細胞支原體污染

細胞支原體污染較長一段時間，一直覺得細胞培養(yǎng)有點問題，無緣無故的出現(xiàn)細胞代謝異常現(xiàn)象，培養(yǎng)基內(nèi)小渣渣變多，看不到細菌污染，看不到培養(yǎng)基渾濁，但可以感覺到細胞狀態(tài)不行，即使是單層沒有復(fù)層時也一樣，當(dāng)時考慮支原體污染，查了一些有關(guān)支原體污染的內(nèi)容，由于細胞狀態(tài)可以在換新鮮培養(yǎng)基的時候轉(zhuǎn)變過來，而自己的實驗也是需要在換培養(yǎng)基后進行，故而疏忽了可惡的支原體污染，今天決定解決這個問題。先查了一下資料：細胞支原體污染的一般情況及預(yù)防措施細胞株若受到細菌、真菌、支原體、或是特定病毒等之污染時，會嚴重的影響實驗的結(jié)果。而細菌、真菌等之微生物污染時，較易自培養(yǎng)基等的外觀變化察覺。但是若受到支原體之污染時，細胞之外觀較無明顯變化，但是其污染會造成細胞之生長速率緩慢、細胞產(chǎn)生病變之型態(tài)改變等等變化。各國細胞庫支原體污染的統(tǒng)計表，如下：國家受支原體污染(%)報告年度USA—FDA151993(past30years)USA-ATCC15-201992Japan—(IFO，RIKEN，JCR80~30~2219811987-19931998Germany—DSM361990-1994Argentina651987Israel321986-1993China951990造成支原體高污染率的原因1、支原體size0.1~0.8um，無細胞壁，可透過一般過濾膜(0.22-0.45um)2、支原體污染時，沒有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化3、過去缺乏簡單、快速且可靠的檢測方式4、細胞流通間缺乏品管，造成實驗室間的相互污染5、研究或操作人員忽略污染問題支原體污染的來源1、已受污染的細胞2、操作人員的疏失3、已受污染的培養(yǎng)基、血清4、操作環(huán)境不良、實驗器具不潔等由于支原體為人體口腔中之正常菌叢，實驗室之操作人員的污染亦可能為污染源，須十分注意。而萬一細胞已受支原體污染時，最佳的處理原則為將細胞高壓滅菌后丟棄，以免污染其它潔凈的細胞株。但是若是堅持要作去除支原體污染，有以下幾種方法，只不過結(jié)果會與原始的細胞特性有差異。去除支原體污染1、抗生素處理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasmaremovalagent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）2、Nucleicacidmetabolites：5-bromouracil，Hoechst33258，bromodeoxyuridine3、Anti-sera預(yù)防與控制方面可從以下各點加強注意：設(shè)備方面：1、使用已作支原體測試ok之細胞株2、于另一隔離之區(qū)域操作未知是否有支原體污染之細胞3、使用不添加抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞檢測方面：定期以標(biāo)準的支原體檢測方法檢測細胞、培養(yǎng)基、血清、ddH2O有否被支原體污染。實驗操作人員之無菌觀念與無菌操作技術(shù)之要求有關(guān)支原體污染的Q&A1、應(yīng)如何避免細胞污染？細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原體。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。2、如果細胞發(fā)生微生物污染時，應(yīng)如何處理？直接滅菌后丟棄之。3、支原體(mycoplasma)污染的細胞，是否能以肉眼觀察出異狀？不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。4、支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。5、偵測出細胞株有支原體污染時，該如何處理？直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。支原體之檢測相差顯微境檢測將細胞按種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察.支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間。此處缺一張400倍倒置相差顯微鏡圖片，準備在鑒定完成后用自己實驗中的圖片補充。據(jù)目前所見可以表現(xiàn)為培養(yǎng)液中可見一類黑、白色小蟲(可能是由于光源的問題)，鏡下快速運動，單個不成串。與布朗運動不同。電鏡檢測

掃描電鏡的支原體陽性檢出率高于透射電鏡，可能由于支原體多位于細胞表面的緣故。支原體污染電鏡照片，煎蛋狀（見圖1）和其他形狀（見圖2、圖3）圖1：支原體污染電鏡照片（X30k），可見煎蛋樣形狀。圖2：支原體污染電鏡照片（X30k），可見長條形、顆粒狀。

圖3：支原體污染電鏡照片（X12k），可見黑色形狀。直接培養(yǎng)法原理：直接培養(yǎng)支原體于培養(yǎng)基中，觀察其生長及菌落生成。特點：是目前最直接與靈敏之步驟，亦是用來評估其它偵測新步驟之標(biāo)準步驟。缺點：培養(yǎng)時間長，須3-5星期才能判斷。有些支原體不能在培養(yǎng)基培養(yǎng)出來（例如M.hyorhinis）。需同時培養(yǎng)支原體株作為正反應(yīng)對照組，可能會造成污染。材料：dextrose、L-arginineHCl、DifcoPPLObroth（Difco0554-17-1）horseserum、15%yeastextractsolution（autoclaved）、Bactoagar、無菌有蓋螺旋試管（autoclaved）、無菌培養(yǎng)皿（60x15mm）、L-玻棒、37°C培養(yǎng)箱、厭氧缸（厭氧缸長期培養(yǎng)易有污染，所以厭氧包應(yīng)用無菌水，每次打開厭氧缸后，用70%ethanol擦拭內(nèi)壁。）培養(yǎng)基制備:基本配方為DifcoPPLObroth(60%),馬血清(20%),15%yeastextreatsolution(10%),10xstocksolution(10%)o由于培養(yǎng)時間長，可加入penicillin(50u/ml)至10xstocksolution或加入thalliumacetate(1:2000)至培養(yǎng)基中以防止其它細菌污染。-10xstocksolution(1liter):稱取50gdextrose，10gL-arginineHCl，溶于1liter蒸餾水中。以0.22〃m無菌過濾膜過濾滅菌。分裝100ml至瓶中，保存于-70°C-液體培養(yǎng)基(1liter):稱取21g之DifcoPPLObroth,0.02gphenolred于600ml蒸餾水中，加熱攪拌溶解之。滅菌121C,15分鐘。待溫度降低至室溫后，于無菌操作臺內(nèi)加入200ml馬血清，100ml之15%yeastextractsolution，及100ml解源之10xstocksolution，混合均勻后，分裝至已滅菌之有蓋螺旋試管中，10ml/管。保存于4C，期限1個月。-固體培養(yǎng)基(1liter):稱取21g之DifcoPPLObroth，0.02gphenolred，15gBactoagar于600ml蒸餾水中，加熱溶解之。滅菌121C，15分鐘。放在50C水中浴中，待溫度降低至50C時，于無菌操作臺內(nèi)加入200ml馬血清，100ml之15%yeastextractsolution及100ml解凍之10xstocksolution，混合均勻后，倒入60x50啞之無菌培養(yǎng)皿中，5ml/培養(yǎng)皿。保存于4C，期限1個月。步驟：-取1ml細胞培養(yǎng)液或0.2ml細胞懸浮液，接種于液體培養(yǎng)基中，置于37C培養(yǎng)二周，觀察是否有混濁或是pH值改變之情形。培養(yǎng)一周及二周后，分別取0.1ml液體培養(yǎng)液涂在agarplate上，將其倒放置于37C厭氧箱培養(yǎng)，培養(yǎng)至少3星期，持續(xù)觀察是否有支原體之菌落出現(xiàn)。-另取1ml細胞培養(yǎng)液或0.2ml細胞懸浮液，涂抹在agarplate上，37C厭氧培養(yǎng)3星期，持續(xù)觀察是否支原體菌落出現(xiàn)。-另作正負反應(yīng)對照組，正反應(yīng)對照組為Acholeplasmalaidlawii(ATCC23206)與M.arginini(ATCC23838)。負反應(yīng)對照組為待測細胞之新鮮培養(yǎng)基。結(jié)果判讀：-支原體生長較慢，所以先在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)1~2周增殖后，再培養(yǎng)于agarplate上。需至少培養(yǎng)3星期后，才可斷定是否有支原體污染。所以整個測試需5個星期才知正確結(jié)果。?典型之支原體菌落類似荷包蛋(fried-egglike)，乃是由于支原體往agar下層生長所致，為圓形無色透明菌落，大小約10-55pm。但是并非所有的支原體皆為似荷包蛋菌落，有些是圓形菌落或是類似粘菌類形態(tài)(slime)。?若要區(qū)分細胞或是氣泡造成的類似菌落，可將其自agarplate上切下，重新培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一星期后再種入agarplate，若是細胞則不會生長。DNA螢光染色法?原理：利用螢光染劑(bisbenzimide,Hoechst33258)偵測支原體污染。此染劑會結(jié)合到DNA之Adenosine-Thymidine(A-T)rich區(qū)域，因為支原體之DNA中A-T含量占多數(shù)(55?80%)，所以可將其染色而偵測。被支原體污染之細胞經(jīng)染色后，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點，即為支原體之DNA，證明有支原體之污染。?測試步驟用間接步驟，將待測細胞懸浮液或細胞培養(yǎng)液接種于指示細胞培養(yǎng)液中(indicatorcell，例如Verocellor3T6cell)，然后培養(yǎng)指示細胞再作螢光染色。正負反應(yīng)對照組亦可以接種于indicatorcell內(nèi)作為對照。?待測細胞亦可作直接測試，但需為吸附型細胞，培養(yǎng)后直接作螢光染色。有些細胞易有螢光背景，而干擾結(jié)果判讀，則建議使用接種于指示細胞之步驟。?特點：簡單、經(jīng)濟與靈敏，廣泛使用，可作為例行之偵測步驟。可以偵測不易培養(yǎng)之支原體，例如M.hyorhinis，較直接培養(yǎng)法快，約一星期即可知道結(jié)果。?缺點：有時仍會有螢光背景，影響判讀。材料：?Hanks’balancedsaltsolutionwithoutNaHCO3orphenolred(HBSS,GibcoBRL21250-014)、bisbenzimide(HoechstNo.33258,SigmaB-2883)、thimerosol(SigmaT-5125)、0.1Mcitricacid、0.2Mdisodiumphosphate、glycerol、glacialaceticacid、methanol、strerileH2O、chamberslide(Nunc177380)或chamberslide替代物：35or60mmsterileplate內(nèi)放置無菌22x22mm蓋玻片(浸于酒精內(nèi)，使用前過火滅菌)，一般吸附型細胞均能吸附在蓋玻片上。染色后取出蓋玻片，細胞面朝下放在玻片上觀察。Indicatorcells:Vero(Africangreenmonkeykidney,ATCCCCL-81orCCRC60013)or3T6(mousefibroblast,ATCCCCL-96orCCRC60070)，細胞須先測試無污染。aMEMwith10%FBS(mediumforVerocell)配制試劑：?無菌HBSS:配制Hanks'balancedsaltsolution，以0.22um無菌過濾膜過濾滅菌。勿用高壓蒸汽滅菌。Hoechst33258stocksolution(100X):稱取5.0mgbisbenzimide和10.0mgthimersol溶于100ml無菌HBSS,置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至完全溶解后，以1ml分裝至1.5mlEP管中，貯存于-20°C。Hoechst33258workingreagent:取1mlHoechst33258stocksolution，加入sterile100mlHBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆，避免光照，貯存于4C。mountingsolution:22.2ml0.1Mcitricacid和27.8ml0.2MNa2HPO4加入于50mlglycerol中混合，以1NNaOH調(diào)整pH至5.5(pH很重要)，貯存于4C。?固定溶液(fixative):冰醋酸與甲醇以1：3之體積比例混合，使用前才配制。步驟：?培養(yǎng)Ver。細胞：Ver。細胞可作長期培養(yǎng)或制作多個冷凍保存管，測試前解凍培養(yǎng)。測試前一周培養(yǎng)Vero細胞。?在接種測試樣品前一日，以trypsin-EDTA溶液處理Vero細胞，制成細胞懸浮液，以1~2x10A4cells/ml培養(yǎng)于chamberslide中，每個well加入1ml細胞懸浮液，于37C,5%CO2培養(yǎng)。隔日確定生長良好后，即可接種測試樣品。?接種測試樣品：樣品種類：1ml待測之培養(yǎng)基，1ml待測細胞培養(yǎng)液(可將細胞稍微刮下)，0.05~0.1ml冷凍管之細胞懸浮液。?將測試樣品加入chamberslide內(nèi)，培養(yǎng)5天后，進行Hoechst33258的螢光染色觀察。?以AcholeplasmalaidlawiiATCC23206感染Vero細胞作為正反應(yīng)對照組(或是已感染支原體之細胞培養(yǎng)液或冷凍細胞液)，負反應(yīng)對照組為Verocell之新鮮培養(yǎng)基(aMEM+10%FBS)。DNA螢光染色檢測：?取出培養(yǎng)5日之Vero細胞，吸除培養(yǎng)液。于每個well中加入2ml1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，靜置10min后，吸除固定液。重復(fù)上述之步驟，風(fēng)干10分鐘。?于每個well中，加入1mlHoechst33258workingsolution，室溫下靜置30min。?吸掉Hoechst33258染液后，以無菌水洗滌3次，風(fēng)干后加入1滴的mountingsolution，并以蓋玻片覆蓋之。?以100x-400x螢光顯微鏡觀察。打開水銀光源10min后，以UV激發(fā)光束(330?380nm)之濾光鏡，觀察細胞核外是否有藍色螢光小點或是絲狀點之螢光物產(chǎn)生。結(jié)果判讀：若有支原體污染，在Vero細胞核外與細胞表面會出現(xiàn)藍色螢光小點或是絲狀點。其形狀一致，與細胞殘片染成之不規(guī)則點狀物不同。其螢光可維持數(shù)星期。見圖4,圖5.圖4(Negativeresult):螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細胞的細胞核，測試樣品沒有支原體的污染。圖5(PositiveResult):在Vero細胞核外與細胞表面會出現(xiàn)藍色螢光小點和絲狀點表示測試樣品有支原體的污染。再請看圖6,可以更清楚看到核外和胞膜上的小點及絲狀點。圖6：細胞核外與細胞表面的小點和絲狀點

圖7：支原體污染細胞的Hoechst33258染色結(jié)果有關(guān)細胞支原體污染的經(jīng)驗討論支原體是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。它不同于細胞，也不同于病毒。支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。支原體可在雞胚絨毛尿囊膜上或細胞培養(yǎng)中生長，營養(yǎng)要求比細菌高。細胞培養(yǎng)(特別是傳代細胞)被支原體污染是個世界性問題。在細胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達到63%，支原體感染發(fā)生后能改變細胞的DNA,RNA及蛋白表達，又不能通過可視法對其進行檢測，而且它對細胞的生長率影響較小，不易引起注意。國內(nèi)外研究表明，95%以上是以下四種支原體：口腔支原體(M.orale)、精氨酸支原體(M.arginini)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)和萊氏無膽甾原體(A.laidlawii)，為牛源性。以上是最常見的污染細胞培養(yǎng)的支原體菌群，但能夠污染細胞的支原體種類是很多的，國外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。組織細胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個方面來預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴格實驗操作；細胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌；在細胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理。支原體最突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細胞壁，一般來講，對作用于細胞壁生物合成的抗生素，如-內(nèi)酰胺類、萬古霉素等完全不敏感；對多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟哇諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學(xué)治療劑。InvivoGen公司研究開發(fā)的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體，不影