第四章藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證課件

第四章

藥物的含量測定方法與驗(yàn)證Quantitativeanalysis

and

Validationofanalyticalmethod第四章

藥物的含量測定方法與驗(yàn)證Quantitative1第一節(jié)定量分析方法容量分析法光譜分析法色譜分析法第一節(jié)定量分析方法容量分析法2一容量分析法

化學(xué)計(jì)量點(diǎn)（等當(dāng)點(diǎn)）與滴定終點(diǎn)的概念及關(guān)系,滴定誤差：本法簡便、快速，準(zhǔn)確度高，設(shè)備簡單易得。滴定度：1ml滴定液相當(dāng)于被滴定物質(zhì)的質(zhì)量（mg）aA+bB產(chǎn)物T=MA×(a/b)×CBCB:滴定液的物質(zhì)的量濃度MA:被測物的摩爾質(zhì)量一容量分析法化學(xué)計(jì)量點(diǎn)（等當(dāng)點(diǎn)）與滴定終點(diǎn)的概念3例1.碘量法測定VitC含量T=0.05×176.12×1/1=8.806mg例2:溴酸鉀法測定異煙肼含量T=0.01667×137.14×3/2=3.429mg

例1.碘量法測定VitC含量4含量計(jì)算1.直接滴定：

原料：含量=×F×100%

F:C/C0(濃度系數(shù)）

T.V(mg)W

T·V·F×W片劑的標(biāo)示量%=———————×100%

W×標(biāo)示量含量52.間接滴定(1)置換滴定

待測物與化合物A反應(yīng),生成B,再用標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定B,.如Sb5++2I-Sb3++I2I2+2S2O32-2I-+S4O62-.

T=0.1×121.76×1/2=6.088mg

(2)剩余滴定：先加入定量過量的滴定液A使其與待測物反應(yīng)，然后用滴定液B回滴剩余的A.

含量%=(V0-V)TF100%W(V0-V)TF100%6例如:司可巴比妥鈉含量測定Br2＋2KI＝2KBr＋I(xiàn)2I2＋2Na2S2O3＝2NaI＋Na2S4O6

1ml溴滴定液（0.05mo1/L）或Na2S2O3滴定液（0.1mo1/L）相當(dāng)于13.01mgC12H17N2NaO3。例如:司可巴比妥鈉含量測定Br2＋2KI＝2KBr＋I(xiàn)2I27二光譜分析吸收光譜：UV-VIS,AAS,IR,NMR發(fā)射光譜：Flu,ICP，AES

二光譜分析8(一)UV-VIS.

1.Lambert-BeerLaw數(shù)學(xué)表達(dá)式：A=ELCE:①εC為1mol.L-1，L=1cm時(shí)的A②ΕC為1%(W/V).L=1cm時(shí)的Aε和Ε的關(guān)系：ε=×E

M10

1％1cm1％1cm1cm1％(一)UV-VIS.

1.Lambert-BeerLa92.特點(diǎn)物質(zhì)對(duì)200-760nm范圍內(nèi)電磁波吸收特性建立的分析方法。200-400nm為紫外,400-760nm為可見光;比色分析。靈敏度高，達(dá)10-7g/mL（與物質(zhì)的ε有關(guān)）.準(zhǔn)確度好，RSD:2%~5%儀器價(jià)格低，操作簡單，易于普及。應(yīng)用廣泛：定性：藥物鑒別，結(jié)構(gòu)鑒定定量：比較法，吸光系數(shù)法，導(dǎo)數(shù)法，雙入法2.特點(diǎn)物質(zhì)對(duì)200-760nm范圍內(nèi)電磁波吸收特性10UV-VIS.3.儀器校正和檢定

λ準(zhǔn)確度—顯示λ值與實(shí)際λ值間誤差，一般±0.5nm，常用Hg燈或氘燈的銳線光譜線校正。A準(zhǔn)確度：用K2Cr2O7的H2SO4液（0.005mol/L)檢查，由一定λ處的E值與ChP附錄的E值比較，RSD值在±1%以內(nèi)。雜散光：常以信號(hào)較弱的λ處（200nm,220nm,310nnm,340nm)規(guī)定物質(zhì)所含雜散光的強(qiáng)度百分比為指標(biāo)。λ重現(xiàn)性：狹縫（固定或可調(diào)）或譜帶寬度，分辨率（△λ）

UV-VIS.3.儀器校正和檢定λ準(zhǔn)確度—顯示11UV-VIS.4.溶劑

先檢查所用溶劑在測定λ附近是否符合要求，空氣為空白。1cm吸收池λ(nm)：220-240241-250251-300>300

A應(yīng)<0.400.200.100.05

具體選擇時(shí)還要注意溶劑的截止波長UV-VIS.4.溶劑先檢查所用溶劑在測12

配制一定濃度的供試液，以所用溶劑為空白，掃描其λmax應(yīng)在該品種規(guī)定λ±1nm內(nèi)，如維生素B1為246nm，若超出太多可能原因：①試樣真?zhèn)位蚣兌龋虎趦x器不準(zhǔn)。以A最大的λ作測定λ，測定時(shí)A讀數(shù)0.3-0.7誤差較小.UV-VIS.5.測定配制一定濃度的供試液，以所用溶劑為空白，掃描其131.對(duì)照比較法:含量%=Cr××100%(原料）2.E法:含量%=×100%(原料）3.計(jì)算分光光度法a.解線性方程組法，b.雙入測定法c.系數(shù)倍率法，d.導(dǎo)數(shù)法

AxArDW

Ax×DE×100×W1.對(duì)照比較法:AxDAx×D14片劑和注射劑標(biāo)示量%=

A×D

E·100·VS·標(biāo)示量×100%

A×D×W標(biāo)示量%=—————————————

×100%

E

×100×W樣×標(biāo)示量Ax×Cr×D×W標(biāo)示量%=————————×100%Ar×W樣×標(biāo)示量1%1cm1%1cm片劑和注射劑標(biāo)示量%=A×DE·100·VS·標(biāo)示量15(二)Flu法.1.原理和特點(diǎn)

原理：物質(zhì)UV-VIS光照射(Eex)激發(fā)(s1)，回復(fù)到基態(tài)(s0)釋放出輻射能(Eem)熒光，振動(dòng)馳豫等過程會(huì)消耗能量，E熒光<E激發(fā)光,所以λem>λex,在一定濃度內(nèi)測熒光,熒光強(qiáng)度∝C.特點(diǎn)：a.靈敏度比UV-VIS高100倍以上，所以干擾因素多，一般要做空白試驗(yàn)，分析用樣品量少。b.濃度大時(shí)能引起熒光熄滅所以適于低濃度分析。c.能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)有限所以應(yīng)用不及UV廣泛(二)Flu法.1.原理和特點(diǎn)16FLU法.

2.測定

熒光強(qiáng)度R=KC

Cx=×Cr(Cr對(duì)照液濃度）同一個(gè)空白,應(yīng)在0.5~2.0間單色器1吸收池單色器2光源檢測器入射狹縫出射狹縫λexλemRx-RoxRr-RorRx-RoxRr-RorFLU法.2.測定熒光強(qiáng)度R=KC單17三色譜分析

特點(diǎn)：靈敏度高；選擇性好；高速高效；應(yīng)用廣泛。分類：1.根據(jù)原理分2.根據(jù)分離方式分3.根據(jù)流動(dòng)相分三色譜分析特點(diǎn)：靈敏度高；選擇性好；高速高效18(一)HPLC.1.儀器

反相RP-HPLC,常用C18,，C8，做固定相，常用UV檢測器，柱溫為室溫或可調(diào)，進(jìn)樣幾μL~幾十μL，流動(dòng)相甲醇/水為主，其它間或使用緩沖液，CH3CN，離子對(duì)試劑等，恒組成或梯度。

ChP規(guī)定:柱固定相種類，流動(dòng)相組成，檢測器類型不得任意改變，其它條件可適當(dāng)改變。如柱內(nèi)徑長度，固定相牌號(hào)，粒度，流動(dòng)相速度，柱溫，進(jìn)樣量等。(一)HPLC.1.儀器反相RP-HPLC,常用C19HPLC.2.色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)1.n=5.54(tR/Wh/2)2=16(tR/W)22.R=，除另有規(guī)定外R應(yīng)＞1.53.重復(fù)性：對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積的RSD應(yīng)＜2%。

4.拖尾因子T=

除另有規(guī)定外峰高定量應(yīng)0.95~1.052(tR2-tR1)W1+W2

W0.05h2dHPLC.2.色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)1.n=5.54(tR/20HPLC.3.測定（用A或h定量）(1).內(nèi)標(biāo)加校正因子

對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)：進(jìn)樣f=

供試液+內(nèi)標(biāo)Cx=f1）一般兩次進(jìn)樣量相同2）兩次所加內(nèi)標(biāo)量相同

As/Cs(內(nèi)）Ar/Cr(外）

AxAs’/Cs’HPLC.3.測定（用A或h定量）(1).內(nèi)標(biāo)加校正因子A21HPLC.測定（用A或h定量）(2).外標(biāo)法：1)標(biāo)準(zhǔn)曲線法：回歸方程，相關(guān)系數(shù)，求Cx2)單點(diǎn)比較法：Cx=Cr含量%=×100%標(biāo)示量=×100%（片劑）AxAr

Cx×DWCX×D×WW×S標(biāo)HPLC.測定（用A或h定量）(2).外標(biāo)法：AxCx×22(二)GC.1.儀器

除另有規(guī)定外，載氣為氮?dú)?，柱為填充或毛?xì)管柱，進(jìn)樣口溫度高于柱溫30~50℃，以使樣品很快氣化，進(jìn)樣量0.1~幾L.檢測器：FID.溫度＞柱溫，并＞100℃以防水氣形成。柱溫：由待檢樣品定，固定或程序升溫。

1.檢測器種類2.固定液品種3.特殊指定柱材料不得改變其它可適當(dāng)改變，如柱內(nèi)徑，長度，載體粒度，固定液量，氮?dú)獾乃俣?，柱溫，進(jìn)樣量等。(二)GC.1.儀器除另有規(guī)定外，載氣為氮?dú)?3GC.2.測定(1)進(jìn)樣方式:快；(2)進(jìn)樣量小，易造成誤差所以盡量采用自動(dòng)進(jìn)樣。內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法：同HPLC含量%=f××100%標(biāo)準(zhǔn)加入法:Cx=(Ax×Cs)/As×DW

Cx(Ais/Ax)-1GC.2.測定(1)進(jìn)樣方式:快；(2)進(jìn)樣24第二節(jié).樣品分析的前處理方法

分析含金屬或鹵素,S,N,P,Se等元素的藥物時(shí)，需要時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步處理，使M或X成游離狀態(tài)，方可進(jìn)行下步分析測定，當(dāng)其連結(jié)位置不同時(shí)，其牢固程度各異，處理方法也各不相同。第二節(jié).樣品分析的前處理方法分析含金屬或鹵素,S25M直接與C以共價(jià)鍵連接→有機(jī)金屬藥物，連接牢固M不直接與C以共價(jià)鍵連接→含M有機(jī)藥物，連接不牢固X與芳環(huán)連接牢固：如泛影酸、碘番酸X與脂肪鏈連接不牢：如三氯叔丁醇

M直接與C以共價(jià)鍵連接26一.不經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法

（一）直接測定M不直接與C相連接，結(jié)合不牢固，在水液中電離，釋放出金屬離子，可直接測定。如：富馬酸亞鐵Fe2+,用Ce(SO4)2滴定，鄰二氮菲指示，達(dá)終點(diǎn)時(shí)，與鄰二氮菲結(jié)合的Fe2+氧化成Fe3+,—鄰二氮菲結(jié)合顯藍(lán)色。

葡萄糖酸鈣H2O/OH-1溶解,EDTA滴定.HCl△一.不經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法

（一）直接測定HCl△27（二）經(jīng)水解后測定一定條件下，加熱水解，使有機(jī)結(jié)合的X釋放出來，再用銀量法測定含量。Cl3C-CMe2OH·1/2H2O+4NaOHMe2CO+3NaCl+HCOONa+2H2O佛爾哈德法：NaCl+AgNO3(過）AgCl+NaNO3剩余AgNO3+NH4SCNAgSCN+NH4NO30.1mol/LNH4Fe(SO4)指示，終點(diǎn)Fe(SCN)2+紅T：1×0.1×186.5×1/3=6.22mg△（二）經(jīng)水解后測定一定條件下，加熱水解，使有機(jī)28

（三）經(jīng)[O][H]后測定

在堿性環(huán)境下，與[O]或[H]一起回流，使結(jié)合較牢的X成游離離子狀態(tài)，再測定如碘他拉酸測定:和NaOH/Zn作用,生成NaI,用AgNO3滴定,曙紅鈉指示終點(diǎn).T:0.16141/3=20.46（三）經(jīng)[O][H]29二.經(jīng)有機(jī)破壞后分析.

(一)濕法破壞一般采用強(qiáng)酸加熱消化處理：HNO3-HClO4適于生物樣品,金屬為高價(jià),不適于含N雜環(huán)。HNO3-H2SO4適于多數(shù)有機(jī)樣品,金屬為高價(jià),不適于含堿土金屬的藥物。H2SO4-K2SO4常于含As或Sb藥物，金屬為低價(jià)。1.相同條件下做空白試驗(yàn)校正。2.在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，注意加熱溫度及速度。3.取樣量依據(jù)待測物含量和測定方法靈敏度二.經(jīng)有機(jī)破壞后分析.

(一)濕法破壞一般采用強(qiáng)酸加熱消30含氮藥物測定:凱氏定氮1.樣品消解(有機(jī)破壞)含氮有機(jī)藥物NH4HSO4.2.蒸餾,吸收NH4HSO4+NaOHNH3+Na2SO4+H2O.吸收:NH3+H3BO3NH4BO2+H2O.3.滴定:

NH4BO2+H2SO4+H2O(NH4)2SO4+H3BO3

4.T:對(duì)含一個(gè)氮的樣品,1mLH2SO4(0.05mol/L)相當(dāng)于1.4mg的N.

H2SO4催化劑/含氮藥物測定:凱氏定氮1.樣品消解(有機(jī)破壞)H2S31例:撲米酮的含量測定（ChP2010)C12H14N2O2,M:218.26樣品0.2g凱氏定氮,H2SO4(0.05mol/L)滴定.T:對(duì)撲米酮:0.05218.261/1=10.91mg對(duì)氮:0.05141/1=0.7mg例:撲米酮的含量測定（ChP2010)C1232(二)干法破壞1.高溫灰化控制下灰化T及t灰化完全后用稀酸溶解應(yīng)無色并無不溶性黑渣。該法操作簡便，樣品處理量大，但不適于含揮發(fā)性金屬（As、Hg）的樣品處理。(二)干法破壞1.高溫灰化332.氧瓶燃燒.

(1)裝置燃燒瓶：硬質(zhì)、磨口。鉑絲：固定樣品包。無灰濾紙：包樣品。。吸收液：吸收燃燒產(chǎn)生的煙霧，如測Ι用NaOH/H2O,Br用H2O/NaOH/H2O2,S用H2O2/H2O,Se用AgNO32.氧瓶燃燒.(1)裝置34氧瓶燃燒.(2)操作

稱樣于無灰濾紙中包好，并固定在鉑絲下端，露出尾巴。在燃燒瓶中加入規(guī)定吸收液，快速通氧使之充滿瓶子。點(diǎn)燃濾紙包尾部，迅速放入燃燒瓶，按緊瓶塞，少量水封住瓶口。燃燒完后，振搖，使煙霧全部吸收于吸收液中。用適當(dāng)方法測定，同時(shí)做空白。氧瓶燃燒.(2)操作稱樣于無灰濾紙中包好，35第三節(jié)分析方法驗(yàn)證

用于驗(yàn)證測定方法的可靠性是否符合檢測要求，起草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或因生產(chǎn)工藝改變，制劑組分改變而對(duì)分析方法修訂時(shí)，都需要對(duì)分析方法進(jìn)行驗(yàn)證，涉及藥物鑒別，雜質(zhì)檢查，有效成分含量測定等。第三節(jié)分析方法驗(yàn)證用于驗(yàn)證測定方法的可靠性是36分析方法驗(yàn)證.一.準(zhǔn)確度

含義：測定結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，一般用回收率來表示。藥物分析：樣品測其藥物含量為P

加入已知量為A的藥物對(duì)照品測定混合液中藥物含量為M回收率=(M-P）/A

分析方法驗(yàn)證.一.準(zhǔn)確度含義：測定結(jié)果與真實(shí)37分析方法驗(yàn)證.準(zhǔn)確度生物藥物分析：應(yīng)加入高，中，低三種濃度，各3~5次，測定回收率制劑分析：在空白輔料中加藥物對(duì)照品，高，中，低濃度各3個(gè)P=100%，RSD一般應(yīng)在2%以內(nèi)。

測定量-本底量加入量分析方法驗(yàn)證.準(zhǔn)確度生物藥物分析：測定量-38分析方法驗(yàn)證.二.精密度

含義：同一均勻樣品，多次取樣測定所得結(jié)果之間接近程度。標(biāo)準(zhǔn)偏差S(SD)=相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=×100%,也叫變異系數(shù)CV.

SX∑(xi-x)2n-1分析方法驗(yàn)證.二.精密度含義：同一均勻樣品，39分析方法驗(yàn)證.精密度1.一般報(bào)道重復(fù)性：同一條件下，一個(gè)分析人員測定樣品結(jié)果的精密度（a.3個(gè)濃度各測3次；b.一個(gè)濃度測6次）2.中間精密度：同一實(shí)驗(yàn)室，不同分析人員測定結(jié)果精密度，制定新藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)一定要做。3.對(duì)生物樣品的分析還可測定日內(nèi)，日間精密度。4.重現(xiàn)性分析方法驗(yàn)證.精密度1.一般報(bào)道重復(fù)性：同一條件下，一個(gè)分析40分析方法驗(yàn)證.三.專屬性含義：分析方法抗干擾程度的量度。1.樣品情況2.分析項(xiàng)目3.分析方法分析方法驗(yàn)證.三.專屬性含義：分析方法抗干擾程度的量度。41分析方法驗(yàn)證.四.檢測限LOD

含義：樣品中被測物能檢出的最低濃度或量，反映檢測方法靈敏度和噪音大?。▋x器穩(wěn)定性）UV:測空白值，求其響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)值，以3S空做LOD估計(jì)值。HPLC,GC常用S/N=3時(shí)相應(yīng)濃度或進(jìn)樣量表示LOD.分析方法驗(yàn)證.四.檢測限LOD含義：樣品中被測物42分析方法驗(yàn)證.五.定量限·LOQ

一般以S/N=10表示，既要能檢出，又要保證一定準(zhǔn)確度，精密度。分析方法驗(yàn)證.五.定量限·LOQ一般以S/N=43分析方法驗(yàn)證.六.線性

在設(shè)定范圍內(nèi)，測定值與被測定濃度間呈正比關(guān)系的程度，濃度點(diǎn)5~7個(gè)，每個(gè)點(diǎn)測3次，求平均值，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸（回歸方程Y=a+bx),求相關(guān)系數(shù)rr接近±1，表示線性關(guān)系越好，（+表示正相關(guān)；－表示負(fù)相關(guān)）a越小越好分析方法驗(yàn)證.六.線性在設(shè)定范圍內(nèi)，測定值與被測44分析方法驗(yàn)證.七.范圍

具一定線性的測定方法適用的高低限濃度區(qū)間。分析方法驗(yàn)證.八.耐用性測定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測定結(jié)果不受影響的承受程度分析方法驗(yàn)證.七.范圍具一定線性的測定方法45

九.驗(yàn)證內(nèi)容的選擇表4-3九.驗(yàn)證內(nèi)容的選擇46小結(jié)1.分析樣品的前處理方法.特別是有機(jī)破壞的方法.2.樣品定量測定的方法.特別是計(jì)算方法.3.分析方法的驗(yàn)證.小結(jié)1.分析樣品的前處理方法.特別是有機(jī)破壞的方法.47第四章

藥物的含量測定方法與驗(yàn)證Quantitativeanalysis

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Validationofanalyticalmethod第四章

藥物的含量測定方法與驗(yàn)證Quantitative48第一節(jié)定量分析方法容量分析法光譜分析法色譜分析法第一節(jié)定量分析方法容量分析法49一容量分析法

化學(xué)計(jì)量點(diǎn)（等當(dāng)點(diǎn)）與滴定終點(diǎn)的概念及關(guān)系,滴定誤差：本法簡便、快速，準(zhǔn)確度高，設(shè)備簡單易得。滴定度：1ml滴定液相當(dāng)于被滴定物質(zhì)的質(zhì)量（mg）aA+bB產(chǎn)物T=MA×(a/b)×CBCB:滴定液的物質(zhì)的量濃度MA:被測物的摩爾質(zhì)量一容量分析法化學(xué)計(jì)量點(diǎn)（等當(dāng)點(diǎn)）與滴定終點(diǎn)的概念50例1.碘量法測定VitC含量T=0.05×176.12×1/1=8.806mg例2:溴酸鉀法測定異煙肼含量T=0.01667×137.14×3/2=3.429mg

例1.碘量法測定VitC含量51含量計(jì)算1.直接滴定：

原料：含量=×F×100%

F:C/C0(濃度系數(shù)）

T.V(mg)W

T·V·F×W片劑的標(biāo)示量%=———————×100%

W×標(biāo)示量含量522.間接滴定(1)置換滴定

待測物與化合物A反應(yīng),生成B,再用標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定B,.如Sb5++2I-Sb3++I2I2+2S2O32-2I-+S4O62-.

T=0.1×121.76×1/2=6.088mg

(2)剩余滴定：先加入定量過量的滴定液A使其與待測物反應(yīng)，然后用滴定液B回滴剩余的A.

含量%=(V0-V)TF100%W(V0-V)TF100%53例如:司可巴比妥鈉含量測定Br2＋2KI＝2KBr＋I(xiàn)2I2＋2Na2S2O3＝2NaI＋Na2S4O6

1ml溴滴定液（0.05mo1/L）或Na2S2O3滴定液（0.1mo1/L）相當(dāng)于13.01mgC12H17N2NaO3。例如:司可巴比妥鈉含量測定Br2＋2KI＝2KBr＋I(xiàn)2I254二光譜分析吸收光譜：UV-VIS,AAS,IR,NMR發(fā)射光譜：Flu,ICP，AES

二光譜分析55(一)UV-VIS.

1.Lambert-BeerLaw數(shù)學(xué)表達(dá)式：A=ELCE:①εC為1mol.L-1，L=1cm時(shí)的A②ΕC為1%(W/V).L=1cm時(shí)的Aε和Ε的關(guān)系：ε=×E

M10

1％1cm1％1cm1cm1％(一)UV-VIS.

1.Lambert-BeerLa562.特點(diǎn)物質(zhì)對(duì)200-760nm范圍內(nèi)電磁波吸收特性建立的分析方法。200-400nm為紫外,400-760nm為可見光;比色分析。靈敏度高，達(dá)10-7g/mL（與物質(zhì)的ε有關(guān)）.準(zhǔn)確度好，RSD:2%~5%儀器價(jià)格低，操作簡單，易于普及。應(yīng)用廣泛：定性：藥物鑒別，結(jié)構(gòu)鑒定定量：比較法，吸光系數(shù)法，導(dǎo)數(shù)法，雙入法2.特點(diǎn)物質(zhì)對(duì)200-760nm范圍內(nèi)電磁波吸收特性57UV-VIS.3.儀器校正和檢定

λ準(zhǔn)確度—顯示λ值與實(shí)際λ值間誤差，一般±0.5nm，常用Hg燈或氘燈的銳線光譜線校正。A準(zhǔn)確度：用K2Cr2O7的H2SO4液（0.005mol/L)檢查，由一定λ處的E值與ChP附錄的E值比較，RSD值在±1%以內(nèi)。雜散光：常以信號(hào)較弱的λ處（200nm,220nm,310nnm,340nm)規(guī)定物質(zhì)所含雜散光的強(qiáng)度百分比為指標(biāo)。λ重現(xiàn)性：狹縫（固定或可調(diào)）或譜帶寬度，分辨率（△λ）

UV-VIS.3.儀器校正和檢定λ準(zhǔn)確度—顯示58UV-VIS.4.溶劑

先檢查所用溶劑在測定λ附近是否符合要求，空氣為空白。1cm吸收池λ(nm)：220-240241-250251-300>300

A應(yīng)<0.400.200.100.05

具體選擇時(shí)還要注意溶劑的截止波長UV-VIS.4.溶劑先檢查所用溶劑在測59

配制一定濃度的供試液，以所用溶劑為空白，掃描其λmax應(yīng)在該品種規(guī)定λ±1nm內(nèi)，如維生素B1為246nm，若超出太多可能原因：①試樣真?zhèn)位蚣兌龋虎趦x器不準(zhǔn)。以A最大的λ作測定λ，測定時(shí)A讀數(shù)0.3-0.7誤差較小.UV-VIS.5.測定配制一定濃度的供試液，以所用溶劑為空白，掃描其601.對(duì)照比較法:含量%=Cr××100%(原料）2.E法:含量%=×100%(原料）3.計(jì)算分光光度法a.解線性方程組法，b.雙入測定法c.系數(shù)倍率法，d.導(dǎo)數(shù)法

AxArDW

Ax×DE×100×W1.對(duì)照比較法:AxDAx×D61片劑和注射劑標(biāo)示量%=

A×D

E·100·VS·標(biāo)示量×100%

A×D×W標(biāo)示量%=—————————————

×100%

E

×100×W樣×標(biāo)示量Ax×Cr×D×W標(biāo)示量%=————————×100%Ar×W樣×標(biāo)示量1%1cm1%1cm片劑和注射劑標(biāo)示量%=A×DE·100·VS·標(biāo)示量62(二)Flu法.1.原理和特點(diǎn)

原理：物質(zhì)UV-VIS光照射(Eex)激發(fā)(s1)，回復(fù)到基態(tài)(s0)釋放出輻射能(Eem)熒光，振動(dòng)馳豫等過程會(huì)消耗能量，E熒光<E激發(fā)光,所以λem>λex,在一定濃度內(nèi)測熒光,熒光強(qiáng)度∝C.特點(diǎn)：a.靈敏度比UV-VIS高100倍以上，所以干擾因素多，一般要做空白試驗(yàn)，分析用樣品量少。b.濃度大時(shí)能引起熒光熄滅所以適于低濃度分析。c.能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)有限所以應(yīng)用不及UV廣泛(二)Flu法.1.原理和特點(diǎn)63FLU法.

2.測定

熒光強(qiáng)度R=KC

Cx=×Cr(Cr對(duì)照液濃度）同一個(gè)空白,應(yīng)在0.5~2.0間單色器1吸收池單色器2光源檢測器入射狹縫出射狹縫λexλemRx-RoxRr-RorRx-RoxRr-RorFLU法.2.測定熒光強(qiáng)度R=KC單64三色譜分析

特點(diǎn)：靈敏度高；選擇性好；高速高效；應(yīng)用廣泛。分類：1.根據(jù)原理分2.根據(jù)分離方式分3.根據(jù)流動(dòng)相分三色譜分析特點(diǎn)：靈敏度高；選擇性好；高速高效65(一)HPLC.1.儀器

反相RP-HPLC,常用C18,，C8，做固定相，常用UV檢測器，柱溫為室溫或可調(diào)，進(jìn)樣幾μL~幾十μL，流動(dòng)相甲醇/水為主，其它間或使用緩沖液，CH3CN，離子對(duì)試劑等，恒組成或梯度。

ChP規(guī)定:柱固定相種類，流動(dòng)相組成，檢測器類型不得任意改變，其它條件可適當(dāng)改變。如柱內(nèi)徑長度，固定相牌號(hào)，粒度，流動(dòng)相速度，柱溫，進(jìn)樣量等。(一)HPLC.1.儀器反相RP-HPLC,常用C66HPLC.2.色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)1.n=5.54(tR/Wh/2)2=16(tR/W)22.R=，除另有規(guī)定外R應(yīng)＞1.53.重復(fù)性：對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積的RSD應(yīng)＜2%。

4.拖尾因子T=

除另有規(guī)定外峰高定量應(yīng)0.95~1.052(tR2-tR1)W1+W2

W0.05h2dHPLC.2.色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)1.n=5.54(tR/67HPLC.3.測定（用A或h定量）(1).內(nèi)標(biāo)加校正因子

對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)：進(jìn)樣f=

供試液+內(nèi)標(biāo)Cx=f1）一般兩次進(jìn)樣量相同2）兩次所加內(nèi)標(biāo)量相同

As/Cs(內(nèi)）Ar/Cr(外）

AxAs’/Cs’HPLC.3.測定（用A或h定量）(1).內(nèi)標(biāo)加校正因子A68HPLC.測定（用A或h定量）(2).外標(biāo)法：1)標(biāo)準(zhǔn)曲線法：回歸方程，相關(guān)系數(shù)，求Cx2)單點(diǎn)比較法：Cx=Cr含量%=×100%標(biāo)示量=×100%（片劑）AxAr

Cx×DWCX×D×WW×S標(biāo)HPLC.測定（用A或h定量）(2).外標(biāo)法：AxCx×69(二)GC.1.儀器

除另有規(guī)定外，載氣為氮?dú)猓鶠樘畛浠蛎?xì)管柱，進(jìn)樣口溫度高于柱溫30~50℃，以使樣品很快氣化，進(jìn)樣量0.1~幾L.檢測器：FID.溫度＞柱溫，并＞100℃以防水氣形成。柱溫：由待檢樣品定，固定或程序升溫。

1.檢測器種類2.固定液品種3.特殊指定柱材料不得改變其它可適當(dāng)改變，如柱內(nèi)徑，長度，載體粒度，固定液量，氮?dú)獾乃俣龋鶞?，進(jìn)樣量等。(二)GC.1.儀器除另有規(guī)定外，載氣為氮?dú)?0GC.2.測定(1)進(jìn)樣方式:快；(2)進(jìn)樣量小，易造成誤差所以盡量采用自動(dòng)進(jìn)樣。內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法：同HPLC含量%=f××100%標(biāo)準(zhǔn)加入法:Cx=(Ax×Cs)/As×DW

Cx(Ais/Ax)-1GC.2.測定(1)進(jìn)樣方式:快；(2)進(jìn)樣71第二節(jié).樣品分析的前處理方法

分析含金屬或鹵素,S,N,P,Se等元素的藥物時(shí)，需要時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步處理，使M或X成游離狀態(tài)，方可進(jìn)行下步分析測定，當(dāng)其連結(jié)位置不同時(shí)，其牢固程度各異，處理方法也各不相同。第二節(jié).樣品分析的前處理方法分析含金屬或鹵素,S72M直接與C以共價(jià)鍵連接→有機(jī)金屬藥物，連接牢固M不直接與C以共價(jià)鍵連接→含M有機(jī)藥物，連接不牢固X與芳環(huán)連接牢固：如泛影酸、碘番酸X與脂肪鏈連接不牢：如三氯叔丁醇

M直接與C以共價(jià)鍵連接73一.不經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法

（一）直接測定M不直接與C相連接，結(jié)合不牢固，在水液中電離，釋放出金屬離子，可直接測定。如：富馬酸亞鐵Fe2+,用Ce(SO4)2滴定，鄰二氮菲指示，達(dá)終點(diǎn)時(shí)，與鄰二氮菲結(jié)合的Fe2+氧化成Fe3+,—鄰二氮菲結(jié)合顯藍(lán)色。

葡萄糖酸鈣H2O/OH-1溶解,EDTA滴定.HCl△一.不經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法

（一）直接測定HCl△74（二）經(jīng)水解后測定一定條件下，加熱水解，使有機(jī)結(jié)合的X釋放出來，再用銀量法測定含量。Cl3C-CMe2OH·1/2H2O+4NaOHMe2CO+3NaCl+HCOONa+2H2O佛爾哈德法：NaCl+AgNO3(過）AgCl+NaNO3剩余AgNO3+NH4SCNAgSCN+NH4NO30.1mol/LNH4Fe(SO4)指示，終點(diǎn)Fe(SCN)2+紅T：1×0.1×186.5×1/3=6.22mg△（二）經(jīng)水解后測定一定條件下，加熱水解，使有機(jī)75

（三）經(jīng)[O][H]后測定

在堿性環(huán)境下，與[O]或[H]一起回流，使結(jié)合較牢的X成游離離子狀態(tài)，再測定如碘他拉酸測定:和NaOH/Zn作用,生成NaI,用AgNO3滴定,曙紅鈉指示終點(diǎn).T:0.16141/3=20.46（三）經(jīng)[O][H]76二.經(jīng)有機(jī)破壞后分析.

(一)濕法破壞一般采用強(qiáng)酸加熱消化處理：HNO3-HClO4適于生物樣品,金屬為高價(jià),不適于含N雜環(huán)。HNO3-H2SO4適于多數(shù)有機(jī)樣品,金屬為高價(jià),不適于含堿土金屬的藥物。H2SO4-K2SO4常于含As或Sb藥物，金屬為低價(jià)。1.相同條件下做空白試驗(yàn)校正。2.在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，注意加熱溫度及速度。3.取樣量依據(jù)待測物含量和測定方法靈敏度二.經(jīng)有機(jī)破壞后分析.

(一)濕法破壞一般采用強(qiáng)酸加熱消77含氮藥物測定:凱氏定氮1.樣品消解(有機(jī)破壞)含氮有機(jī)藥物NH4HSO4.2.蒸餾,吸收NH4HSO4+NaOHNH3+Na2SO4+H2O.吸收:NH3+H3BO3NH4BO2+H2O.3.滴定:

NH4BO2+H2SO4+H2O(NH4)2SO4+H3BO3

4.T:對(duì)含一個(gè)氮的樣品,1mLH2SO4(0.05mol/L)相當(dāng)于1.4mg的N.

H2SO4催化劑/含氮藥物測定:凱氏定氮1.樣品消解(有機(jī)破壞)H2S78例:撲米酮的含量測定（ChP2010)C12H14N2O2,M:218.26樣品0.2g凱氏定氮,H2SO4(0.05mol/L)滴定.T:對(duì)撲米酮:0.05218.261/1=10.91mg對(duì)氮:0.05141/1=0.7mg例:撲米酮的含量測定（ChP2010)C1279(二)干法破壞1.高溫灰化控制下灰化T及t灰化完全后用稀酸溶解應(yīng)無色并無不溶性黑渣。該法操作簡便，樣品處理量大，但不適于含揮發(fā)性金屬（As、Hg）的樣品處理。(二)干法破壞1.高溫灰化802.氧瓶燃燒.

(1)裝置燃燒瓶：硬質(zhì)、磨口。鉑絲：固定樣品包。無灰濾紙：包樣品。。吸收液：吸收燃燒產(chǎn)生的煙霧，如測Ι用NaOH/H2O,Br用H2O/NaOH/H2O2,S用H2O2/H2O,Se用AgNO32.氧瓶燃燒.(1)裝置81氧瓶燃燒.(2)操作

稱樣于無灰濾紙中包好，并固定在鉑絲下端，露出尾巴。在燃燒瓶中加入規(guī)定吸收液，快速通氧使之充滿瓶子。