柱層析固相萃取和制備色譜課件

分析過程中各步驟花費的時間樣品前處理61%采樣6%分析6%數(shù)據(jù)處理27%分析過程中各步驟花費的時間樣品前處理61%1分離與富集分離（separation）的概念分離是一種假設(shè)狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，不同的物質(zhì)被分開了（isolation）。含有m種化學(xué)組分的混合物被分成m個常量范圍。把m種化學(xué)組分分成m種純的形式，并把它們置于m個獨立的容器中。利用混合物中各組分在物理或化學(xué)性質(zhì)上的差異，通過適當(dāng)?shù)难b置或方法，使各組分分配至不同的空間區(qū)域或者在不同的時間依次分配至同一空間區(qū)域的過程。分離與富集分離（separation）的概念2富集（concentration）的概念：在分離的過程中使對象物質(zhì)在某空間區(qū)域的濃度增加。從大量基體物質(zhì)中將欲測量的組分集中到一較小體積的溶液中，從而提高檢測靈敏度。

分離與富集的關(guān)系：富集需要借助分離的手段，在分析過程中分離與富集往往是同時實現(xiàn)的。富集與分離的目不同，富集只是分離的目的之一。富集（concentration）的概念：3柱層析法（柱色譜）柱色譜概述常用柱色譜介質(zhì)的分類柱色譜操作流程柱層析法（柱色譜）柱色譜概述4柱色譜---概述

吸附柱層析是利用吸附劑對混合試樣各組分的吸附力不同而使各組分分離。

當(dāng)采用溶劑洗脫時，發(fā)生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的過程，吸附力較強的組分，移動的距離小，后出柱；吸附力較弱的組分，移動的距離大，先出柱。柱色譜---概述吸附柱層析是利用吸附劑對混合試樣各組分5常用柱色譜介質(zhì)的分類無機物色譜介質(zhì)

氧化鋁、硅膠、活性炭、膨潤土、磷酸鈣(凝膠型和晶型)、氧化鈦和氫氧化鋅凝膠等。聚合物色譜介質(zhì)

瓊脂糖、葡聚糖、纖維素和聚丙烯酰胺等。

常用柱色譜介質(zhì)的分類無機物色譜介質(zhì)6柱色譜---吸附劑氧化鋁

市售的層析用氧化鋁有堿性、中性和酸性三種類型，粒度規(guī)格大多為100～150目。堿性氧化鋁（pH9-10）：適用于堿性物質(zhì)（如胺、生物堿）和對酸敏感的樣品（如縮醛、糖苷等），也適用于烴類、甾體化合物等中性物質(zhì)的分離。

酸性氧化鋁（pH3.5-4.5）：適用于酸性物質(zhì)如有機酸、氨基酸等以及色素和醛類化合物的分離。

中性氧化鋁（pH7-7.5）：適用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定的物質(zhì)如酯、內(nèi)酯等的分離，也可以用來分離弱的有機酸和堿等。

柱色譜---吸附劑氧化鋁市售的層析用氧化鋁有堿性、中性和7層析用硅膠為一多孔性物質(zhì)，分子中具有硅氧烷的交鏈結(jié)構(gòu)，同時在顆粒表面又有很多硅醇基。非極性和極性化合物，適用于芳香油、萜類、甾體、生物堿、強心甙、蒽醌類、酸性、酚性化合物、磷脂類、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成產(chǎn)品如有機金屬化合物等

吸附劑硅膠柱色譜----吸附劑硅膠層析用硅膠為一多孔性物質(zhì)，分子中具有硅氧烷的交鏈結(jié)構(gòu)，同時在8柱色譜操作流程—裝柱

硅膠浸泡于石油醚中，攪拌均勻后一次性倒入柱中預(yù)先加入溶劑柱色譜操作流程—裝柱預(yù)先加入溶劑9敲打均勻緊密柱色譜操作流程—裝柱敲打均勻緊密柱色譜操作流程—裝柱10柱色譜操作流程—拌樣樣品10mg溶于溶劑中，全溶加拌樣硅膠100－150目1:1-1.5攪拌均勻至干必要時旋蒸至干柱色譜操作流程—拌樣樣品10mg溶于溶劑中，全溶11柱色譜操作流程--拌樣溶解攪拌至干柱色譜操作流程--拌樣溶解12柱色譜操作流程--上樣均勻加到柱中柱色譜操作流程--上樣均勻加到柱中13柱色譜操作流程---洗脫與接收用不同比例的石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫每個極性洗脫3－5個保留體積每個保留體積接收10－20份餾分整個過程加低壓柱色譜操作流程---洗脫與接收用不同比例的石油醚和乙酸乙酯進(jìn)14柱層析固相萃取和制備色譜課件15柱色譜操作流程--濃縮濃縮方法溶劑濃縮自然揮干減壓濃縮凍干柱色譜操作流程--濃縮濃縮方法16柱色譜操作流程--薄層鑒定吸附劑：硅膠—CMC展開劑：C6H6—EtoAc(3:2或97：9)顯色劑：（1）氨蒸氣熏。（2）5%KOH噴霧柱色譜操作流程--薄層鑒定吸附劑：硅膠—CMC17制備色譜第一部分.制備HPLC概述第二部分.制備HPLC技術(shù)問題上樣條件的選擇循環(huán)色譜柱切換制備色譜第一部分.制備HPLC概述18制備HPLC概述制備色譜到底是什么？

結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進(jìn)樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器。

制備HPLC概述制備色譜到底是什么？19制備HPLC概述—

制備HPLC與分析HPLC比較

制備HPLC概述—

制備HPLC與分析HPLC比較

20制備HPLC概述—主要結(jié)構(gòu)單元輸液部:輸液泵分離部:制備柱檢測部:檢測器餾分部:餾分收集器制備HPLC概述—主要結(jié)構(gòu)單元輸液部:輸液泵21制備HPLC概述—對儀器的要求

制備泵的耐壓

制備HPLC系統(tǒng)因制備柱的填料很細(xì)，分離度好，同時反壓很高，整個系統(tǒng)對壓力很敏感，制備泵要求能在制定的恒流量下,克服100-150bars反壓色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷）

不影響收集物純度時的最大進(jìn)樣量；一般都超載進(jìn)樣。但進(jìn)樣量超過柱容量，柱效迅速下降，峰變寬。

超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。

制備HPLC概述—對儀器的要求

制備泵的耐壓22制備HPLC概述—分離效能

取決于分離速度、分辨率和上樣量。對某一個分離參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化常會影響到其他分離參數(shù)。分辨率速度載樣量增加洗脫液流速會降低分辨率，分辨率也會因上樣量過大而下降。但分辨能力并不總是制備HPLC首要考慮的因素，制備型HPLC應(yīng)首先具有經(jīng)濟(jì)、快速的生產(chǎn)所需產(chǎn)品的能力。制備HPLC概述—分離效能

取決于分離速度、分辨率和23在許多分離工作中，需要從大量的物質(zhì)中分離純化不足１％的所需成分，這種分離工作十分困難，在純化的最后階段常需使用１０μm或更小顆粒的高效填料。為獲得所需微量組分，可采用如下手段：制備型分離-半制備型分離-分析型分離-產(chǎn)物。

制備HPLC概述—分離效能在許多分離工作中，需要從大量的物質(zhì)中分離純化不足１％的所需成24制備HPLC有關(guān)技術(shù)問題—超量進(jìn)樣

大樣品量的純化方法分析系統(tǒng)的放大:

使用直徑更大的制備柱、更高的流速，根據(jù)色譜柱的長度增加進(jìn)樣量并保持樣品濃度不變，峰形尖銳而對稱。需大型的色譜柱和大量的溶劑來分離較少的樣品，不經(jīng)濟(jì)色譜柱超量載樣：相同的條件下超量進(jìn)樣濃縮法和體積超載法制備HPLC有關(guān)技術(shù)問題—超量進(jìn)樣大樣品量的純化方法分析25制備HPLC的首要問題是快速、高效的制備色譜純的產(chǎn)品??！分離度不是首要問題，色譜峰會比較難看！制備HPLC的首要問題是快速、高效的制備色譜純的產(chǎn)品??！分離26制備HPLC技術(shù)問題—組分的收集制備HPLC技術(shù)問題—組分的收集27制備HPLC技術(shù)問題—樣品的初步純化在利用制備HPLC最終純化步驟前做一些初步純化是提高效率降低成本的優(yōu)化措施.比如最終純化通常有一定的分離難度,又希望有足夠的收率,所以使用的儀器和填料可能是昂貴的.未經(jīng)預(yù)純化的樣品,尤其是天然產(chǎn)物,含有大量的可能在填料表面不可逆吸附的組分,直接進(jìn)樣,可導(dǎo)致昂貴的填料很快失效.此外,大量的雜質(zhì)降低對目標(biāo)產(chǎn)物分離度,因此限制了進(jìn)樣量和生產(chǎn)效率.同時分別用正反相色譜去除前后雜,比單用一種色譜得到目標(biāo)產(chǎn)物更簡單易行.總之,制備色譜尤其是工業(yè)色譜的目標(biāo)不僅是找到技術(shù)上可行的方法,而且要綜合考慮成本.制備HPLC技術(shù)問題—樣品的初步純化在利用制備HPLC最終純28上樣量主要根據(jù)柱子的大小、樣品的濃度和制備是否根據(jù)分析條件放大（例如制備柱是否還用分析用填料）根據(jù)內(nèi)徑計算：內(nèi)徑放大N倍，進(jìn)樣量大致可放大N平方倍（柱長一定時）制備HPLC技術(shù)問題—上樣量的選擇將分析色譜上的結(jié)果放大到制備色譜中：

上樣量的調(diào)整：

mp/ma=lp/la*r2p/r2a

L:柱長；m：進(jìn)樣量；r：色譜柱內(nèi)徑

p:制備柱；a：分析柱上樣量主要根據(jù)柱子的大小、樣品的濃度和制備是否根據(jù)分析條29制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇

從分析方法到制備方法的放大和方法的優(yōu)化需要三個步驟：1.優(yōu)化分析方法的選擇性。2.在分析柱上進(jìn)行超量載樣。3.放大到制備柱。

線性放大非線性放大制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇

從分析方法到制備方法30制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇線性放大

指柱直徑、長度（即柱體積）和流速等可以根據(jù)加樣量的增加情況進(jìn)行按比例線形放大。制備色譜中，最好的線形放大是在其他工藝條件不變的情況下，只改變柱子和流速，就可以放大生產(chǎn)，同時分離效果保持不變。成本比較大，同時也大大減少生產(chǎn)的產(chǎn)量和速度非線性放大制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇線性放大31制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇流速的調(diào)整梯度洗脫

分離效果取決于梯度的選擇，理論上梯度越小，分辨率越高。在分析上摸好條件，上制備柱往往還要降低一些洗脫液的濃度。柱子再生依次用水，甲醇，四氫呋喃，氯仿，甲醇來沖洗柱子，每種溶劑5-10個柱體積。制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇流速的調(diào)整32制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇1）制備的目的是在一次操作中盡可能地多上樣，所以，首先得在分析柱上實現(xiàn)超載，否則，分析柱分離得再漂亮，再在制備柱中線性放大時就因為成本不合理而被無情地否決。2）制備的目的是分離你所關(guān)心的組分，只要它能與其它雜質(zhì)分離的好就行了，所以不要希望在分析柱上先得到所有組分的基線分離，完全沒有必要！設(shè)計梯度時只需對目的物前后5-10%梯度的范圍進(jìn)行精細(xì)分離。制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇1）制備的目的是在一次操作中33制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇3）制備中常常因為超載而無法使目的物與鄰近雜質(zhì)間達(dá)到基線分離，可以采用分段收集的方法得到指定純度的目的物，要求越純，單次操作的得率也越低。4）制備中因為目的物來之不易，常常需要將純度不合格得目的物重新上柱循環(huán)，一般只需稀釋1-2倍就可以了。由于重新上柱是會增加成本的，所以超載的量要平衡單次操作的純品得量和效益與返工成本，以單位純品數(shù)量進(jìn)行成本核算，以優(yōu)化最佳上樣量。

制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇3）制備中常常因為超載而無法34固相萃取技術(shù)SPE一.SPE基本原理二.SPE法的優(yōu)點三.SPE裝置四.SPE柱填料類型五.SPE分析方法的建立六.SPE的應(yīng)用固相萃取技術(shù)SPE一.SPE基本原理35SPE----基本原理定義：利用固相吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫，達(dá)到分離和和富集的目的。分離：雜質(zhì)保留或目標(biāo)化合物保留。富集：目標(biāo)化合物保留，化合物極性與吸附劑極性越接近，保留越強。分離機理：利用雜質(zhì)或目標(biāo)化合物與樣品基體溶劑和吸附劑之間親和力的相對大小。SPE----基本原理定義：利用固相吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)36SPE----基本原理SPE也是一個柱色譜分離過程，分離機理、固定相和溶劑的選擇等方面與HPLC有許多相似之處。SPE柱的填料粒徑（>40μm）要比HPLC填料（3-10μm）大。由于短的柱床和大的粒徑，SPE柱效比HPLC色譜柱低得多。SPE只能分開保留性質(zhì)有很大差別的化合物。SPE柱是一次性使用。SPE----基本原理SPE也是一個柱色譜分離過程，分離機理37SPE---優(yōu)點許多分析方法中已經(jīng)替代了液-液萃取

節(jié)省分析時間

減少有機溶劑的使用，不污染環(huán)境高效、快速，可同時處理多個樣品

提高分析質(zhì)量，減少背景的干擾

提高了回收率固相萃取所需時間為液－液萃取的1/2，費用為液－液萃取的1/5。SPE---優(yōu)點許多分析方法中已經(jīng)替代了液-液萃取

固相萃38SPE柱最簡單的固相萃取裝置就是一根直徑為數(shù)毫米的小柱．由醫(yī)用聚丙烯管，多孔篩板，填料三部分組成。小柱可以是玻璃的，也可以是聚丙稀﹑聚乙烯﹑聚四氟乙烯等塑料的，還可以是不銹鋼制成的。

規(guī)格：100mg/1mL，200mg/3mL，300mg/3mL，1g/6mL，2g/12mL。。

SPE柱最簡單的固相萃取裝置就是一根直徑為數(shù)毫米的小39SPE柱的選擇被萃取樣品的質(zhì)量不超過柱中填料量的5%??！

SPE柱的選擇被萃取樣品的質(zhì)量不超過柱中填料量的5%?。?0SPE柱及其配套裝置自然淋洗-----簡易支架

加正壓-----注射器

加負(fù)壓-----真空裝置

SPE柱及其配套裝置自然淋洗-----簡易支架

加正壓41SPE常見填料類型

1.硅膠和鍵合硅膠2.高分子聚合物3.其他吸附型填料，如氧化鋁、硅藻土4.混合型或?qū)Ｓ弥盗蠸PE常見填料類型1.硅膠和鍵合硅膠42SPE柱常見填料類型—硅膠表面SPE柱常見填料類型—硅膠表面43SPE常見填料類型—鍵合相硅膠鍵合相硅膠，是在硅膠表面的硅醇基團(tuán)上鍵合不同的有機基團(tuán)，如烷基鏈或其它官能團(tuán)，如-OH、-C6H5、-NH2、-CN等。實際上吸附劑角色是由這些新接上的含官能基碳鏈來完成。SPE常見填料類型—鍵合相硅膠鍵合相硅膠，是在硅膠表面的44SPE柱常用填料類型按保留機理分為：正相：Silica、NH2、CN、Diol、Florisil（硅酸鎂載體）、Alumina反相：C18、C8、C2、環(huán)己烷基、苯基、CN離子交換：苯丙磺酸SCX、三甲基丙基胺

SAX、COOH、NH2混合型：SCR、SARSPE柱常用填料類型按保留機理分為：45SPE柱操作流程活化吸附劑進(jìn)樣洗滌洗脫SPE柱操作流程活化吸附劑進(jìn)樣洗滌洗脫46SPE方法的建立—柱預(yù)處理柱預(yù)處理目的:除去填料中可能存在的雜質(zhì)；使填料溶劑化，提高固相萃取的重現(xiàn)性。填料未經(jīng)預(yù)處理或者未被溶劑濕潤，能引起溶質(zhì)過早穿透，影響回收率。SPE方法的建立—柱預(yù)處理柱預(yù)處理目的:47SPE方法的建立—柱預(yù)處理

SPE預(yù)處理的方法正相類型固相萃取硅膠和極性吸附劑介質(zhì)，通常用樣品所在的有機溶劑來預(yù)處理。反相類型硅膠和非極性吸附劑介質(zhì),通常用水溶性有機溶劑如甲醇、乙腈、四氫呋喃和丙酮預(yù)處理,然后用水或緩沖溶液。離子交換填料將用于非極性有機溶劑中的樣品,其用3-5ml的去離子水或低濃度的離子緩沖溶液來預(yù)處理。

SPE方法的建立—柱預(yù)處理SPE預(yù)處理的方法48SPE方法的建立—加樣

預(yù)處理后，試樣溶液被加至并通過SPE柱。在該步驟，分析物及雜質(zhì)被保留在吸附劑上。

為了防止分析物的流失，試樣溶劑強度不宜過高。當(dāng)以反相機理萃取時，以水或緩沖劑作為溶劑，其中有機溶劑量不超過10%（V/V）。SPE方法的建立—加樣預(yù)處理后，試樣溶液被加至并通過S49SPE方法的建立—洗脫除去干擾雜質(zhì)-Wash用中等強度的溶劑，將干擾組分洗脫下來，同時保持分析物仍留在柱上。分析物的洗脫和收集-Elution這一步驟的目的是將分析物完全洗脫并收集在最小體積的組分中，同時使比分析物保留更強的雜質(zhì)盡可能多地仍留在SPE柱上洗脫溶劑的強度是至關(guān)重要的?。?！SPE方法的建立—洗脫除去干擾雜質(zhì)-Wash用中等強度的溶劑50SPE方法的建立—洗脫

從SPE的操作步驟可以看出，SPE的重現(xiàn)性受多個因素的影響，實驗條件是影響重現(xiàn)性的主要原因。提高重現(xiàn)性的方法有（1）使用替代物，加入適當(dāng)?shù)奶娲镒鰠⒈?；?）加入樣品量適當(dāng)，不超出穿透量和穿透體積；（3）選擇合適的洗滌液和洗脫液，確保分析物在操作中不流失。SPE方法的建立—洗脫從SPE的操作步驟可以看出，SP51SPE方法的建立—選擇合適的柱子正相萃取柱，填料為極性，適用于從非極性溶劑樣品中吸附極性化合物。反相萃取柱，填料為非極性，所萃取的目標(biāo)化合物通常是中等極性到非極性化合物。離子交換固相萃取，填料是帶有電荷的離子交換樹脂，所萃取的目標(biāo)化合物是帶有電荷的化合物

SPE方法的建立—選擇合適的柱子正相萃取柱，填料為極性，適用52SPE方法的建立—選擇合適的柱子

固相萃取中柱填料的選擇主要是根據(jù)目標(biāo)化合物的性質(zhì)和樣品溶劑性質(zhì)。要盡量選擇與目標(biāo)化合物極性相似的填料。例如：萃取碳?xì)浠衔铮ǚ菢O性）時，要采用反相固相萃?。ù藭r是非極性吸附劑）。當(dāng)目標(biāo)化合物極性適中時，正﹑反相固相萃取都可使用。樣品基體是強非極性溶劑，如正己烷，二氯甲烷等，一般要選用正相柱分離。樣品基體是強極性溶劑，如水和甲醇，乙腈及丙酮的混合液，要選用反相柱分離。SPE方法的建立—選擇合適的柱子固相萃取中柱填料的53SPE方法的建立—舉例說明水中多環(huán)芳烴（PAHS）的測定1.使用6ml固相萃取柱，柱內(nèi)填加500mgC18吸附劑；2.用5ml二氯甲烷活化,然后再用5ml甲醇和5ml水重復(fù)一次。3.加2ml異丙醇到20ml水樣中（10%異丙醇含量），混合后倒入固相萃取柱。4.用3ml甲醇/水（50/50）淋洗，抽真空30秒，流速不得大于10ml/min。5.再將固相萃取柱在1000~1500rpm離心機上離心5分鐘。用3ml二氯甲烷洗脫，收集洗脫液。6.將洗脫液在干燥氮氣流下濃縮到50~200μl，濃縮時樣品不要加熱，以免造成小分子多環(huán)芳烴的丟失。加二氯甲烷至總體積為200μl，進(jìn)樣20μl，進(jìn)行GC分析。

SPE方法的建立—舉例說明水中多環(huán)芳烴（PAHS）的測定54精品課件！精品課件！55精品課件！精品課件！56

TheEndThankYou!TheEnd57分析過程中各步驟花費的時間樣品前處理61%采樣6%分析6%數(shù)據(jù)處理27%分析過程中各步驟花費的時間樣品前處理61%58分離與富集分離（separation）的概念分離是一種假設(shè)狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，不同的物質(zhì)被分開了（isolation）。含有m種化學(xué)組分的混合物被分成m個常量范圍。把m種化學(xué)組分分成m種純的形式，并把它們置于m個獨立的容器中。利用混合物中各組分在物理或化學(xué)性質(zhì)上的差異，通過適當(dāng)?shù)难b置或方法，使各組分分配至不同的空間區(qū)域或者在不同的時間依次分配至同一空間區(qū)域的過程。分離與富集分離（separation）的概念59富集（concentration）的概念：在分離的過程中使對象物質(zhì)在某空間區(qū)域的濃度增加。從大量基體物質(zhì)中將欲測量的組分集中到一較小體積的溶液中，從而提高檢測靈敏度。

分離與富集的關(guān)系：富集需要借助分離的手段，在分析過程中分離與富集往往是同時實現(xiàn)的。富集與分離的目不同，富集只是分離的目的之一。富集（concentration）的概念：60柱層析法（柱色譜）柱色譜概述常用柱色譜介質(zhì)的分類柱色譜操作流程柱層析法（柱色譜）柱色譜概述61柱色譜---概述

吸附柱層析是利用吸附劑對混合試樣各組分的吸附力不同而使各組分分離。

當(dāng)采用溶劑洗脫時，發(fā)生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的過程，吸附力較強的組分，移動的距離小，后出柱；吸附力較弱的組分，移動的距離大，先出柱。柱色譜---概述吸附柱層析是利用吸附劑對混合試樣各組分62常用柱色譜介質(zhì)的分類無機物色譜介質(zhì)

氧化鋁、硅膠、活性炭、膨潤土、磷酸鈣(凝膠型和晶型)、氧化鈦和氫氧化鋅凝膠等。聚合物色譜介質(zhì)

瓊脂糖、葡聚糖、纖維素和聚丙烯酰胺等。

常用柱色譜介質(zhì)的分類無機物色譜介質(zhì)63柱色譜---吸附劑氧化鋁

市售的層析用氧化鋁有堿性、中性和酸性三種類型，粒度規(guī)格大多為100～150目。堿性氧化鋁（pH9-10）：適用于堿性物質(zhì)（如胺、生物堿）和對酸敏感的樣品（如縮醛、糖苷等），也適用于烴類、甾體化合物等中性物質(zhì)的分離。

酸性氧化鋁（pH3.5-4.5）：適用于酸性物質(zhì)如有機酸、氨基酸等以及色素和醛類化合物的分離。

中性氧化鋁（pH7-7.5）：適用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定的物質(zhì)如酯、內(nèi)酯等的分離，也可以用來分離弱的有機酸和堿等。

柱色譜---吸附劑氧化鋁市售的層析用氧化鋁有堿性、中性和64層析用硅膠為一多孔性物質(zhì)，分子中具有硅氧烷的交鏈結(jié)構(gòu)，同時在顆粒表面又有很多硅醇基。非極性和極性化合物，適用于芳香油、萜類、甾體、生物堿、強心甙、蒽醌類、酸性、酚性化合物、磷脂類、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成產(chǎn)品如有機金屬化合物等

吸附劑硅膠柱色譜----吸附劑硅膠層析用硅膠為一多孔性物質(zhì)，分子中具有硅氧烷的交鏈結(jié)構(gòu)，同時在65柱色譜操作流程—裝柱

硅膠浸泡于石油醚中，攪拌均勻后一次性倒入柱中預(yù)先加入溶劑柱色譜操作流程—裝柱預(yù)先加入溶劑66敲打均勻緊密柱色譜操作流程—裝柱敲打均勻緊密柱色譜操作流程—裝柱67柱色譜操作流程—拌樣樣品10mg溶于溶劑中，全溶加拌樣硅膠100－150目1:1-1.5攪拌均勻至干必要時旋蒸至干柱色譜操作流程—拌樣樣品10mg溶于溶劑中，全溶68柱色譜操作流程--拌樣溶解攪拌至干柱色譜操作流程--拌樣溶解69柱色譜操作流程--上樣均勻加到柱中柱色譜操作流程--上樣均勻加到柱中70柱色譜操作流程---洗脫與接收用不同比例的石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫每個極性洗脫3－5個保留體積每個保留體積接收10－20份餾分整個過程加低壓柱色譜操作流程---洗脫與接收用不同比例的石油醚和乙酸乙酯進(jìn)71柱層析固相萃取和制備色譜課件72柱色譜操作流程--濃縮濃縮方法溶劑濃縮自然揮干減壓濃縮凍干柱色譜操作流程--濃縮濃縮方法73柱色譜操作流程--薄層鑒定吸附劑：硅膠—CMC展開劑：C6H6—EtoAc(3:2或97：9)顯色劑：（1）氨蒸氣熏。（2）5%KOH噴霧柱色譜操作流程--薄層鑒定吸附劑：硅膠—CMC74制備色譜第一部分.制備HPLC概述第二部分.制備HPLC技術(shù)問題上樣條件的選擇循環(huán)色譜柱切換制備色譜第一部分.制備HPLC概述75制備HPLC概述制備色譜到底是什么？

結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進(jìn)樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器。

制備HPLC概述制備色譜到底是什么？76制備HPLC概述—

制備HPLC與分析HPLC比較

制備HPLC概述—

制備HPLC與分析HPLC比較

77制備HPLC概述—主要結(jié)構(gòu)單元輸液部:輸液泵分離部:制備柱檢測部:檢測器餾分部:餾分收集器制備HPLC概述—主要結(jié)構(gòu)單元輸液部:輸液泵78制備HPLC概述—對儀器的要求

制備泵的耐壓

制備HPLC系統(tǒng)因制備柱的填料很細(xì)，分離度好，同時反壓很高，整個系統(tǒng)對壓力很敏感，制備泵要求能在制定的恒流量下,克服100-150bars反壓色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷）

不影響收集物純度時的最大進(jìn)樣量；一般都超載進(jìn)樣。但進(jìn)樣量超過柱容量，柱效迅速下降，峰變寬。

超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。

制備HPLC概述—對儀器的要求

制備泵的耐壓79制備HPLC概述—分離效能

取決于分離速度、分辨率和上樣量。對某一個分離參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化常會影響到其他分離參數(shù)。分辨率速度載樣量增加洗脫液流速會降低分辨率，分辨率也會因上樣量過大而下降。但分辨能力并不總是制備HPLC首要考慮的因素，制備型HPLC應(yīng)首先具有經(jīng)濟(jì)、快速的生產(chǎn)所需產(chǎn)品的能力。制備HPLC概述—分離效能

取決于分離速度、分辨率和80在許多分離工作中，需要從大量的物質(zhì)中分離純化不足１％的所需成分，這種分離工作十分困難，在純化的最后階段常需使用１０μm或更小顆粒的高效填料。為獲得所需微量組分，可采用如下手段：制備型分離-半制備型分離-分析型分離-產(chǎn)物。

制備HPLC概述—分離效能在許多分離工作中，需要從大量的物質(zhì)中分離純化不足１％的所需成81制備HPLC有關(guān)技術(shù)問題—超量進(jìn)樣

大樣品量的純化方法分析系統(tǒng)的放大:

使用直徑更大的制備柱、更高的流速，根據(jù)色譜柱的長度增加進(jìn)樣量并保持樣品濃度不變，峰形尖銳而對稱。需大型的色譜柱和大量的溶劑來分離較少的樣品，不經(jīng)濟(jì)色譜柱超量載樣：相同的條件下超量進(jìn)樣濃縮法和體積超載法制備HPLC有關(guān)技術(shù)問題—超量進(jìn)樣大樣品量的純化方法分析82制備HPLC的首要問題是快速、高效的制備色譜純的產(chǎn)品?。》蛛x度不是首要問題，色譜峰會比較難看！制備HPLC的首要問題是快速、高效的制備色譜純的產(chǎn)品??！分離83制備HPLC技術(shù)問題—組分的收集制備HPLC技術(shù)問題—組分的收集84制備HPLC技術(shù)問題—樣品的初步純化在利用制備HPLC最終純化步驟前做一些初步純化是提高效率降低成本的優(yōu)化措施.比如最終純化通常有一定的分離難度,又希望有足夠的收率,所以使用的儀器和填料可能是昂貴的.未經(jīng)預(yù)純化的樣品,尤其是天然產(chǎn)物,含有大量的可能在填料表面不可逆吸附的組分,直接進(jìn)樣,可導(dǎo)致昂貴的填料很快失效.此外,大量的雜質(zhì)降低對目標(biāo)產(chǎn)物分離度,因此限制了進(jìn)樣量和生產(chǎn)效率.同時分別用正反相色譜去除前后雜,比單用一種色譜得到目標(biāo)產(chǎn)物更簡單易行.總之,制備色譜尤其是工業(yè)色譜的目標(biāo)不僅是找到技術(shù)上可行的方法,而且要綜合考慮成本.制備HPLC技術(shù)問題—樣品的初步純化在利用制備HPLC最終純85上樣量主要根據(jù)柱子的大小、樣品的濃度和制備是否根據(jù)分析條件放大（例如制備柱是否還用分析用填料）根據(jù)內(nèi)徑計算：內(nèi)徑放大N倍，進(jìn)樣量大致可放大N平方倍（柱長一定時）制備HPLC技術(shù)問題—上樣量的選擇將分析色譜上的結(jié)果放大到制備色譜中：

上樣量的調(diào)整：

mp/ma=lp/la*r2p/r2a

L:柱長；m：進(jìn)樣量；r：色譜柱內(nèi)徑

p:制備柱；a：分析柱上樣量主要根據(jù)柱子的大小、樣品的濃度和制備是否根據(jù)分析條86制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇

從分析方法到制備方法的放大和方法的優(yōu)化需要三個步驟：1.優(yōu)化分析方法的選擇性。2.在分析柱上進(jìn)行超量載樣。3.放大到制備柱。

線性放大非線性放大制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇

從分析方法到制備方法87制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇線性放大

指柱直徑、長度（即柱體積）和流速等可以根據(jù)加樣量的增加情況進(jìn)行按比例線形放大。制備色譜中，最好的線形放大是在其他工藝條件不變的情況下，只改變柱子和流速，就可以放大生產(chǎn)，同時分離效果保持不變。成本比較大，同時也大大減少生產(chǎn)的產(chǎn)量和速度非線性放大制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇線性放大88制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇流速的調(diào)整梯度洗脫

分離效果取決于梯度的選擇，理論上梯度越小，分辨率越高。在分析上摸好條件，上制備柱往往還要降低一些洗脫液的濃度。柱子再生依次用水，甲醇，四氫呋喃，氯仿，甲醇來沖洗柱子，每種溶劑5-10個柱體積。制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇流速的調(diào)整89制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇1）制備的目的是在一次操作中盡可能地多上樣，所以，首先得在分析柱上實現(xiàn)超載，否則，分析柱分離得再漂亮，再在制備柱中線性放大時就因為成本不合理而被無情地否決。2）制備的目的是分離你所關(guān)心的組分，只要它能與其它雜質(zhì)分離的好就行了，所以不要希望在分析柱上先得到所有組分的基線分離，完全沒有必要！設(shè)計梯度時只需對目的物前后5-10%梯度的范圍進(jìn)行精細(xì)分離。制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇1）制備的目的是在一次操作中90制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇3）制備中常常因為超載而無法使目的物與鄰近雜質(zhì)間達(dá)到基線分離，可以采用分段收集的方法得到指定純度的目的物，要求越純，單次操作的得率也越低。4）制備中因為目的物來之不易，常常需要將純度不合格得目的物重新上柱循環(huán)，一般只需稀釋1-2倍就可以了。由于重新上柱是會增加成本的，所以超載的量要平衡單次操作的純品得量和效益與返工成本，以單位純品數(shù)量進(jìn)行成本核算，以優(yōu)化最佳上樣量。

制備HPLC技術(shù)問題—條件的選擇3）制備中常常因為超載而無法91固相萃取技術(shù)SPE一.SPE基本原理二.SPE法的優(yōu)點三.SPE裝置四.SPE柱填料類型五.SPE分析方法的建立六.SPE的應(yīng)用固相萃取技術(shù)SPE一.SPE基本原理92SPE----基本原理定義：利用固相吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫，達(dá)到分離和和富集的目的。分離：雜質(zhì)保留或目標(biāo)化合物保留。富集：目標(biāo)化合物保留，化合物極性與吸附劑極性越接近，保留越強。分離機理：利用雜質(zhì)或目標(biāo)化合物與樣品基體溶劑和吸附劑之間親和力的相對大小。SPE----基本原理定義：利用固相吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)93SPE----基本原理SPE也是一個柱色譜分離過程，分離機理、固定相和溶劑的選擇等方面與HPLC有許多相似之處。SPE柱的填料粒徑（>40μm）要比HPLC填料（3-10μm）大。由于短的柱床和大的粒徑，SPE柱效比HPLC色譜柱低得多。SPE只能分開保留性質(zhì)有很大差別的化合物。SPE柱是一次性使用。SPE----基本原理SPE也是一個柱色譜分離過程，分離機理94SPE---優(yōu)點許多分析方法中已經(jīng)替代了液-液萃取

節(jié)省分析時間

減少有機溶劑的使用，不污染環(huán)境高效、快速，可同時處理多個樣品

提高分析質(zhì)量，減少背景的干擾

提高了回收率固相萃取所需時間為液－液萃取的1/2，費用為液－液萃取的1/5。SPE---優(yōu)點許多分析方法中已經(jīng)替代了液-液萃取

固相萃95SPE柱最簡單的固相萃取裝置就是一根直徑為數(shù)毫米的小柱．由醫(yī)用聚丙烯管，多孔篩板，填料三部分組成。小柱可以是玻璃的，也可以是聚丙稀﹑聚乙烯﹑聚四氟乙烯等塑料的，還可以是不銹鋼制成的。

規(guī)格：100mg/1mL，200mg/3mL，300mg/3mL，1g/6mL，2g/12mL。。

SPE柱最簡單的固相萃取裝置就是一根直徑為數(shù)毫米的小96SPE柱的選擇被萃取樣品的質(zhì)量不超過柱中填料量的5%??！

SPE柱的選擇被萃取樣品的質(zhì)量不超過柱中填料量的5%?。?7SPE柱及其配套裝置自然淋洗-----簡易支架

加正壓-----注射器

加負(fù)壓-----真空裝置

SPE柱及其配套裝置自然淋洗-----簡易支架

加正壓98SPE常見填料類型

1.硅膠和鍵合硅膠2.高分子聚合物3.其他吸附型填料，如氧化鋁、硅藻土4.混合型或?qū)Ｓ弥盗蠸PE常見填料類型1.硅膠和鍵合硅膠99SPE柱常見填料類型—硅膠表面SPE柱常見填料類型—硅膠表面100SPE常見填料類型—鍵合相硅膠鍵合相硅膠，是在硅膠表面的硅醇基團(tuán)上鍵合不同的有機基團(tuán)，如烷基鏈或其它官能團(tuán)，如-OH、-C6H5、-NH2、-CN等。實際上吸附劑角色是由這些新接上的含官能基碳鏈來完成。SPE常見填料類型—鍵合相硅膠鍵合相硅膠，是在硅膠表面的101SPE柱常用填料類型按保留機理分為：正相：Silica、NH2、CN、Diol、Florisil（硅酸鎂載體）、Alumina反相：C18、C8、C2、環(huán)己烷基、苯基、CN離子交換：苯丙磺酸SCX、三甲基丙基胺

SAX、COOH、NH2混合型：SCR、SARSPE柱常用填料類型按保留機理分為：102SPE柱操作流程活化吸附劑進(jìn)樣洗滌洗脫SPE柱操作流程活化吸附劑進(jìn)樣洗滌洗脫103SPE方法的建立—柱預(yù)處理柱預(yù)處理目的:除去填料中可能存在的雜質(zhì)；使填料溶劑化，提高固相萃取的重現(xiàn)性。填料未經(jīng)預(yù)處理或者未被溶劑濕潤，能引起溶質(zhì)過早穿透，影響回收率。SPE方法的建立—柱預(yù)處理柱預(yù)處理目的:104SPE方法的建立—柱預(yù)處理

SPE