競爭放射分析放射免疫分析課件

競爭放射分析放射免疫分析

（RadioImmunoAssay,RIA）競爭性蛋白結(jié)合分析（CompetitiveProteinBindingAssay,CPBA）放射受體分析（RadioReceptorAssay,RRA）競爭放射分析放射免疫分析1優(yōu)點(diǎn)：

1、靈敏度高3、應(yīng)用范圍廣2、特異性強(qiáng)4、操作簡單缺點(diǎn)：

1、生物試劑，穩(wěn)定性受多因素影響2、靈敏度難以超過ag水平優(yōu)點(diǎn)：2競爭放射分析的原理*P+Q=（*P—Q）+*P+P=（P—Q）+P

*P

：標(biāo)記物P：未標(biāo)記物

Q：特異性結(jié)合劑競爭放射分析的原理*P+Q=（*P—Q）+*P3放射免疫分析原理*Ag+Ag+Ab=（*Ag—Ab）+（Ag—Ab）+*Ag+Ag

0MaxMin

條件：1、*Ag定量、足量2、Ab限量

*Ag>Ab

專用符號(hào)：1、T加入的*Ag的放射性計(jì)數(shù)2、B*Ag—Ab免疫復(fù)合物的放射性計(jì)數(shù)3、B0Ag=0時(shí)*Ag—Ab放射性計(jì)數(shù)4、F游離的*Ag的放射性計(jì)數(shù)T=B+F5、NSB非特異性結(jié)合產(chǎn)生的放射性計(jì)數(shù)6、結(jié)合率：B/T、B/B0、B/F放射免疫分析原理*Ag+Ag+Ab=（*Ag—Ab）+（4競爭放射分析的三種基本試劑標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)記物特異性結(jié)合劑競爭放射分析的三種基本試劑標(biāo)準(zhǔn)品5標(biāo)準(zhǔn)品化學(xué)結(jié)構(gòu)：

應(yīng)與被測物具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)化學(xué)純度：

純品化學(xué)度量：

準(zhǔn)確穩(wěn)定性：

保持生物活性不變標(biāo)準(zhǔn)品化學(xué)結(jié)構(gòu)：6標(biāo)記物要求：

1、較高的比活度2、生物活性與免疫活性：與標(biāo)記前一致3、放射化學(xué)純度：>95%4、穩(wěn)定性鑒定：

1、最大結(jié)合率2、標(biāo)準(zhǔn)曲線比較法3、稀釋曲線比較法標(biāo)記物要求：7特異性結(jié)合劑要求：

1、親和力2、高滴度3、特異性4、可長期保存特異性結(jié)合劑要求：8抗血清抗原動(dòng)物選擇佐劑免疫動(dòng)物、收獲鑒定抗體抗血清抗原9抗血清的鑒定親和力：

指抗體與抗原的結(jié)合能力，常用平衡親和常數(shù)KA表示。特異性：

抗體與相應(yīng)抗原的結(jié)合能力與其它類似物結(jié)合能力的比較，常用交叉反應(yīng)率（CrossReaction）表示交叉反應(yīng)率=Y/Z×100%Y：標(biāo)準(zhǔn)抗原取代50%結(jié)合率所對(duì)應(yīng)的濃度Z：類似物取代50%結(jié)合率所對(duì)應(yīng)的濃度交叉反應(yīng)率測定：以比正常生理濃度高100倍以上的類似物為測定物進(jìn)行測定，同時(shí)觀察置換0標(biāo)準(zhǔn)管50時(shí)所對(duì)應(yīng)的化學(xué)量滴度：

結(jié)合50%標(biāo)記抗原時(shí)血清的稀釋度抗血清的鑒定親和力：10單克隆抗體特點(diǎn)：特異性高抗體成分專一可反復(fù)制備制備：

1、免疫小鼠，制備脾細(xì)胞懸液2、選擇培養(yǎng)，用HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞3、檢測抗體4、克隆化單克隆抗體特點(diǎn)：制備：11其它特異性結(jié)合劑血漿結(jié)合球蛋白受體蛋白其它特異性結(jié)合劑12放射性標(biāo)記T4與不同特異性結(jié)合劑放射性標(biāo)記T4與不同特異性結(jié)合劑13結(jié)合與游離部分的分離分離方法的要求1、使結(jié)合部分與游離部分盡可能完全分開2、分得的成分便于作放射性操作3、分離效果不受外界干擾因素影響4、操作簡便、分離迅速、重復(fù)性好5、試劑來源廣泛、價(jià)廉易得結(jié)合與游離部分的分離分離方法的要求14常用的分離方法雙抗體法聚乙二聚法（PEG）活性炭吸附法鹽析法微孔濾膜法SPA法固相抗體法：塑料、纖維素、凝膠顆粒、多孔玻璃微球磁化顆粒法屏蔽計(jì)數(shù)法常用的分離方法雙抗體法15競爭放射分析方法的建立競爭放射分析方法的建立16反應(yīng)方式平衡法順序加樣法STAT法反應(yīng)方式平衡法17競爭放射分析放射免疫分析課件18試劑用量高含量樣品：靈敏度高，B0/T在30—50%低含量樣品：高劑量斜率好，B0/T在50—70%試劑用量高含量樣品：19反應(yīng)介質(zhì)pH和離子強(qiáng)度反應(yīng)體積添加劑樣品處理反應(yīng)介質(zhì)pH和離子強(qiáng)度20加樣程序?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)、配制試劑加未標(biāo)記物（標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品）加標(biāo)記物加特異性結(jié)合劑混勻、溫育加分離劑、分離B與F測量各管放射性計(jì)數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線由標(biāo)準(zhǔn)曲線反求出樣品濃度加樣程序?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)、21免疫放射分析

（ImmunoradiometricAssay,IRMA）免疫放射分析

（Immunoradiometri22IRMA的基本原理單位點(diǎn)系統(tǒng)：Ag+*Ab(Ag-*Ab)+*AbImAd-Ag+*AbImAd-Ag-*AbIRMA的基本原理單位點(diǎn)系統(tǒng)：23IRMA與RIA的主要區(qū)別IRMA與RIA的主要區(qū)別24IRMA的實(shí)驗(yàn)方法單位點(diǎn)系統(tǒng)雙位點(diǎn)系統(tǒng)標(biāo)記第三抗體法雙標(biāo)記抗體法IRMA的實(shí)驗(yàn)方法單位點(diǎn)系統(tǒng)25IRMA的特點(diǎn)標(biāo)記物的放射性活度高反應(yīng)達(dá)到平衡快比RIA更高的靈敏度比RIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍更寬比RIA的特異性更高方法穩(wěn)定性好目前僅能檢測大抗原IRMA的特點(diǎn)標(biāo)記物的放射性活度高26數(shù)據(jù)處理作圖法數(shù)學(xué)模型計(jì)算法數(shù)據(jù)處理27幾種數(shù)學(xué)模型線性內(nèi)插多項(xiàng)式函數(shù)樣條函數(shù)直線化模型Logistic模型四參數(shù)幾種數(shù)學(xué)模型線性內(nèi)插28標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)符合的條件B1/B0>85%，Bn/B0<15%標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍應(yīng)包括高、中、低三種劑量，正常值范圍應(yīng)在直線部分，應(yīng)包括臨床有意義的部分。曲線應(yīng)有一定的落差Bn/B1>3標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)符合的條件B1/B0>85%，Bn/B0<15%29標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)控參數(shù)B0%：30—70%，50%最佳NSB/T<5%，NSB/B0<10%有效劑量：ED25、ED50、ED75直線化后（擬合后）相關(guān)指數(shù)r>0.99標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)控參數(shù)B0%：30—70%，50%最佳30質(zhì)量控制近期目的：通過對(duì)測定結(jié)果的分析，對(duì)本次測定的質(zhì)量作出評(píng)價(jià)，并按照預(yù)定的要求決定結(jié)果的取舍遠(yuǎn)期目的：通過對(duì)不同批測定結(jié)果的比較，發(fā)現(xiàn)造成成誤差的原因，從而改進(jìn)實(shí)驗(yàn)條件或設(shè)計(jì)，以提高質(zhì)量質(zhì)量控制近期目的：31誤差及引起誤差的原因試劑加樣誤差分離誤差測量誤差數(shù)據(jù)處理樣品的采集與制備誤差及引起誤差的原因試劑32質(zhì)量控制指標(biāo)質(zhì)量控制指標(biāo)33精密度用同一實(shí)驗(yàn)方法多次檢測同一樣品所得結(jié)果的一致程度和重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)、效應(yīng)誤差關(guān)系、精密度圖精密度用同一實(shí)驗(yàn)方法多次檢測同一樣品所得結(jié)果的一致程度和34準(zhǔn)確度測定值與真值的符合程度用回收試驗(yàn)及平行實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度測定值與真值的符合程度35靈敏度測定方法的最小可測量確定方法：零標(biāo)準(zhǔn)管法、t值檢驗(yàn)法、粗略估計(jì)法靈敏度測定方法的最小可測量36特異性特異性決定于抗體常用交叉反應(yīng)率表示特異性特異性決定于抗體37穩(wěn)定性指批間的重復(fù)性常用指標(biāo)：B0%、NSB、ED、r等穩(wěn)定性指批間的重復(fù)性38臨床有效性與臨床的符合程度真陽性率、真陰性率、假陽性率、真陰性率臨床有效性與臨床的符合程度39內(nèi)部質(zhì)控批內(nèi)質(zhì)控：

批間質(zhì)控：內(nèi)部質(zhì)控批內(nèi)質(zhì)控：40外部質(zhì)控目的：提高各實(shí)驗(yàn)室之間檢測結(jié)果的可比性方法：由一個(gè)單位提供方案及外部質(zhì)量平價(jià)用的統(tǒng)一樣品，分發(fā)到各參加單位進(jìn)行檢測，然后將所得結(jié)果反饋于負(fù)責(zé)單位進(jìn)行整理分析、評(píng)價(jià)，用以促進(jìn)檢測質(zhì)量的提高和資料的可比性。外部質(zhì)控目的：41體外放射分析的誤差室內(nèi)質(zhì)控室間質(zhì)控批內(nèi)質(zhì)控批間質(zhì)控批內(nèi)精密度與偏聽偏信倚分析批間精密度與偏聽偏信倚分析尋找誤差產(chǎn)生的原因、改進(jìn)分析工作質(zhì)量對(duì)某種分析方法、試劑或試劑盒進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室的分析工作質(zhì)量進(jìn)行比較向主管部門提供信息，對(duì)方法、試劑（盒）進(jìn)行改進(jìn)，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的質(zhì)量控制工作體外放射分析的誤差室內(nèi)質(zhì)控室間質(zhì)控批內(nèi)質(zhì)控批間質(zhì)控批內(nèi)精密度42非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)酶標(biāo)記免疫分析法化學(xué)發(fā)光法時(shí)間分辨免疫熒光分析法基因芯片技術(shù)非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)酶標(biāo)記免疫分析法43競爭放射分析放射免疫分析

（RadioImmunoAssay,RIA）競爭性蛋白結(jié)合分析（CompetitiveProteinBindingAssay,CPBA）放射受體分析（RadioReceptorAssay,RRA）競爭放射分析放射免疫分析44優(yōu)點(diǎn)：

1、靈敏度高3、應(yīng)用范圍廣2、特異性強(qiáng)4、操作簡單缺點(diǎn)：

1、生物試劑，穩(wěn)定性受多因素影響2、靈敏度難以超過ag水平優(yōu)點(diǎn)：45競爭放射分析的原理*P+Q=（*P—Q）+*P+P=（P—Q）+P

*P

：標(biāo)記物P：未標(biāo)記物

Q：特異性結(jié)合劑競爭放射分析的原理*P+Q=（*P—Q）+*P46放射免疫分析原理*Ag+Ag+Ab=（*Ag—Ab）+（Ag—Ab）+*Ag+Ag

0MaxMin

條件：1、*Ag定量、足量2、Ab限量

*Ag>Ab

專用符號(hào)：1、T加入的*Ag的放射性計(jì)數(shù)2、B*Ag—Ab免疫復(fù)合物的放射性計(jì)數(shù)3、B0Ag=0時(shí)*Ag—Ab放射性計(jì)數(shù)4、F游離的*Ag的放射性計(jì)數(shù)T=B+F5、NSB非特異性結(jié)合產(chǎn)生的放射性計(jì)數(shù)6、結(jié)合率：B/T、B/B0、B/F放射免疫分析原理*Ag+Ag+Ab=（*Ag—Ab）+（47競爭放射分析的三種基本試劑標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)記物特異性結(jié)合劑競爭放射分析的三種基本試劑標(biāo)準(zhǔn)品48標(biāo)準(zhǔn)品化學(xué)結(jié)構(gòu)：

應(yīng)與被測物具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)化學(xué)純度：

純品化學(xué)度量：

準(zhǔn)確穩(wěn)定性：

保持生物活性不變標(biāo)準(zhǔn)品化學(xué)結(jié)構(gòu)：49標(biāo)記物要求：

1、較高的比活度2、生物活性與免疫活性：與標(biāo)記前一致3、放射化學(xué)純度：>95%4、穩(wěn)定性鑒定：

1、最大結(jié)合率2、標(biāo)準(zhǔn)曲線比較法3、稀釋曲線比較法標(biāo)記物要求：50特異性結(jié)合劑要求：

1、親和力2、高滴度3、特異性4、可長期保存特異性結(jié)合劑要求：51抗血清抗原動(dòng)物選擇佐劑免疫動(dòng)物、收獲鑒定抗體抗血清抗原52抗血清的鑒定親和力：

指抗體與抗原的結(jié)合能力，常用平衡親和常數(shù)KA表示。特異性：

抗體與相應(yīng)抗原的結(jié)合能力與其它類似物結(jié)合能力的比較，常用交叉反應(yīng)率（CrossReaction）表示交叉反應(yīng)率=Y/Z×100%Y：標(biāo)準(zhǔn)抗原取代50%結(jié)合率所對(duì)應(yīng)的濃度Z：類似物取代50%結(jié)合率所對(duì)應(yīng)的濃度交叉反應(yīng)率測定：以比正常生理濃度高100倍以上的類似物為測定物進(jìn)行測定，同時(shí)觀察置換0標(biāo)準(zhǔn)管50時(shí)所對(duì)應(yīng)的化學(xué)量滴度：

結(jié)合50%標(biāo)記抗原時(shí)血清的稀釋度抗血清的鑒定親和力：53單克隆抗體特點(diǎn)：特異性高抗體成分專一可反復(fù)制備制備：

1、免疫小鼠，制備脾細(xì)胞懸液2、選擇培養(yǎng)，用HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞3、檢測抗體4、克隆化單克隆抗體特點(diǎn)：制備：54其它特異性結(jié)合劑血漿結(jié)合球蛋白受體蛋白其它特異性結(jié)合劑55放射性標(biāo)記T4與不同特異性結(jié)合劑放射性標(biāo)記T4與不同特異性結(jié)合劑56結(jié)合與游離部分的分離分離方法的要求1、使結(jié)合部分與游離部分盡可能完全分開2、分得的成分便于作放射性操作3、分離效果不受外界干擾因素影響4、操作簡便、分離迅速、重復(fù)性好5、試劑來源廣泛、價(jià)廉易得結(jié)合與游離部分的分離分離方法的要求57常用的分離方法雙抗體法聚乙二聚法（PEG）活性炭吸附法鹽析法微孔濾膜法SPA法固相抗體法：塑料、纖維素、凝膠顆粒、多孔玻璃微球磁化顆粒法屏蔽計(jì)數(shù)法常用的分離方法雙抗體法58競爭放射分析方法的建立競爭放射分析方法的建立59反應(yīng)方式平衡法順序加樣法STAT法反應(yīng)方式平衡法60競爭放射分析放射免疫分析課件61試劑用量高含量樣品：靈敏度高，B0/T在30—50%低含量樣品：高劑量斜率好，B0/T在50—70%試劑用量高含量樣品：62反應(yīng)介質(zhì)pH和離子強(qiáng)度反應(yīng)體積添加劑樣品處理反應(yīng)介質(zhì)pH和離子強(qiáng)度63加樣程序?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)、配制試劑加未標(biāo)記物（標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品）加標(biāo)記物加特異性結(jié)合劑混勻、溫育加分離劑、分離B與F測量各管放射性計(jì)數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線由標(biāo)準(zhǔn)曲線反求出樣品濃度加樣程序?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)、64免疫放射分析

（ImmunoradiometricAssay,IRMA）免疫放射分析

（Immunoradiometri65IRMA的基本原理單位點(diǎn)系統(tǒng)：Ag+*Ab(Ag-*Ab)+*AbImAd-Ag+*AbImAd-Ag-*AbIRMA的基本原理單位點(diǎn)系統(tǒng)：66IRMA與RIA的主要區(qū)別IRMA與RIA的主要區(qū)別67IRMA的實(shí)驗(yàn)方法單位點(diǎn)系統(tǒng)雙位點(diǎn)系統(tǒng)標(biāo)記第三抗體法雙標(biāo)記抗體法IRMA的實(shí)驗(yàn)方法單位點(diǎn)系統(tǒng)68IRMA的特點(diǎn)標(biāo)記物的放射性活度高反應(yīng)達(dá)到平衡快比RIA更高的靈敏度比RIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍更寬比RIA的特異性更高方法穩(wěn)定性好目前僅能檢測大抗原IRMA的特點(diǎn)標(biāo)記物的放射性活度高69數(shù)據(jù)處理作圖法數(shù)學(xué)模型計(jì)算法數(shù)據(jù)處理70幾種數(shù)學(xué)模型線性內(nèi)插多項(xiàng)式函數(shù)樣條函數(shù)直線化模型Logistic模型四參數(shù)幾種數(shù)學(xué)模型線性內(nèi)插71標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)符合的條件B1/B0>85%，Bn/B0<15%標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍應(yīng)包括高、中、低三種劑量，正常值范圍應(yīng)在直線部分，應(yīng)包括臨床有意義的部分。曲線應(yīng)有一定的落差Bn/B1>3標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)符合的條件B1/B0>85%，Bn/B0<15%72標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)控參數(shù)B0%：30—70%，50%最佳NSB/T<5%，NSB/B0<10%有效劑量：ED25、ED50、ED75直線化后（擬合后）相關(guān)指數(shù)r>0.99標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)控參數(shù)B0%：30—70%，50%最佳73質(zhì)量控制近期目的：通過對(duì)測定結(jié)果的分析，對(duì)本次測定的質(zhì)量作出評(píng)價(jià)，并按照預(yù)定的要求決定結(jié)果的取舍遠(yuǎn)期目的：通過對(duì)不同批測定結(jié)果的比較，發(fā)現(xiàn)造成成誤差的原因，從而改進(jìn)實(shí)驗(yàn)條件或設(shè)計(jì)，以提高質(zhì)量質(zhì)量控制近期目的：74誤差及引起誤差的原因試劑加樣誤差分離誤差