啟動子調(diào)節(jié)纈氨酸代謝生產(chǎn)課件

谷氨酸棒桿菌利用啟動子活性調(diào)節(jié)機(jī)制，進(jìn)行L-纈氨酸生物合成代謝途徑的研究關(guān)鍵酶和編碼基因乙酰羥酸合酶(AHAS)——由ilvB和ilvN共同編碼乙酰羥酸同分異構(gòu)酶(AHAIR)——由ilvC編碼二羥酸脫水酶(DHAD)——由ilvD編碼支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(TA)——由ilvE編碼異丙基蘋果酸合酶（IPMS）——由leuA編碼泛酸酮羥甲基轉(zhuǎn)移酶（KPHMT）——由panB編碼丙酮酸：醌氧化還原酶（PQO）——由pqo編碼丙酮酸羧化酶（PC）——由Pyc編碼構(gòu)建谷氨酸棒狀桿菌L-纈氨酸生產(chǎn)菌株的多種基因操作方法：1、編碼蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因的缺失（TD）。2、panB基因的缺失導(dǎo)致泛酸營養(yǎng)缺陷型。3、aceE基因的缺失，這一基因是編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E1p亞基的。4、Pyc和pqo基因的缺失5、Pgi基因（磷酸葡萄糖異構(gòu)酶）的缺失，這一失活導(dǎo)致了NADPH供應(yīng)的增加6、編碼乙酰羥酸合酶調(diào)節(jié)亞基的基因ilvN的突變7、將ilvBNC操縱子和ilvD和（或）ilvE克隆在一個多拷貝質(zhì)粒載體中策略策略一：過量合成生物合成途徑中的限速酶。與生物合成途徑相關(guān)的限速酶的過量合成是代謝工程中最常用的策略之一。策略二：利用啟動子調(diào)節(jié)進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)控。這種策略避免了兩種極端，一種是酶基因的強(qiáng)烈過表達(dá)被限速，另一種是通過基因缺失導(dǎo)致的分支或競爭途徑的消除。通過利用各種優(yōu)勢構(gòu)建啟動子，一種途徑中的全部基因可以表達(dá)到確保通過該途徑最佳的流量水平。通過對與纈氨酸生物合成途徑及競爭途經(jīng)相關(guān)的染色體基因的啟動子進(jìn)行修飾，構(gòu)建纈氨酸生產(chǎn)菌株。實(shí)驗(yàn)方法1、DNA處理和轉(zhuǎn)化2、質(zhì)粒pKSAC45的構(gòu)建及其對于谷氨酸棒桿菌染色體基因操作的應(yīng)用3、啟動子克隆4、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶測定5、采用高效液相色譜法測定氨基酸濃度結(jié)果一、基礎(chǔ)L-纈氨酸生產(chǎn)菌株的最佳培養(yǎng)條件L-纈氨酸生產(chǎn)菌C.glutamicumATCC13032ilvNM13?panB?ilvA是L-異亮氨酸、泛酸的營養(yǎng)缺陷型、乳酸合成酶抗反饋抑制突變基因的攜帶者在提供各種濃度的異亮氨酸的CGXⅡ培養(yǎng)48h后纈氨酸的量（加有0.5μM的泛酸）使用0.4mM的L-異亮氨酸產(chǎn)出最高濃度的L-纈氨酸（95mM)0.6mML-isoleucine產(chǎn)出72mML-valine2mML-isoleucine產(chǎn)出27mML-valine二、ilvN,ilvD和

ilvE轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定ilvD的啟動子相比較最弱（0.014±0.01U每毫克蛋白質(zhì)),ilvE的啟動子中等(0.18±0.02U每毫克蛋白質(zhì))，ilvN的啟動子最強(qiáng)(0.6±0.09Umgprotein-1)。翻譯起始密碼子與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離在ilvN，ilvD，ilvE中分別為377，120，1bp。所研究基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)是通過引物延伸分析確定的。結(jié)果四、

ilvD，

ilvE,ilvA

和leuA基因突變啟動子的構(gòu)建及鑒定為了加強(qiáng)表達(dá)纈氨酸生物合成中的基因，我們誘變了ilvD和ilvE啟動子的-10區(qū)域以增加啟動子活性（啟動子上調(diào)突變）。攜帶突變啟動子的片段P-ilvD(1184bp）、P-ilvE（1108bp）與載體pKSAC45連接后分別導(dǎo)入到敲除了?P-ilvD或?P-ilvE基因的谷氨酸棒桿菌染色體上，此過程應(yīng)用的是基因置換技術(shù)。篩選出纈氨酸及異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變?yōu)樵B(yǎng)型的克隆體。將已驗(yàn)證的突變啟動子片段亞克隆在pET2上，然后通過測定在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)后得到的細(xì)胞提取物中CAT報(bào)告基因的活性以測定啟動子活性。（表5）篩選出突變啟動子P-ilvDM14和P-ilvDM7（比野生型P-ilvD高18和100倍）以及P-ilvEM6（比野生型P-ilvE高22倍）進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。結(jié)果四、

ilvD，

ilvE,ilvA

和leuA基因突變啟動子的構(gòu)建及鑒定在谷氨酸棒桿菌ilvNM13△panB△ilvA中敲除的等位基因ilvA被含P-ilvAM1CG的完整ilvA基因所取代。正如預(yù)期的那樣，由此產(chǎn)生的營養(yǎng)作用緩慢的谷氨酸棒桿菌ilvNM13?panBP-ilvAM1CG生長更加緩慢（與野生型菌株相比）。但是，不同于親本ilvA菌株，在添加或者不添加L-異亮氨酸的基本培養(yǎng)基中得出了相同的生物量（OD600=35）。異亮氨酸滲漏突變型和營養(yǎng)缺陷型菌株指數(shù)時期的增長率和在培養(yǎng)基中含有2mM異亮氨酸（分別μ=0.116±0.025和0.118±0.020h?1,）時是相似的，但滲漏缺陷型菌株在限制條件下（沒有異亮氨酸）比營養(yǎng)缺陷型在含0.4mM異亮氨酸（分別μ=0.063±0.018和0.087±0.022h?1）條件下生長緩慢。結(jié)果谷氨酸棒桿菌ilvNM13?panBP-ilvAM1CG比親本的營養(yǎng)缺陷型菌株產(chǎn)生L-纈氨酸多10%將啟動子P-ilvDM14、P-ilvDM7和P-ilvEM6分別引入并組合到谷氨酸棒桿菌ilvNM13菌株中。在所有情況下，甚至在培養(yǎng)基上沒有生產(chǎn)抑制時纈氨酸的產(chǎn)量都有所提高。啟動子P-ilvDM14和P-ilvEM6的結(jié)合或P-ilvDM7和P-ilvEM6的結(jié)合被引入谷氨酸棒桿菌ilvNM13?panBP-ilvAM1CG的染色體中。目的菌表現(xiàn)出20-30%產(chǎn)量的提高高效無質(zhì)粒的纈氨酸生產(chǎn)菌株C.glutamicumilvNM13ΔpanBP-ilvAM1CGP-ilvD