制備抗體酶酶蛋白誘導(dǎo)法（拷貝法）酶第一次免疫29

半抗原誘導(dǎo)法（細(xì)胞融合法）●先用特定的半抗原(過渡態(tài)底物決定)與載體蛋白相連(如牛血清白蛋白等)。此偶聯(lián)的物質(zhì)作為抗原

免疫動物，產(chǎn)生抗體

產(chǎn)生抗體的脾臟細(xì)胞與骨髓融合，然后在體外培養(yǎng)，雜交體克隆化，然后繁殖成單一細(xì)胞或菌落單一細(xì)胞或菌落產(chǎn)生抗體。

用標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體技術(shù)來制備、分離、篩選抗體酶關(guān)鍵：用什么樣的抗原才能誘導(dǎo)出具有特定的酶催化功能的抗體？即由抗體向酶的轉(zhuǎn)變過程。aa過渡態(tài)類似物載體蛋白抗體酶半抗原誘導(dǎo)法制備抗體酶半抗原誘導(dǎo)30引入法(輔助因子）：●是用選擇性的化學(xué)修飾、基因工程或者蛋白質(zhì)工程方法，將催化基團(tuán)和輔助因子引入抗體的抗原結(jié)合部位?！馭chultz等人在IgAMOP315抗體結(jié)合部位選擇性引入巰基，然后用親和色譜純化。結(jié)果：它水解香豆酯的速度比對照高6×104倍●酶的活性中心很多有金屬離子。Lerner等將金屬離子引入抗體酶，成功地催化了肽鍵的選擇性水解。他們用三乙撐胺Co3+鹽作為金屬離子輔因子，半抗原分子帶有一肽鍵,通過羧酸根及仲胺基與金屬離子相連,再共價連接在載體蛋白上，免疫動物后產(chǎn)生的抗體，在金屬離子復(fù)合物作為輔因子的參與下，這些抗體酶能選擇性水解甘氨酸和丙氨酸之間的肽鍵，其轉(zhuǎn)化數(shù)達(dá)6×104。引入法(輔助因子）：31●吸毒是一個困繞著很多國家的難題，尤其是吸毒上癮后很難戒掉。目前，直接拮抗可卡因上癮的抗體還沒有找到?！裉鎿Q的方法是阻斷可卡因、鴉片和受體的結(jié)合。雖說抗鴉片的抗體能有效拮抗注射海洛因上癮的猴子，然而由于抗體和抗原形成復(fù)合物后不能再生，必須使用高劑量的抗體,使這一應(yīng)用受到限制。●抗體酶則不一樣，不但能和抗原結(jié)合，而且能使抗原水解而再生，這不但能減少抗體酶的用量，也能減少抗體酶的免疫原性。因此比其它抗體臨床應(yīng)用前景更好?？贵w酶用于戒毒●吸毒是一個困繞著很多國家的難題，尤其是吸毒上癮后很難戒掉。32Landry等用可卡因水解的過渡態(tài)類似物-磷酸單酯為半抗原，產(chǎn)生的單克隆抗體能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰膽堿酯酶差不多，水解后的可卡因片斷失去了可卡因刺激功能。因此，用人工抗體酶的被動免疫也許能阻斷可卡因上癮，達(dá)到戒毒目的。

Landry等用可卡因水解的過渡態(tài)類似物-磷酸單酯為半抗原，33酶活性的調(diào)節(jié)一、共價修飾酶活性的調(diào)節(jié)二、酶原活性的調(diào)節(jié)三、同工酶與酶活性調(diào)節(jié)四、激活劑和抑制劑對酶活性的調(diào)節(jié)（略）酶活性的調(diào)節(jié)一、共價修飾酶活性的調(diào)節(jié)34共價修飾酶活性的調(diào)節(jié)

某些酶可以通過其它酶對其多肽鏈上某些基團(tuán)進(jìn)行可逆的共價修飾，使其處于活性與非活性的互變狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)酶活性。這類酶稱為共價修飾酶。目前發(fā)現(xiàn)有數(shù)百種酶被翻譯后都要進(jìn)行共價修飾，其中一部分處于分支代謝途徑，成為對代謝流量起調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵酶或限速酶。

由于這種調(diào)節(jié)的生理意義廣泛，反應(yīng)靈敏，節(jié)約能量，機(jī)制多樣，在體內(nèi)顯得十分靈活，加之它們常受激素甚至神經(jīng)的指令，導(dǎo)致級聯(lián)放大反應(yīng)，所以日益引人注目。AP1GEDCBHEa-bEc-dEc-g關(guān)鍵酶（限速酶）P2共價修飾酶活性的調(diào)節(jié)某些酶可以通過其它酶對其多肽35蛋白質(zhì)的磷酸化和脫磷酸化

蛋白激酶ATPADP蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)Pn蛋白磷酸酶nPiH2O第一類：Ser/Thr型第二類：Tyr型

第一類：Ser/Thr型第二類：Tyr型第三類：雙重底物型蛋白質(zhì)的磷酸化和脫磷酸化蛋白激酶ATPADP蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)36反應(yīng)類型共價修飾被修飾的氨基酸殘基共價修飾反應(yīng)的例子磷酸化腺苷酰化尿苷?；疶yr,Ser,Thr.HisTyrTyr甲基化GluS-腺苷-MetS-腺苷-同型

Cys反應(yīng)類型37糖原磷酸化酶的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制

糖原磷酸化酶是由兩個相同的亞基構(gòu)成的二聚體，每個亞基都有一個大的N-端結(jié)構(gòu)域（484個殘基）和一個小的C-端結(jié)構(gòu)域。糖原磷酸化酶的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制38

級聯(lián)系統(tǒng)調(diào)控糖原分解示意圖意義：由于酶的共價修飾反應(yīng)是酶促反應(yīng)，只要有少量信號分子（如激素）存在，即可通過加速這種酶促反應(yīng)，而使大量的另一種酶發(fā)生化學(xué)修飾，從而獲得放大效應(yīng)。這種調(diào)節(jié)方式快速、效率極高。腎上腺素或胰高血糖素1、腺苷酸環(huán)化酶（無活性）腺苷酸環(huán)化酶（活性）2、ATPcAMPR、cAMP3、蛋白激酶（無活性）蛋白激酶（活性）4、磷酸化酶激酶（無活性）磷酸化酶激酶（活性）5、磷酸化酶b（無活性）磷酸化酶a（活性）6、糖原6-磷酸葡萄糖1-磷酸葡萄糖葡萄糖血液ATPADPATPADP腎上腺素或胰高血糖素132102104106108葡萄糖456

（極微量）

（大量）級聯(lián)系統(tǒng)調(diào)控糖原分解示意圖意義：由于酶的共價修飾反應(yīng)是39

糖原磷酸化酶以兩種構(gòu)象狀態(tài)存在，即有活性的R態(tài)和低活性(或無活性)的T態(tài)。AMP啟動向R態(tài)構(gòu)象轉(zhuǎn)變，而ATP、葡萄糖-6-磷酸等則有利于向低活性的T態(tài)轉(zhuǎn)換。糖原磷酸化酶和糖原合酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)糖原磷酸化酶以兩種構(gòu)象狀態(tài)存在，即有活性的R態(tài)和低40糖原磷酸化和糖原合酶的共價修飾調(diào)節(jié)

糖原磷酸化酶存在兩種形式，即低活性的磷酸化酶b和有活性的磷酸化酶a,

相應(yīng)的“轉(zhuǎn)換酶”能將低活性的b形式轉(zhuǎn)變成有活性的a形式。這種轉(zhuǎn)換涉及到磷酸化的共價修飾機(jī)制.糖原磷酸化和糖原合酶的共價修飾調(diào)節(jié)和有活性的磷酸化酶a,相41抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件42

共價修飾調(diào)節(jié)也是GS活性調(diào)節(jié)的一種重要的方式。GS的共價修飾調(diào)節(jié)是通過腺苷酸化（降低或失去活性）和去腺苷酸化（恢復(fù)活性）來實現(xiàn)的。GS的腺苷酸化是由腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶催化的。GS亞基397位的Tyr殘基的腺苷酸化，增大了對累積方式反饋抑制的敏感性，因而使GS的活性降低。GS的活性降低取決于它的腺苷酸化的程度。

共價修飾調(diào)節(jié)也是GS活性調(diào)節(jié)的一種重要的方式。GS的43

腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶與一種叫做PⅡ的四聚體蛋白形成一種復(fù)合物（圖）。當(dāng)PⅡ尿苷酸化時，該復(fù)合物使GS去腺苷酸化。當(dāng)PⅡ失去尿苷酸時，該復(fù)合物使GS腺苷酸化。PⅡ尿苷酸化的水平又取決于同一蛋白上的尿苷?；D(zhuǎn)移酶（它使PⅡ尿苷酸化）和去尿苷?；福ㄋ筆Ⅱ去尿苷酸化）兩種酶的相對活性。尿苷酰基轉(zhuǎn)移酶的活性可被α-酮戊二酸和ATP激活，但可被Gln和Pi抑制。去尿苷?；笇@些代謝物是不敏感的。這種代謝級聯(lián)反映E.coliGS對細(xì)胞氮素的需要極端靈敏。腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶尿苷酰基轉(zhuǎn)移酶腺苷?；D(zhuǎn)移酶與一種叫做PⅡ的四聚體蛋白形成44

酶原的激活

酶原——生物體自身合成的、沒有活性的酶前體。2.酶原的激活——酶原在一定條件下，從無活性轉(zhuǎn)變成有活性的過程。3.酶原激活機(jī)制——切除某一肽段4.酶原激活的生理意義

（1）避免對細(xì)胞的自身消化（2）酶原到達(dá)特定部位才發(fā)揮作用酶原的激活酶原——生物體自身合成的、沒有活性的45胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶活性中心胰蛋白酶原的激活示意圖胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶活性中心胰蛋白酶原的激活示意圖46

從無活性的蛋白質(zhì)原或酶原轉(zhuǎn)變成有活性的蛋白質(zhì)或酶的過程即稱激活或活化。酶原的激活（胰凝乳蛋白酶原激活過程）從無活性的蛋白質(zhì)原或酶原轉(zhuǎn)變成有活性的蛋白質(zhì)或酶的47

激活的關(guān)鍵是選擇性地切斷了Arg15和Ile16之間的肽鍵，使Ile16游離。在中性條件下，Ile16的α﹣NH3＋能和Asp194的β﹣COO－通過靜電作用形成離子鍵，有助于Ser195和His57之間以及His57和

Asp102之間通過氫鍵形成一個“電荷轉(zhuǎn)接系統(tǒng)”，使Ser195的側(cè)鏈具有更強(qiáng)的親核性，有利于和底物進(jìn)行作用，于是就表現(xiàn)出胰凝乳蛋白酶的完整的催化功能。激活的關(guān)鍵是選擇性地切斷了Arg15和Ile48胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶胰蛋白酶對各種胰臟蛋白酶的激活作用胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶彈性蛋白酶原彈性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶胰蛋白酶對各種胰臟蛋白酶的激活作49..50酶的多種分子形式——同工酶概念：存在于同一種屬或不同種屬，同一個體的不同組織或同一組織，同一細(xì)胞的不同亞單位，具有不同分子形式（結(jié)構(gòu)、分子量、等電點），但卻能催化相同的化學(xué)反應(yīng)的一組酶，稱之為同工酶（isoenzyme）。乳酸脫氫酶是研究得最多的同工酶。生物學(xué)功能：遺傳的標(biāo)志和個體發(fā)育及組織分化密切相關(guān)適應(yīng)不同組織或不同細(xì)胞器在代謝上的不同需要酶的多種分子形式——同工酶概念：存在于同一種屬或不同種屬，同51乳酸脫氫酶同工酶形成示意圖多肽亞基mRNA四聚體結(jié)構(gòu)基因a

b乳酸脫氫酶同工酶電泳圖譜+–H4MH3M2H2M3HM4點樣線乳酸脫氫酶同工酶形成示意圖多肽亞基mRNA四聚體結(jié)構(gòu)基因a52不同組織中LDH同工酶的電泳圖譜LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)

心肌腎肝骨骼肌血清-+原點不同組織中LDH同工酶的電泳圖譜LDH1(H4)LDH2(H53同工酶在各學(xué)科中的應(yīng)用(1)遺傳學(xué)和分類學(xué)：提供了一種精良的判別遺傳標(biāo)志的工具。(2)發(fā)育學(xué)：有效地標(biāo)志細(xì)胞類型及細(xì)胞在不同條件下的分化情況，以及個體發(fā)育和系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系。(3)生物化學(xué)和生理學(xué)：根據(jù)不同器官組織中同工酶的動力學(xué)、底物專一性、輔助因子專一性、酶的變構(gòu)性等性質(zhì)的差異，從而解釋它們代謝功能的差別。（4）醫(yī)學(xué)和臨床診斷：體內(nèi)同工酶的變化，可看作機(jī)體組織損傷，或遺傳缺陷，或腫瘤分化的的分子標(biāo)志。同工酶在各學(xué)科中的應(yīng)用(1)遺傳學(xué)和分類學(xué)：提供了一54

同一種酶的不同的同工酶在對底物的親和力和Vmax以及對產(chǎn)物所造成的抑制作用的敏感性等通常都是不同的，這反映出代謝上的需要。谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase,GS)是氮素代謝中的一種重要的酶，該酶催化依賴于ATP、由谷氨酸和NH4＋合成谷氨酰胺的反應(yīng)。在高等植物的葉片中，大多存在兩種不同類型的GS同工酶，即胞質(zhì)型的GS1和葉綠體型的GS2。這兩種同工酶在發(fā)育上以及在代謝中起著非重疊的作用。

同一種酶的不同的同工酶在對底物的親和力和Vmax以及55酶生物合成的調(diào)節(jié)——操縱子模型（原核生物）酶生物合成的調(diào)節(jié)56原核生物酶生物合成調(diào)節(jié)的必要性生活環(huán)境變化大、食物供應(yīng)無保證根據(jù)環(huán)境條件合成不同的蛋白質(zhì)代謝與環(huán)境變化適應(yīng)、維持生存與繁衍組成型酶適應(yīng)型酶原核生物酶生物合成調(diào)節(jié)的必要性生活環(huán)境變化大、食物供應(yīng)無保證57原核生物酶生物合成調(diào)節(jié)的總體原則●負(fù)責(zé)某個代謝過程的酶體系往往在需要時打開，而不需要時則關(guān)閉，構(gòu)成一個基因表達(dá)調(diào)控的“開－關(guān)”系統(tǒng)。●基因表達(dá)？基因表達(dá)調(diào)控？★轉(zhuǎn)錄水平★mRNA加工成熟水平★翻譯水平★翻譯后水平？●營養(yǎng)狀況、環(huán)境因素、激素水平、發(fā)育階段原核生物（細(xì)菌）真核生物（動物）原核生物酶生物合成調(diào)節(jié)的總體原則●負(fù)責(zé)某個代謝過程的酶體系往58轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)至關(guān)重要1、代謝產(chǎn)物對酶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

2、弱化/衰減子對酶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

3、降解物對酶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)物與DNA結(jié)合?

正調(diào)節(jié)

負(fù)調(diào)節(jié)

是開啟關(guān)閉否關(guān)閉開啟轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)至關(guān)重要1、代謝產(chǎn)物對酶基因表達(dá)的59代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)（1）可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)★酶基因在特殊代謝物或化合物的作用下由原來的關(guān)閉狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質(zhì)的誘導(dǎo)下使基因活化（進(jìn)入轉(zhuǎn)錄狀態(tài)）?！锎竽c桿菌乳糖操縱子（2）可阻遏調(diào)節(jié)★原來處于工作狀態(tài)（合成相關(guān)代謝酶）的基因由于受到某種特殊代謝物或化合物積累的影響而關(guān)閉，即在某些物質(zhì)的作用下基因去活化（停止轉(zhuǎn)錄）★大腸桿菌色氨酸操縱子代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)（1）可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)60弱化子調(diào)節(jié)★信號分子：具有特殊負(fù)載的氨酰－tRNA★弱化子：操縱子被阻遏，mRNA合成被終止時，起轉(zhuǎn)錄終止信號作用的核苷酸序列。弱化子調(diào)節(jié)★信號分子：具有特殊負(fù)載的氨酰－tRNA61酶的誘導(dǎo)和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑A.有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因啟動基因調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因

阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)阻遏蛋白(無活性)酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因,結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)代謝產(chǎn)物酶的誘導(dǎo)和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑A.有活性62

根據(jù)細(xì)菌酶的合成對環(huán)境的反應(yīng)不同，酶的合成可分為兩種類型：組成酶和適應(yīng)酶。適應(yīng)酶可分為誘導(dǎo)酶和阻遏酶。

1961年，法國科學(xué)家Jacob和Monod根據(jù)酶合成的誘導(dǎo)和阻遏的現(xiàn)象，提出了操縱子（operon）模型。操縱子是指編碼一特定代謝途徑酶的結(jié)構(gòu)基因和控制這些基因轉(zhuǎn)錄的控制順序所構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄單位。（這樣的轉(zhuǎn)錄單位在原核生物中即稱為操縱子。）

一)．乳糖操縱子（lacoperon）是酶誘導(dǎo)合成的例子1.乳糖操縱子的組織結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因：Z基因―――編碼β－半乳糖苷酶。

Y基因―――編碼半乳糖苷透過酶

A基因―――編碼硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰基酶操縱基因（operator）:是阻遏蛋白結(jié)合部位。啟動基因（又稱啟動子，promoter）:是RNA聚合酶結(jié)合的部位。根據(jù)細(xì)菌酶的合成對環(huán)境的反應(yīng)不同，酶的合成可分為兩種63抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件64抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件65抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件66抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件67抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件682.乳糖操縱子的調(diào)節(jié)在含有Glucose作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)E.coli時，調(diào)節(jié)基因（i）表達(dá)的產(chǎn)物阻遏蛋白結(jié)合到操縱基因上，阻止RNA聚合酶對結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。與乳糖利用有關(guān)的酶不能合成。（這時合成與乳糖利用有關(guān)的酶則是一種浪費）。在以乳糖為唯一碳源時，乳糖或它的異構(gòu)體別乳糖（1,6－allolactose）作為效應(yīng)物，與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，失去與操縱基因結(jié)合的能力,從而喪失抑制活性,解除了對結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄的抑制。這里乳糖就作為一種誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)與乳糖代謝有關(guān)酶的表達(dá)。

2.乳糖操縱子的調(diào)節(jié)69大腸桿菌乳

糖

操

縱

子

模型調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因PLacZLacYLacamRNA

阻遏蛋白（有活性）基因關(guān)閉啟動子ORPLacZLacYLaca調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因啟動子ORmRNAZmRNAYmRNAa

阻遏蛋白（無活性）基因表達(dá)mRNAA、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)

B、乳糖酶的誘導(dǎo)

乳糖

阻遏蛋白（有活性）大腸桿菌乳

糖

操

縱

子

模型調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因70抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件71抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件72分解代謝物阻遏

當(dāng)E.coli在含有Glucose的培養(yǎng)基中生長時，培養(yǎng)基中即使含有乳糖，在Glucose被用完之前，是不會產(chǎn)生與乳糖利用有關(guān)的酶的，這種效應(yīng)稱為Glucose效應(yīng)或分解代謝物阻遏。分解代謝物阻遏當(dāng)E.coli在含有Glucos73因為乳糖操縱子的啟動子可分為兩部分：▲RNA聚合酶結(jié)合部位:富含A·T對，并在它的側(cè)翼富含G·C對▲CAP（orCRP）識別/結(jié)合部位:富含G·C對，且是回文結(jié)構(gòu)。CAP叫做分解代謝物基因活化蛋白（CRP稱為cAMP－受體蛋白）它能使G·C對變得不穩(wěn)定，可促進(jìn)A·T對分開，從而有利于轉(zhuǎn)錄。但CAP的活性受cAMP水平的調(diào)節(jié)。當(dāng)cAMP與CAP結(jié)合后才能使CAP同啟動子的CAP結(jié)合部位結(jié)合。CAMP的水平受Glucose的某種分解代謝物的影響,該代謝物可以抑制細(xì)菌腺苷環(huán)化酶的活性，激活磷酸二酯酶的活性，因而可以降低cAMP的濃度.所以當(dāng)有Glucose存在時,細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平顯著下降。這樣cAMP－CAP的濃度降低，不能促進(jìn)RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，也就抑制了酶的誘導(dǎo)合成。只有當(dāng)以乳糖作為唯一碳源時，才不會存在Glucose的分解代謝物阻遏的現(xiàn)象。這時，cAMP－CAP的水平升高，在乳糖的誘導(dǎo)下即可合成與乳糖代謝有關(guān)的酶。因為乳糖操縱子的啟動子可分為兩部分：74CAP叫做分解代謝物基因活化蛋白(CRP，即cAMP-受體蛋白)它能使G·C對變得不穩(wěn)定，可促進(jìn)A·T對分開，從而有利于轉(zhuǎn)錄CAP叫做分解代謝物基因活化蛋白(CRP，即cAMP-受體蛋75抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件76乳糖操縱子的降解物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表達(dá)CAP基因結(jié)構(gòu)基因TCGP(CAP)OCAP結(jié)合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關(guān)系cAMPCGP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）

CAP：環(huán)腺苷酸受體蛋白（cycilicAMPreceptorprotein）降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態(tài)乳糖操縱子的降解物阻遏RLacZLacYLacamRNAmR77

cAMP－CAP復(fù)合物系統(tǒng)是以cAMP為信號的正調(diào)節(jié)系統(tǒng)。它對所有分解代謝物敏感的操縱子（包括lac和ara-operon）都有控制作用。在這里，乳糖利用酶的表達(dá)受到雙重控制，即以乳糖為誘導(dǎo)物的“精調(diào)”以及以cAMP為信號的“中調(diào)“控制。cAMP－CAP復(fù)合物系統(tǒng)是以cAMP為信號的正調(diào)節(jié)78色氨酸操縱子是酶合成阻遏調(diào)節(jié)的例子

在合成代謝中，催化氨基酸或其他小分子最終產(chǎn)物合成的酶隨時都需要，細(xì)胞中的這些酶經(jīng)常在合成,即這些酶的合成經(jīng)常處于去阻遏的狀態(tài)。所以，在這類操縱子中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物——阻遏蛋白是不活潑的，不能和操縱基因結(jié)合.

當(dāng)合成途徑中的最終產(chǎn)物過量時，它就與阻遏蛋白結(jié)合，激活阻遏蛋白。激活后的阻遏蛋白就能結(jié)合到操縱基因上，阻止RNA聚合酶對結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，與合成反應(yīng)有關(guān)的酶也就不能被合成。最終產(chǎn)物或其衍生物稱為輔阻遏物。E.coli和鼠傷寒沙門氏菌的色氨酸操縱子調(diào)節(jié)即是這種阻遏調(diào)節(jié)的典型。色氨酸操縱子是酶合成阻遏調(diào)節(jié)的例子在791.色氨酸操縱子（trpoperon）的組織結(jié)構(gòu)

結(jié)構(gòu)基因（A.B.C.D.E）編碼從分支酸開始到色氨酸合成的五種酶。trpL編碼一個前導(dǎo)肽。在trpL中有一段序列被稱為attenuator（弱化基因或者衰減子）。此外，同樣存在操縱基因和啟動基因。2.終產(chǎn)物Trp對trpoperon的調(diào)節(jié)

Trp作為一種輔阻遏物激活阻遏蛋白。當(dāng)培養(yǎng)基中含有豐富的Trp或者它的合成過量時，即可激活阻遏蛋白（trpR的產(chǎn)物），激活后的阻遏蛋白即可結(jié)合到operator上，阻止RNA聚合酶對結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，從而停止與Trp合成有關(guān)的酶的合成。于是Trp合成便停止。1.色氨酸操縱子（trpoperon）的組織結(jié)構(gòu)80trpRP1O

trpEtrpDP2trpCtrpBtrpA鄰氨基苯甲酸合成酶吲哚甘油硼酸合成酶色氨酸合成酶鏈鏈分支酸鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基鄰氨基苯甲酸CDRP吲哚甘油-磷酸色氨酸阻遏物轉(zhuǎn)錄沒有色氨酸時，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，能轉(zhuǎn)錄合成色氨酸所需要的酶。trpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtr81抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件82抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件83抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件84抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件85抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件86attenuator

弱化基因存在于trpL內(nèi)，含有4個互補(bǔ)的片段，它們能形成莖－環(huán)結(jié)構(gòu)，即1,2-莖環(huán)和3,4-莖環(huán)。如果因核糖體停留下來，不能形成1,2-莖環(huán)時，導(dǎo)致2,3-莖環(huán)的形成。2,3-莖環(huán)阻止了3,4－莖環(huán)的形成。由于3,4-莖環(huán)及其后面連續(xù)的UUU…（類似不依賴于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止信號）是一種有效的轉(zhuǎn)錄終止信號。因此轉(zhuǎn)錄就會在此部位終止。在Trp缺乏下，就會導(dǎo)致核糖體停留在片段1上的兩個色氨酸密碼子上。由于核糖體很大，于是就阻止了1,2-莖環(huán)的形成，此時只能形成2,3-莖環(huán)，而不能形成3,4－莖環(huán)，終止信號不復(fù)存在，轉(zhuǎn)錄不會停止。當(dāng)Trp很豐富時，核糖體就不會停止在色氨酸的兩個密碼子處，解除了1,2－莖環(huán)形成的空間障礙，也同時解除了2,3－莖環(huán)的形成，而有利于3,4－莖環(huán)的形成。在此種情況下，轉(zhuǎn)錄便會終止。從上面的介紹中，可以看到trpoperon也受到兩種機(jī)制的控制。attenuator87抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件88抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件89大腸桿菌色氨酸操縱子的衰減作用的可能機(jī)制Trp密碼子111232233444核糖體核糖體轉(zhuǎn)錄繼續(xù)轉(zhuǎn)錄終止C.高濃度色氨酸使核糖體到達(dá)2部位，3與4堿基配對，轉(zhuǎn)錄終止。A.游離mRNA中1與2以及3與4堿基配對。B.低濃度色氨酸使核糖體停留在1部位，轉(zhuǎn)錄得以完成。大腸桿菌色氨酸操縱子的衰減作用的可能機(jī)制Trp111232290色氨酸啟動子trptrpRP1O

trpEtrpDP2trpCtrpBtrpAtrpR阻遏蛋白基因；P1P2啟動子；O操縱基因；

衰減子來自大腸桿菌的色氨酸操縱子色氨酸啟動子trptrpRP1OtrpEtrpDP2tr91trpRP1O

trpEtrpDP2trpCtrpBtrpA鄰氨基苯甲酸合成酶吲哚甘油硼酸合成酶色氨酸合成酶鏈鏈分支酸鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基鄰氨基苯甲酸CDRP吲哚甘油-磷酸色氨酸阻遏物轉(zhuǎn)錄（P1是主要啟動子，P2的作用只有3%。）沒有色氨酸時，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，能轉(zhuǎn)錄合成色氨酸所需要的酶。trpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrp92

trpRP1O

trpEtrpDP2trpCtrpBtrpA阻遏物色氨酸結(jié)合不轉(zhuǎn)錄用于表達(dá)載體的trp啟動子一般只包含啟動基因、操縱基因、和部分trpE基因。P1OtrpE目的基因有色氨酸時，阻遏蛋白與色氨酸結(jié)合后才能與操縱基因結(jié)合，從而阻止色氨酸合成酶類的轉(zhuǎn)錄（稱為corepressor）。trpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtr93真核生物基因表達(dá)調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物RNAmRNA蛋白質(zhì)前體mRNA降解物活性蛋白質(zhì)DNA水平調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工的調(diào)節(jié)翻譯調(diào)節(jié)mRNA降解調(diào)節(jié)翻譯后加工的調(diào)節(jié)核細(xì)胞質(zhì)

真核基因表達(dá)調(diào)控的五個水平

DNA水平調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工的調(diào)節(jié)翻譯水平調(diào)節(jié)翻譯后加工的調(diào)節(jié)真核基因調(diào)控主要是正調(diào)控順式作用元件和反式作用因子轉(zhuǎn)錄因子的相互作用控制轉(zhuǎn)錄真核生物基因表達(dá)調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物RNAmRNA蛋白質(zhì)前體94抗體酶（abzyme

）（catalyticantibody

）抗體酶（abzyme）95

知識要點1、什么是抗體酶？2、抗體和酶的特點比較3、抗體酶的作用特點4、抗體酶的制備5、抗體酶的應(yīng)用前景知識要點1、什么是抗體酶？96什么是抗體酶？●在免疫球蛋白的易變區(qū)賦予酶的屬性，成為具有催化活性的抗體●生物學(xué)與化學(xué)的研究成果在分子水平上交叉的產(chǎn)物●抗體的多樣性+酶分子的高效催化=新酶設(shè)計●酶反應(yīng)過渡態(tài)類似物作為半抗原免疫動物產(chǎn)生有催化活性的抗體，采用單克隆抗體技術(shù)獲得這種具有酶特性的抗體。什么是抗體酶？●在免疫球蛋白的易變區(qū)賦予酶的屬性，成為具有催97基本概念①

免疫？②抗體？③抗原？④半抗原？⑤多克隆抗體？⑥

單克隆抗體？基本概念①免疫？98免疫系統(tǒng)和免疫球蛋白功能

免疫是人類和脊椎動物最重要的防御機(jī)制，免疫系統(tǒng)能在分子水平上識別“自我”和“非我”，然后破壞那些被鑒定為非我的成分。在生理水平上免疫系統(tǒng)對入侵的反應(yīng)或應(yīng)答是多種類型的蛋白質(zhì)、分子和細(xì)胞之間的一套復(fù)雜而協(xié)同的相互作用，如果從個別蛋白質(zhì)水平來看，免疫反應(yīng)可以看作是一種配體與蛋白質(zhì)可逆結(jié)合的生化系統(tǒng)。1．抗原、抗體和免疫球蛋白的概念2．免疫球蛋白的類別3．免疫球蛋白結(jié)構(gòu)和免疫系統(tǒng)4．多克隆抗體和單克隆抗體免疫系統(tǒng)和免疫球蛋白功能免疫是人類和脊椎動物最99什么是“免疫球蛋白”？(immunoglobulin)具有抗體活性的動物蛋白,是一種糖蛋白。主要存在于血漿中，也見于其他體液、組織和一些分泌液中。人血漿內(nèi)的免疫球蛋白大多數(shù)存在于丙種球蛋白（γ-球蛋白）中?？煞譃槲孱?，即免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）。其中IgG是最主要的免疫球蛋白，約占人血漿丙種球蛋白的70%，分子量約15萬，含糖2～3%。IgG分子由4條肽鏈組成。其中分子量為2.5萬的肽鏈，稱輕鏈，分子量為5萬的肽鏈，稱重鏈。輕鏈與重鏈之間通過二硫鍵（—S—S—）相連接。免疫球蛋白是機(jī)體受抗原（如病原體）刺激后產(chǎn)生的，其主要作用是與抗原起免疫反應(yīng)，生成抗原-抗體復(fù)合物，從而阻斷病原體對機(jī)體的危害，使病原體失去致病作用。另一方面，免疫球蛋白有時也有致病作用。臨床上的過敏癥狀如花粉引起的支氣管痙攣，青霉素導(dǎo)致全身過敏反應(yīng)，皮膚蕁麻疹（俗稱風(fēng)疹塊）等都是由免疫球蛋白制劑能增強(qiáng)人體抗病毒的能力，可作藥用。如注射人血清或人胎盤中提取的丙種球蛋白制劑可防治麻疹、傳染性肝炎等傳染病。

什么是“免疫球蛋白”？100人免疫球蛋白的分類

IgGIgAIgMIgDIgE重鏈類別輕鏈類別或或或或或鏈的組成

人免疫球蛋白的分類101抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件102免疫球蛋白IgG的一級結(jié)構(gòu)

免疫球蛋白IgG的一級結(jié)構(gòu)

103IgG結(jié)構(gòu)IgG結(jié)構(gòu)104

IgM的一級結(jié)構(gòu)IgM的一級結(jié)構(gòu)105IgG的空間結(jié)構(gòu)

IgG的空間結(jié)構(gòu)

106IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格

IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格

107多克隆抗體和單克隆抗體

如果給動物注射抗原,雖然抗原與各種抗體產(chǎn)生細(xì)胞的親和性有所不同,但是還是有大量抗體產(chǎn)生細(xì)胞將與之結(jié)合,結(jié)果血液中出現(xiàn)的抗體源于數(shù)種不同的細(xì)胞克隆，這些抗體就是多克隆抗體（polyclonalantibodies）。如果可以分離到抗體產(chǎn)生細(xì)胞的單克隆，然后使所有的抗體均來自同樣的克隆，這樣制備的抗體稱為單克隆抗體（monoclonalantibodies）。由于單抗細(xì)胞的壽命有限，嚴(yán)重限制了單抗的常規(guī)制備。1975年，Milsetein和Kohler創(chuàng)建了不受限制地大量制備針對特異抗原的單抗技術(shù)，將可產(chǎn)生專一性抗體的B淋巴細(xì)胞與具有無限繁殖能力的惡性淋巴瘤細(xì)胞（骨髓瘤細(xì)胞）融合，融合體稱為雜交瘤細(xì)胞，它既可以永久地培養(yǎng)，又可分泌大量的均一的抗體。由于用這個技術(shù)產(chǎn)生的抗體具有很高的專一性，現(xiàn)已成為研究的常用工具。多克隆抗體和單克隆抗體如果給動物注射抗原,雖然108抗體和酶的特點比較

酶

抗體底物結(jié)合專一性比較高非常高底物結(jié)合形變?nèi)菀鬃冃尾灰鬃冃畏N類比較多非常多物質(zhì)轉(zhuǎn)變活性高無

如何將抗體轉(zhuǎn)變成酶？抗體和酶的特點比較109

抗體酶研究背景●1948年LinusPauling提出了酶的過渡態(tài)催化理論,認(rèn)為酶和底物結(jié)合不是在基態(tài)上，因為酶與基態(tài)底物的結(jié)合十分困難，需要克服很大的能障。過渡態(tài)結(jié)構(gòu)十分容易與酶結(jié)合，因為酶結(jié)構(gòu)經(jīng)過底物誘導(dǎo)等，親和力最強(qiáng)。十分容易越過能障，加速催化速度。所以酶具有催化速度快和高選擇性（專一性）抗體酶研究背景110①

在沒有催化劑存在的情況下，能障（即活化能）是S和S?之間的能量差。在有酶催化時，能障是ES和ES?間的能量差。這種能量差越小，過渡態(tài)就越容易達(dá)到，過渡態(tài)的濃度越高，反應(yīng)速度就越快。②ES?具有的自由能顯然比S?的低。①在沒有催化劑存在的情況下，能障（即活化能）是S和S?之間111

ES與過渡態(tài)（ES?）是不同的概念。酶促反應(yīng)速度由ES和ES?之間的能量差決定！這個差值越小，酶促反應(yīng)速度就越快。在有催化劑存在下，ES和ES?之間的能量差顯著減小ES與過渡態(tài)（ES?）是不同的概念。酶促反應(yīng)112

ES復(fù)合物是不穩(wěn)定的，它容易解離成E＋S。在ES復(fù)合物中，底物與酶的結(jié)合并不是處于最適狀態(tài)，即不是處于完全互補(bǔ)的狀態(tài)。換句話說，酶活性部位的基團(tuán)以及能與底物發(fā)生弱的相互作用的氨基酸殘基并未全部參與到同底物的結(jié)合中去。只有當(dāng)ES進(jìn)行轉(zhuǎn)變，進(jìn)入到轉(zhuǎn)換態(tài)ES?，才能使底物處于一種最適的結(jié)合狀態(tài)。

這就是說，底物與過渡態(tài)的酶是互補(bǔ)的!ES復(fù)合物是不穩(wěn)定的，它容易解離成E＋S。113

應(yīng)當(dāng)注意！轉(zhuǎn)換態(tài)本身是不穩(wěn)定的，但由于轉(zhuǎn)換態(tài)與酶的互補(bǔ)結(jié)合是由眾多的相互作用所釋放出的能量(即所謂結(jié)合能)使轉(zhuǎn)換態(tài)變得穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)注意！轉(zhuǎn)換態(tài)本身是不穩(wěn)定的，但由于轉(zhuǎn)換態(tài)114●在70～80年代，W.P.Jencks預(yù)言，抗某個反應(yīng)過渡態(tài)的抗體具有催化該反應(yīng)的能力?！?975年前后，抗體酶處于探索的開始階段，一般采用誘導(dǎo)法、引入法進(jìn)行嘗試，一般效率很低，

有的還測定不出活性。主要原因是具有催化活性的抗體太少，在大量的抗體中只有少數(shù)幾個有活性，甚至都沒有活性?！?975年時，G.Kohler&C.Milstein

發(fā)明了單克隆抗體技術(shù)后，就有了后來的抗體酶?！裨?0～80年代，W.P.Jencks預(yù)言，抗某個反應(yīng)過115

●1986年，美國的Schultz小組研究“對硝基苯酚磷酸膽堿脂（pNPPC）”相應(yīng)的羧酸二酯水解反應(yīng)的過渡態(tài)類似物時，推測用這個過渡態(tài)類似物作半抗原

這樣的分析，后來的確從中 選出了兩株有催化活性的單 克隆抗體,一株MOPC167的 水解速度達(dá)到了1.2x104倍。 經(jīng)過測定，這個抗體酶符合米氏方程，具有底物專一性需要一定的溫度等酶的催化特征。

●1986年，美國的Schultz小組研究“對硝基苯116抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件117結(jié)果表明底物類似物的結(jié)構(gòu)與抗體酶有關(guān)。另一實驗：合成一個含吡啶甲酸的磷酸酯化合物

用這個過渡態(tài)類似物作半抗原免役小鼠，得到12株單抗。結(jié)果表明底物類似物的結(jié)構(gòu)與抗體酶有關(guān)。118結(jié)果：

3株有抗體酶活性，其中一株6D4能與半抗原分子結(jié)合外，還能催化不含吡啶甲酸的相應(yīng)磷酸酯化合物水解，速度快103倍，具有底物專一性和對pH的依賴性。用半抗原可以競爭性地抑制這個反應(yīng)。還發(fā)現(xiàn)單抗的結(jié)合位點的氨基酸改變，可以影響它的催化活性。后來，有了成功的經(jīng)驗后，抗體酶的研究文章越來越多。結(jié)果：119抗體酶的作用特點：●在專一性方面超過或相當(dāng)于我們講的普通酶?！裨诜磻?yīng)速度方面接近普通酶，目前在總體上要

低一些。

▲原因：抗體酶沒有結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)等動態(tài)變化；產(chǎn)物釋放困難；底物、產(chǎn)物的交換困難?？贵w酶的作用特點：120抗體酶的制備一、酶蛋白誘導(dǎo)法二、半抗原誘導(dǎo)法三、抗體分子修飾法（引入法）抗體酶的制備一、酶蛋白誘導(dǎo)法121O–C–A.酯酶的底物–酯B.酯的羧基碳原子受到親核攻擊形成四面體過渡態(tài)C.設(shè)計的磷酸酯類似物,作為抗原去免疫實驗動物磷酸酯類似物(半抗原)對酯水解反應(yīng)有催化作用的單克隆抗體免疫免疫反應(yīng)誘導(dǎo)法制備具有酯酶活性的抗體OA.酯酶的底B.酯的羧基碳原子受到親核攻擊形成122

酶蛋白誘導(dǎo)法（拷貝法）●用已知的酶作為抗原對動物進(jìn)行第一次免疫,獲得該酶的抗體;再用這種抗體作為抗原進(jìn)行第二次免疫獲得抗抗體,抗抗體實際上就是具有原來酶活性的抗體酶。優(yōu)點:可以大量生產(chǎn)單克隆的抗體酶缺點:有相當(dāng)大的盲目性和偶然性，并不能產(chǎn)生新酶。酶第一次免疫抗酶抗體第二次免疫抗體酶拷貝法制備抗體酶酶蛋白誘導(dǎo)法（拷貝法）酶第一次免疫123

半抗原誘導(dǎo)法（細(xì)胞融合法）●先用特定的半抗原(過渡態(tài)底物決定)與載體蛋白相連(如牛血清白蛋白等)。此偶聯(lián)的物質(zhì)作為抗原

免疫動物，產(chǎn)生抗體

產(chǎn)生抗體的脾臟細(xì)胞與骨髓融合，然后在體外培養(yǎng)，雜交體克隆化，然后繁殖成單一細(xì)胞或菌落單一細(xì)胞或菌落產(chǎn)生抗體。

用標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體技術(shù)來制備、分離、篩選抗體酶關(guān)鍵：用什么樣的抗原才能誘導(dǎo)出具有特定的酶催化功能的抗體？即由抗體向酶的轉(zhuǎn)變過程。aa過渡態(tài)類似物載體蛋白抗體酶半抗原誘導(dǎo)法制備抗體酶半抗原誘導(dǎo)124引入法(輔助因子）：●是用選擇性的化學(xué)修飾、基因工程或者蛋白質(zhì)工程方法，將催化基團(tuán)和輔助因子引入抗體的抗原結(jié)合部位。●Schultz等人在IgAMOP315抗體結(jié)合部位選擇性引入巰基，然后用親和色譜純化。結(jié)果：它水解香豆酯的速度比對照高6×104倍●酶的活性中心很多有金屬離子。Lerner等將金屬離子引入抗體酶，成功地催化了肽鍵的選擇性水解。他們用三乙撐胺Co3+鹽作為金屬離子輔因子，半抗原分子帶有一肽鍵,通過羧酸根及仲胺基與金屬離子相連,再共價連接在載體蛋白上，免疫動物后產(chǎn)生的抗體，在金屬離子復(fù)合物作為輔因子的參與下，這些抗體酶能選擇性水解甘氨酸和丙氨酸之間的肽鍵，其轉(zhuǎn)化數(shù)達(dá)6×104。引入法(輔助因子）：125●吸毒是一個困繞著很多國家的難題，尤其是吸毒上癮后很難戒掉。目前，直接拮抗可卡因上癮的抗體還沒有找到?！裉鎿Q的方法是阻斷可卡因、鴉片和受體的結(jié)合。雖說抗鴉片的抗體能有效拮抗注射海洛因上癮的猴子，然而由于抗體和抗原形成復(fù)合物后不能再生，必須使用高劑量的抗體,使這一應(yīng)用受到限制?！窨贵w酶則不一樣，不但能和抗原結(jié)合，而且能使抗原水解而再生，這不但能減少抗體酶的用量，也能減少抗體酶的免疫原性。因此比其它抗體臨床應(yīng)用前景更好?？贵w酶用于戒毒●吸毒是一個困繞著很多國家的難題，尤其是吸毒上癮后很難戒掉。126Landry等用可卡因水解的過渡態(tài)類似物-磷酸單酯為半抗原，產(chǎn)生的單克隆抗體能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰膽堿酯酶差不多，水解后的可卡因片斷失去了可卡因刺激功能。因此，用人工抗體酶的被動免疫也許能阻斷可卡因上癮，達(dá)到戒毒目的。

Landry等用可卡因水解的過渡態(tài)類似物-磷酸單酯為半抗原，127酶活性的調(diào)節(jié)一、共價修飾酶活性的調(diào)節(jié)二、酶原活性的調(diào)節(jié)三、同工酶與酶活性調(diào)節(jié)四、激活劑和抑制劑對酶活性的調(diào)節(jié)（略）酶活性的調(diào)節(jié)一、共價修飾酶活性的調(diào)節(jié)128共價修飾酶活性的調(diào)節(jié)

某些酶可以通過其它酶對其多肽鏈上某些基團(tuán)進(jìn)行可逆的共價修飾，使其處于活性與非活性的互變狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)酶活性。這類酶稱為共價修飾酶。目前發(fā)現(xiàn)有數(shù)百種酶被翻譯后都要進(jìn)行共價修飾，其中一部分處于分支代謝途徑，成為對代謝流量起調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵酶或限速酶。

由于這種調(diào)節(jié)的生理意義廣泛，反應(yīng)靈敏，節(jié)約能量，機(jī)制多樣，在體內(nèi)顯得十分靈活，加之它們常受激素甚至神經(jīng)的指令，導(dǎo)致級聯(lián)放大反應(yīng)，所以日益引人注目。AP1GEDCBHEa-bEc-dEc-g關(guān)鍵酶（限速酶）P2共價修飾酶活性的調(diào)節(jié)某些酶可以通過其它酶對其多肽129蛋白質(zhì)的磷酸化和脫磷酸化

蛋白激酶ATPADP蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)Pn蛋白磷酸酶nPiH2O第一類：Ser/Thr型第二類：Tyr型

第一類：Ser/Thr型第二類：Tyr型第三類：雙重底物型蛋白質(zhì)的磷酸化和脫磷酸化蛋白激酶ATPADP蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)130反應(yīng)類型共價修飾被修飾的氨基酸殘基共價修飾反應(yīng)的例子磷酸化腺苷?；蜍挣；疶yr,Ser,Thr.HisTyrTyr甲基化GluS-腺苷-MetS-腺苷-同型

Cys反應(yīng)類型131糖原磷酸化酶的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制

糖原磷酸化酶是由兩個相同的亞基構(gòu)成的二聚體，每個亞基都有一個大的N-端結(jié)構(gòu)域（484個殘基）和一個小的C-端結(jié)構(gòu)域。糖原磷酸化酶的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制132

級聯(lián)系統(tǒng)調(diào)控糖原分解示意圖意義：由于酶的共價修飾反應(yīng)是酶促反應(yīng)，只要有少量信號分子（如激素）存在，即可通過加速這種酶促反應(yīng)，而使大量的另一種酶發(fā)生化學(xué)修飾，從而獲得放大效應(yīng)。這種調(diào)節(jié)方式快速、效率極高。腎上腺素或胰高血糖素1、腺苷酸環(huán)化酶（無活性）腺苷酸環(huán)化酶（活性）2、ATPcAMPR、cAMP3、蛋白激酶（無活性）蛋白激酶（活性）4、磷酸化酶激酶（無活性）磷酸化酶激酶（活性）5、磷酸化酶b（無活性）磷酸化酶a（活性）6、糖原6-磷酸葡萄糖1-磷酸葡萄糖葡萄糖血液ATPADPATPADP腎上腺素或胰高血糖素132102104106108葡萄糖456

（極微量）

（大量）級聯(lián)系統(tǒng)調(diào)控糖原分解示意圖意義：由于酶的共價修飾反應(yīng)是133

糖原磷酸化酶以兩種構(gòu)象狀態(tài)存在，即有活性的R態(tài)和低活性(或無活性)的T態(tài)。AMP啟動向R態(tài)構(gòu)象轉(zhuǎn)變，而ATP、葡萄糖-6-磷酸等則有利于向低活性的T態(tài)轉(zhuǎn)換。糖原磷酸化酶和糖原合酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)糖原磷酸化酶以兩種構(gòu)象狀態(tài)存在，即有活性的R態(tài)和低134糖原磷酸化和糖原合酶的共價修飾調(diào)節(jié)

糖原磷酸化酶存在兩種形式，即低活性的磷酸化酶b和有活性的磷酸化酶a,

相應(yīng)的“轉(zhuǎn)換酶”能將低活性的b形式轉(zhuǎn)變成有活性的a形式。這種轉(zhuǎn)換涉及到磷酸化的共價修飾機(jī)制.糖原磷酸化和糖原合酶的共價修飾調(diào)節(jié)和有活性的磷酸化酶a,相135抗體酶與酶的修飾及活性調(diào)節(jié)課件136

共價修飾調(diào)節(jié)也是GS活性調(diào)節(jié)的一種重要的方式。GS的共價修飾調(diào)節(jié)是通過腺苷酸化（降低或失去活性）和去腺苷酸化（恢復(fù)活性）來實現(xiàn)的。GS的腺苷酸化是由腺苷?；D(zhuǎn)移酶催化的。GS亞基397位的Tyr殘基的腺苷酸化，增大了對累積方式反饋抑制的敏感性，因而使GS的活性降低。GS的活性降低取決于它的腺苷酸化的程度。

共價修飾調(diào)節(jié)也是GS活性調(diào)節(jié)的一種重要的方式。GS的137

腺苷?；D(zhuǎn)移酶與一種叫做PⅡ的四聚體蛋白形成一種復(fù)合物（圖）。當(dāng)PⅡ尿苷酸化時，該復(fù)合物使GS去腺苷酸化。當(dāng)PⅡ失去尿苷酸時，該復(fù)合物使GS腺苷酸化。PⅡ尿苷酸化的水平又取決于同一蛋白上的尿苷?；D(zhuǎn)移酶（它使PⅡ尿苷酸化）和去尿苷?；福ㄋ筆Ⅱ去尿苷酸化）兩種酶的相對活性。尿苷酰基轉(zhuǎn)移酶的活性可被α-酮戊二酸和ATP激活，但可被Gln和Pi抑制。去尿苷?；笇@些代謝物是不敏感的。這種代謝級聯(lián)反映E.coliGS對細(xì)胞氮素的需要極端靈敏。腺苷?；D(zhuǎn)移酶尿苷?；D(zhuǎn)移酶腺苷?；D(zhuǎn)移酶與一種叫做PⅡ的四聚體蛋白形成138

酶原的激活

酶原——生物體自身合成的、沒有活性的酶前體。2.酶原的激活——酶原在一定條件下，從無活性轉(zhuǎn)變成有活性的過程。3.酶原激活機(jī)制——切除某一肽段4.酶原激活的生理意義

（1）避免對細(xì)胞的自身消化（2）酶原到達(dá)特定部位才發(fā)揮作用酶原的激活酶原——生物體自身合成的、沒有活性的139胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶活性中心胰蛋白酶原的激活示意圖胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶活性中心胰蛋白酶原的激活示意圖140

從無活性的蛋白質(zhì)原或酶原轉(zhuǎn)變成有活性的蛋白質(zhì)或酶的過程即稱激活或活化。酶原的激活（胰凝乳蛋白酶原激活過程）從無活性的蛋白質(zhì)原或酶原轉(zhuǎn)變成有活性的蛋白質(zhì)或酶的141

激活的關(guān)鍵是選擇性地切斷了Arg15和Ile16之間的肽鍵，使Ile16游離。在中性條件下，Ile16的α﹣NH3＋能和Asp194的β﹣COO－通過靜電作用形成離子鍵，有助于Ser195和His57之間以及His57和

Asp102之間通過氫鍵形成一個“電荷轉(zhuǎn)接系統(tǒng)”，使Ser195的側(cè)鏈具有更強(qiáng)的親核性，有利于和底物進(jìn)行作用，于是就表現(xiàn)出胰凝乳蛋白酶的完整的催化功能。激活的關(guān)鍵是選擇性地切斷了Arg15和Ile142胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶胰蛋白酶對各種胰臟蛋白酶的激活作用胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶彈性蛋白酶原彈性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽腸激酶胰蛋白酶對各種胰臟蛋白酶的激活作143..144酶的多種分子形式——同工酶概念：存在于同一種屬或不同種屬，同一個體的不同組織或同一組織，同一細(xì)胞的不同亞單位，具有不同分子形式（結(jié)構(gòu)、分子量、等電點），但卻能催化相同的化學(xué)反應(yīng)的一組酶，稱之為同工酶（isoenzyme）。乳酸脫氫酶是研究得最多的同工酶。生物學(xué)功能：遺傳的標(biāo)志和個體發(fā)育及組織分化密切相關(guān)適應(yīng)不同組織或不同細(xì)胞器在代謝上的不同需要酶的多種分子形式——同工酶概念：存在于同一種屬或不同種屬，同145乳酸脫氫酶同工酶形成示意圖多肽亞基mRNA四聚體結(jié)構(gòu)基因a

b乳酸脫氫酶同工酶電泳圖譜+–H4MH3M2H2M3HM4點樣線乳酸脫氫酶同工酶形成示意圖多肽亞基mRNA四聚體結(jié)構(gòu)基因a146不同組織中LDH同工酶的電泳圖譜LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)

心肌腎肝骨骼肌血清-+原點不同組織中LDH同工酶的電泳圖譜LDH1(H4)LDH2(H147同工酶在各學(xué)科中的應(yīng)用(1)遺傳學(xué)和分類學(xué)：提供了一種精良的判別遺傳標(biāo)志的工具。(2)發(fā)育學(xué)：有效地標(biāo)志細(xì)胞類型及細(xì)胞在不同條件下的分化情況，以及個體發(fā)育和系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系。(3)生物化學(xué)和生理學(xué)：根據(jù)不同器官組織中同工酶的動力學(xué)、底物專一性、輔助因子專一性、酶的變構(gòu)性等性質(zhì)的差異，從而解釋它們代謝功能的差別。（4）醫(yī)學(xué)和臨床診斷：體內(nèi)同工酶的變化，可看作機(jī)體組織損傷，或遺傳缺陷，或腫瘤分化的的分子標(biāo)志。同工酶在各學(xué)科中的應(yīng)用(1)遺傳學(xué)和分類學(xué)：提供了一148

同一種酶的不同的同工酶在對底物的親和力和Vmax以及對產(chǎn)物所造成的抑制作用的敏感性等通常都是不同的，這反映出代謝上的需要。谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase,GS)是氮素代謝中的一種重要的酶，該酶催化依賴于ATP、由谷氨酸和NH4＋合成谷氨酰胺的反應(yīng)。在高等植物的葉片中，大多存在兩種不同類型的GS同工酶，即胞質(zhì)型的GS1和葉綠體型的GS2。這兩種同工酶在發(fā)育上以及在代謝中起著非重疊的作用。

同一種酶的不同的同工酶在對底物的親和力和Vmax以及149酶生物合成的調(diào)節(jié)——操縱子模型（原核生物）酶生物合成的調(diào)節(jié)150原核生物酶生物合成調(diào)節(jié)的必要性生活環(huán)境變化大、食物供應(yīng)無保證根據(jù)環(huán)境條件合成不同的蛋白質(zhì)代謝與環(huán)境變化適應(yīng)、維持生存與繁衍組成型酶適應(yīng)型酶原核生物酶生物合成調(diào)節(jié)的必要性生活環(huán)境變化大、食物供應(yīng)無保證151原核生物酶生物合成調(diào)節(jié)的總體原則●負(fù)責(zé)某個代謝過程的酶體系往往在需要時打開，而不需要時則關(guān)閉，構(gòu)成一個基因表達(dá)調(diào)控的“開－關(guān)”系統(tǒng)?！窕虮磉_(dá)？基因表達(dá)調(diào)控？★轉(zhuǎn)錄水平★mRNA加工成熟水平★翻譯水平★翻譯后水平？●營養(yǎng)狀況、環(huán)境因素、激素水平、發(fā)育階段原核生物（細(xì)菌）真核生物（動物）原核生物酶生物合成調(diào)節(jié)的總體原則●負(fù)責(zé)某個代謝過程的酶體系往152轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)至關(guān)重要1、代謝產(chǎn)物對酶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)