任務(wù)5：高效液相色譜法基本原理

任務(wù)5高效液相色譜法

分離原理

液相色譜分析法模塊之第一頁(yè)，共二十六頁(yè)。理解已知分析方法中采用的色譜類(lèi)型能夠正確解釋色譜分離過(guò)程能夠根據(jù)組分性質(zhì)選擇合適的色譜類(lèi)型

能力目標(biāo)第二頁(yè)，共二十六頁(yè)。

課程引入歸一化法測(cè)定分析純甲苯試劑的純度色譜柱:4.6mm×150mm固定相:十八烷基硅烷鍵合相(ODS)流動(dòng)相:水:甲醇=15:85外標(biāo)法測(cè)定葉酸片中葉酸的含量色譜柱:4.6mm×250mm固定相:十八烷基硅烷鍵合相(ODS)流動(dòng)相:磷酸二氫鈉緩沖液:甲醇=80:20第三頁(yè)，共二十六頁(yè)。

液相色譜是如何完成混合物的分離？

課程引入混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相之間會(huì)發(fā)生吸附、溶解或其他親和作用，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的遷移速度不同得到分離石油醚碳酸鈣顆粒色素玻璃柱第四頁(yè)，共二十六頁(yè)。液液分配色譜法實(shí)例：歸一化法測(cè)定分析純甲苯試劑的純度色譜柱:4.6mm×150mm固定相:十八烷基硅烷鍵合相(ODS)流動(dòng)相:水:甲醇=15:85

液液分配色譜第五頁(yè)，共二十六頁(yè)。液液分配色譜法固定相將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的有機(jī)鍵合層如C18（十八烷基硅烷）、C8（辛烷基）、氨基鍵合硅膠固定相類(lèi)型極性固定相：正相色譜以極性有機(jī)基團(tuán)如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等鍵合在硅膠表面制成的非極性固定相：反相色譜反相色譜法最常用的固定相是C18、C8和苯基鍵合相的填料，在分離極性很大的化合物時(shí)，也可以采用氨基、氰基等極性基團(tuán)鍵合固定相。

液液分配色譜第六頁(yè)，共二十六頁(yè)。使用條件為控制樣品在分析過(guò)程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值，但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8）。太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。

鍵合相色譜—固定相特點(diǎn)使用過(guò)程中不流失均一性和化學(xué)穩(wěn)定性好重現(xiàn)性好分離效率高適于梯度洗脫傳質(zhì)阻抗小第七頁(yè)，共二十六頁(yè)。

反相色譜常見(jiàn)流動(dòng)相流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度順序：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<丙醇<二氯甲烷（與水不混溶）若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流動(dòng)相，可用于分離極性化合物若采用水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相，則可分離一些易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類(lèi)等常見(jiàn)固定相反相色譜法最常用的固定相是C18、C8和苯基鍵合相的填料，在分離極性很大的化合物時(shí)，也可以采用氨基、氰基等極性基團(tuán)鍵合固定相。

鍵合相色譜—流動(dòng)相第八頁(yè)，共二十六頁(yè)。

疏溶劑理論：當(dāng)溶質(zhì)分子進(jìn)入極性流動(dòng)相后,即占據(jù)流動(dòng)相中相應(yīng)的空間，而排擠一部分溶劑分子；當(dāng)溶質(zhì)分子被流動(dòng)相推動(dòng)和固定相接觸時(shí)，溶質(zhì)分子的非極性部分或非極性分子）會(huì)將非極性固定相上附著的溶劑膜排擠開(kāi)，直接和非極性固定相上的烷基官能團(tuán)相結(jié)合（吸附）形成締合物，構(gòu)成單分子吸附層；當(dāng)流動(dòng)相極性減小時(shí)，這種疏溶劑斥力下降，會(huì)發(fā)生解締，并把溶質(zhì)分子釋放而被洗脫下來(lái)反相色譜法的分離機(jī)理1第九頁(yè)，共二十六頁(yè)。

影響溶質(zhì)保留的三個(gè)主要因素：溶質(zhì)分子中非極性部分的總表面積溶質(zhì)和固定相接觸的總表面積愈大，保留值愈大，所以溶質(zhì)的極性愈弱，疏水性越強(qiáng)，保留值越大。鍵合相上的烷基總面積烷基鍵合固定相的作用在于提供非極性的作用表面。隨著碳鏈的加長(zhǎng)，烷基的疏水特性增強(qiáng)，溶質(zhì)的保留值也隨烷基碳鏈長(zhǎng)度的增加而增大。流動(dòng)相的表面張力流動(dòng)相的表面張力愈大，介電常數(shù)愈大，極性亦愈強(qiáng)；溶質(zhì)和烷基鍵合相的締合作用愈強(qiáng)，流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度弱，導(dǎo)致溶質(zhì)的保留值大。反相鍵合相色譜法的分離機(jī)理2第十頁(yè)，共二十六頁(yè)。時(shí)間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯例：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長(zhǎng)，分離效果越好。分離機(jī)理實(shí)例第十一頁(yè)，共二十六頁(yè)。正相色譜法反相色譜法1.極性固定相

聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相2.相對(duì)非極性流動(dòng)相

正已烷、環(huán)已烷

3.極性調(diào)節(jié)劑

乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷4.分離中等極性和極性較強(qiáng)化合物.

酚類(lèi)、胺類(lèi)、羰基類(lèi)及氨基酸類(lèi)

5.組分流出順序

極性小先洗出1.非極性固定相

C18（簡(jiǎn)稱(chēng)ODS）、C82.極性流動(dòng)相

水或緩沖液3.極性調(diào)節(jié)劑

甲醇、乙腈、四氫呋喃4.分離非極性和極性較弱化合物

占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右5.組分流出順序

極性大先洗出

液液分配色譜第十二頁(yè)，共二十六頁(yè)。其他類(lèi)型色譜法按分離機(jī)制分類(lèi)：液固吸附色譜法離子色譜法凝膠色譜法（分子排阻色譜法）

（空間排阻色譜法）其他類(lèi)型色譜法第十三頁(yè)，共二十六頁(yè)。

氯化噻吩嗪四種異構(gòu)體的分離色譜圖

氯化噻吩嗪四種異構(gòu)體的分離異構(gòu)體具有不同的空間排列方式，因此吸附劑對(duì)它們的吸附能力有所不同，從而得到了分離。

液固吸附色譜實(shí)例第十四頁(yè)，共二十六頁(yè)。液固吸附色譜法固定相：吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5-10μm流動(dòng)相：有機(jī)溶劑適用于分離分子量200-1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物的分離，常用于分離同分異構(gòu)體。

液固吸附色譜各組分的出峰順序極性較小組分，吸附力較弱，容易解吸，先流出。極性較大組分滯留作用大，后流出。飽和烴<烯<芳烴<醚<醛酮<酸第十五頁(yè)，共二十六頁(yè)。吸附脫附再吸附再脫附

…分離過(guò)程是一個(gè)吸附－脫附的平衡過(guò)程。

液固吸附色譜法分離機(jī)理

液固吸附色譜分離機(jī)理第十六頁(yè)，共二十六頁(yè)。離子交換色譜法油田水質(zhì)中的陰離子分析固定相：薄殼型陰離子交換樹(shù)脂(3×250mm)流動(dòng)相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1

Na2CO3

離子色譜法實(shí)例第十七頁(yè)，共二十六頁(yè)。離子交換色譜法固定相:離子交換樹(shù)脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基陽(yáng)離子交換樹(shù)脂在表面未端芳環(huán)上接上季胺基陰離子交換樹(shù)脂流動(dòng)相：電解質(zhì)溶液、有機(jī)弱酸或有機(jī)弱酸鹽溶液

離子交換色譜法ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－第十八頁(yè)，共二十六頁(yè)。離子交換色譜法分離原理樹(shù)脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換而分離。應(yīng)用離子交換色譜法主要用于分析陰，陽(yáng)離子，凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來(lái)進(jìn)行分離。分析物質(zhì)有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。

離子交換色譜法分離機(jī)理第十九頁(yè)，共二十六頁(yè)。凝膠色譜（分子排阻色譜法）油田用驅(qū)油劑聚丙烯酰胺損失量的測(cè)定？色譜柱：150mm×46mm

固定相：二醇基鍵合相，孔徑200A，粒徑5um

流動(dòng)相:甲醇/0.05mol/LNaH2PO4

凝膠色譜法實(shí)例1-聚丙烯酰胺2-原油+石油磺酸鹽+氯化鈉第二十頁(yè)，共二十六頁(yè)。以凝膠(gel)為固定相。它類(lèi)似于分子篩，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長(zhǎng)；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。凝膠色譜分離示意圖

凝膠色譜：（分子排阻色譜法）分離機(jī)理

凝膠色譜分離機(jī)理第二十一頁(yè)，共二十六頁(yè)。正確地選擇色譜類(lèi)型盡可能多的了解樣品性質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)極性和穩(wěn)定程度水中和有機(jī)溶劑中溶解度相對(duì)分子質(zhì)量的大小熟悉各種色譜類(lèi)型主要特點(diǎn)應(yīng)用范圍色譜類(lèi)型選擇第二十二頁(yè)，共二十六頁(yè)。色譜類(lèi)型選擇第二十三頁(yè)，共二十六頁(yè)。液相色譜法實(shí)例按固定相與流動(dòng)相相對(duì)極性的不同，液液分配色譜可分為哪兩類(lèi)方法？現(xiàn)在有A、B兩物質(zhì)，極性A＞B，問(wèn)在兩種液液分配色譜上的出峰順序如何？分離下述化合物，宜選用何種色譜方法？（A）聚苯乙烯相對(duì)分子量分布（B）多環(huán)芳烴（C）氨基酸（D）Ca2+，Ba2+，Mg2+第二十四頁(yè)，共二十六頁(yè)。下次課程問(wèn)題三種組分苯、萘、聯(lián)苯，如何選擇一個(gè)最佳的色譜分離條件，既能達(dá)到良好的分離度，又能在短時(shí)間內(nèi)完成分析任務(wù)？第二十五頁(yè)，共二十六頁(yè)。內(nèi)容梗概任務(wù)5高效液相色譜法

分離原理。固定相:十八烷基硅烷鍵合相(ODS)。流動(dòng)相:水:甲醇=15:85。流動(dòng)相:磷酸二氫鈉緩沖液:甲醇=80:20?；旌衔镏懈鹘M分在固定相和流動(dòng)相之間會(huì)發(fā)生吸附、溶解或其他親和作用，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的遷移速度不同得到分離。太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度順序：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<丙醇<二氯甲烷（與水不混溶）。若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流動(dòng)相，可用于分離極性化合物。當(dāng)溶質(zhì)分子進(jìn)入極性流動(dòng)相后,即占據(jù)流動(dòng)相中相應(yīng)的空間，而排擠一部分溶劑分子。當(dāng)流動(dòng)相極性減小時(shí)，這種疏溶劑斥力下降，會(huì)發(fā)生解締，并把溶質(zhì)分子釋放而被洗脫下來(lái)。烷基鍵合固定相的作用在于提供非極性的作用表面