生物技術(shù)專業(yè)大實驗實驗指導(dǎo)

《生物技專業(yè)大實》課程課程編號：0741524966實驗指導(dǎo)主撰人軍麗王雪青金玉趙培審核人素英天津商業(yè)大學(xué)

生物技術(shù)與食科學(xué)學(xué)二零零十一月

1．實驗總體目標(biāo)

使學(xué)生掌握基因工程、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及細(xì)胞工程實驗技術(shù)，提高學(xué)生實驗動手能力以及在驗中分析問題和解決問題的能力今從事生物技術(shù)相關(guān)工作和研究打下堅實的基礎(chǔ)。⒉適用專業(yè)年級

生物技術(shù)專業(yè)第學(xué)⒊先修課程

生物化學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞與分子生物學(xué)、基因工程、細(xì)胞工程⒋實驗課時分配實驗項目

實驗要求

實驗類型

每組人數(shù)

實驗學(xué)時實驗一目基因的PCR擴(kuò)增實驗二片段的回收實驗三的連接實驗四大桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實驗五重DNA的化實驗六快分離大腸桿菌中的重組

必做必做必做必做必做必做

綜合2綜合2綜合2綜合2綜合2綜合2

4433質(zhì)粒實驗七重質(zhì)粒的酶切鑒定實驗八外基因誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白質(zhì)

必做必做

綜合2綜合2

412檢測實驗九細(xì)凝集反應(yīng)實驗十細(xì)膜的滲透性實驗十一細(xì)工程基礎(chǔ)實驗技實驗十二無操作及愈傷組織導(dǎo)技

必做必做必做必做

綜合2綜合2綜合2綜合2

2244術(shù)實驗十三微規(guī)模化培養(yǎng)⒌實驗環(huán)境生物技術(shù)專業(yè)實驗室

必做

綜合2

4⒍實驗總體要求進(jìn)入實驗室，必須穿實驗服。保持實驗臺的整潔，自己的物品需放置在指定位置，貴重物品隨身攜帶。⒎本實驗的重點、難點及教學(xué)方法建議本專業(yè)大實驗主要包括基因克隆、克隆的鑒定、細(xì)胞生物學(xué)基本實驗以及細(xì)胞工程基本實驗技術(shù)。2實驗一目的基因的P擴(kuò)增實驗二片段的回收實驗三的連接實驗四大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實驗五重組DNA的轉(zhuǎn)化實驗六快速分離大腸桿菌中的重組質(zhì)粒實驗七重組質(zhì)粒的酶切鑒定實驗八外源基因誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白質(zhì)檢測實驗九細(xì)胞凝集反應(yīng)實驗十細(xì)胞膜的滲透性實驗十一細(xì)胞工程基礎(chǔ)實驗技術(shù)實驗十二無菌操作及愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)實驗十三微藻規(guī)?；囵B(yǎng)

…………………………………………………………322實驗一的基因的PCR擴(kuò)增一、實目的目的基因的分離技術(shù)是基因工程的三大核心技術(shù)之一。應(yīng)用PCR術(shù)分離目的基因是常用的方法之一通本實驗的學(xué)習(xí)要學(xué)生掌PCR術(shù)的基本原理掌用技術(shù)擴(kuò)增目的基因的方法。二實驗內(nèi)設(shè)計特異引物，以含有目的基因的質(zhì)NA模板，用CR法擴(kuò)增目的基因。三、實要求集中授課四、實準(zhǔn)備在進(jìn)行實驗之前，要求學(xué)生在對課堂相關(guān)知識點理解和掌握的基礎(chǔ)上，認(rèn)真閱讀本實驗指導(dǎo)，并進(jìn)行歸納總結(jié)，完成預(yù)習(xí)報告。五、實原理、方法手段（Polymerase）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是在聚酶催化下，以母鏈為板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板互的子鏈的程是一項外合成技術(shù)快特異地在體外擴(kuò)任何目的?？捎糜诨蚍蛛x克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。PCR反體系包括五種成分）板）物）種脫氧核糖核苷酸）聚酶）應(yīng)緩沖（提供Mg、、子強(qiáng)度PCR反的基本步驟包括）變性：高溫使雙鏈離形成單鏈℃火：低溫下，引物與模DNA互區(qū)結(jié)合（55延伸：聚酶催化以引物為起始點的延伸反應(yīng)（～℃PCR反體系的總體積一般為μl～μl。為了提高PCR的增效率PCR反應(yīng)體系中各成分的濃度按如下原調(diào)控：（一）反應(yīng)緩沖液：由純水、、組用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值使Taq酶偏性環(huán)境中反揮活性。可低退火溫度，但不能超過50mmol/L，否則會抑制聚酶活性。Mg終度為1.52.0mmol/L其對應(yīng)dNTP為μmol/L，意Mg與dNTPs之的濃度關(guān)系于與Taq酶爭MgdNTP濃達(dá)到1mmol/L會抑制Taq的活性。Mg能響反應(yīng)的特異性和產(chǎn)。4BSA一般用乙酰化的BSA起著減少管酶吸作用，對Taq酶保護(hù)作用。dNTPs：dNTPs具較酸性，其儲存液用值至7.0～7.5，一般存儲濃度為，成份以等當(dāng)量配制，反應(yīng)終濃度為～μmol/L高濃度可加速反應(yīng)，但同時增加錯誤摻入和實驗成本；低濃度可提高精確性，而反應(yīng)速度會降低。（五Taq：能耐95℃溫而不失活，其最適為8.3～，最適溫度為75℃，一般用72能化以單為模板以基互補(bǔ)原則為基礎(chǔ)按’→3方逐個將分連接到引物的3端，合成一條與模板DNA互的新的子。無3→5的外切酶活性，沒有校正功能。用量一般為～5個位100。（六）模板PCR模板的度不要求很高，但應(yīng)盡量不含有對反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶聚酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。模的量不能太高，否則擴(kuò)增可能不會成功，在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。（七）引物：引物濃度一般為0.1～0.5，度過高會引起錯和非特異擴(kuò)增，濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。引物長度一般～個堿基，引物過長或過短都會降低特異性。其3’末端一定要與模板配，末位堿基好選用A、、G（因T錯也能引發(fā)鏈的延伸引物GC約～55%堿基應(yīng)盡量隨機(jī)分布，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不能與非目的擴(kuò)增區(qū)有同源性。為了提高PCR的增效率反應(yīng)溫度及溫度持續(xù)時間按如下原則確定：變性板性完全與否是成功的關(guān)鍵般先于或95℃變～10min，然后再進(jìn)入循環(huán)程序94℃變性～。退火：退火溫度一般低于引物本身變性溫度5℃。引物長度在～25bp通過公Tm=(G℃(AT)×2℃計算退火溫度，一般退火溫度在～60之間，時間為～45s如果GC)低于50%退火溫度應(yīng)低于℃。較高的退火溫度可提高反應(yīng)的特異性。（三）延伸：延伸溫度應(yīng)酶的最適溫度范圍之內(nèi)，一般～75。延伸時間要根聚合酶的延伸速度和目的擴(kuò)增片段的長度確定，通常對1kb以的片1即可。PCR循環(huán)數(shù)主要由模板NA的決定，一般2～次循環(huán)數(shù)較合適，過多的循環(huán)數(shù)會增加非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，具體要多少循環(huán)數(shù)可通過預(yù)實驗確定。六、實條件生材料和試劑質(zhì)粒NA，物DNA合酶，×DNA聚酶反應(yīng)緩沖液dNTPsO5儀設(shè)備PCR，臺式低速離心機(jī)，微量移液PCR七、實步驟在管中次加入反應(yīng)體系各成分，混勻，然后低速短暫離心，使液體均位PCR底部。（參考備注）在CR儀控制面板上，設(shè)CR反的程序，然后將P管置于儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)考備注）反應(yīng)結(jié)束后，取少P反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的量和特異性。備：μl反體系的組成：10聚合酶反應(yīng)緩沖液正義引物反義引物

2.0μl2.0μl2.0μl10dNTPs2.0μl模板50聚酶

U加至總體積μlPCR反參數(shù)：根據(jù)引物和模板DNA的特點以及擴(kuò)增片段的長度而定般數(shù)為?C?C50s?Cmin，?C1，30循環(huán)?C10min。八、思題本實驗中10×TaqDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液的成分及各成分的濃度是什么？為什么這樣配制？九、實報告要求學(xué)生在實驗之前認(rèn)真閱讀實驗指導(dǎo)及相關(guān)資料，進(jìn)行歸納總結(jié)，完成實驗預(yù)習(xí)報告。實驗過程中，認(rèn)真記錄實驗步驟，觀察實驗現(xiàn)象，記錄實驗結(jié)果。實驗報告的內(nèi)容包括1）實目的）驗原理）物料、試劑、實驗儀器）實驗步驟）驗結(jié)果和分析（畫出擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果示意圖考。要求學(xué)生在實驗指導(dǎo)及實驗操作的基礎(chǔ)上，獨立進(jìn)行歸納總結(jié)，完成一份內(nèi)容完整、條理清晰、重點突出的實驗報告。十、注事項及其它明規(guī)范使用微量移液器、臺式離心機(jī)等。注意電源安全儀的使用必須老師的指導(dǎo)下進(jìn)行。6實驗二DNA片段的回收一、實目的片的分離與回收是基因工程操作中一項重要的技術(shù)。通過本實驗的學(xué)習(xí)，要求學(xué)生掌握常用的從瓊脂糖凝膠中回DNA段的原理和方法。二實驗內(nèi)用離液序列高的鹽溶解瓊脂糖凝膠，結(jié)合硅質(zhì)吸附柱回收瓊脂糖凝膠中。三、實要求集中授課四、實準(zhǔn)備在進(jìn)行實驗之前，要求學(xué)生認(rèn)真閱讀本實驗指導(dǎo)，并進(jìn)行歸納總結(jié)，完成預(yù)習(xí)報告。五、實原理、方法手段片段的分離與回收是基因工程操作中一項要的技術(shù)，如可收集特定酶切片段用于克隆或是制備探針、回收產(chǎn)用于再次鑒等。迫于基因工程操作的需要，自年初期就已開始片分離與回收的研究，到70年中己探索出了2至種較為有效的方法。理想的片回收方法應(yīng)滿足以下幾個要求。首先，回收片段應(yīng)有非常高的純度，如從普通瓊脂糖中分離出的片段不可帶有即使是微量的凝膠——為它會抑制絕大部分的酶活力；回收過程中加入的各種物質(zhì)最后也要徹底除干凈，因為酶是極其敏感的生物催化劑，雜質(zhì)可能導(dǎo)致酶的異常反應(yīng)或是抑制酶的全部活力次回收過程必須是嚴(yán)格的無DNA酶染的操作過程，不然會發(fā)生回收片段降解的現(xiàn)象，有時其至當(dāng)降解僅僅發(fā)生在粘性末端時也會導(dǎo)致連接反應(yīng)的失敗。再者，要求回收技術(shù)能用于不同大小DNA片，如回收大片段時不發(fā)生機(jī)械性損傷與斷裂作用。第四，要求回收方法有較高的效率，能進(jìn)行微DNA操。最后，要求操作方便、快速，不需要昂貴的試劑與特殊的器材片回收方法包括電泳回收法、收集孔電泳回收法、機(jī)械破碎凝膠回收法、溶（熔）膠回收法、瓊脂糖酶降解凝膠回收法等五大類方法溶（熔）膠回收法是常用的方法之一，包括低融點膠法、碘化鈉法、碘化鉀密度梯度離心法和—玻璃纖維紙吸附法。4碘化鈉法的原理是瓊脂糖能溶解于離液序列高的鹽(也促溶劑中，用的鹽有NaI、KI，以稱化法溶膠溶膠后可與玻璃粉吸附法或是丙(乙醇沉淀法配合使用，前4者用得更廣泛些。另有文獻(xiàn)報道，TBE制的膠不易NaI解，所以最好選用AE沖液進(jìn)行回7收電泳。六、實條件實材料PCR擴(kuò)產(chǎn)物試（1電泳緩沖液：gTrismL冰酸后)mLmol/LEDTA＝加水至1000mLMPa濕滅菌15min冷卻后加入冰醋酸混勻，置于4冰箱長期保存，用時稀釋50倍溶稱取EB溶無水中，母液量濃度為。后4℃冰箱保存，如經(jīng)常使用可于室溫避光放置。使用濃度為0.5注意：EB是誘變劑，配制與使用都應(yīng)極為小心并要防止污染環(huán)境。瓊脂糖子量標(biāo)記上樣緩沖液收試劑盒（離心柱型）(TIANGEN)器PCR儀電泳儀（一套波、微量移液器、臺式離心機(jī)、紫外分析儀、刀片七、實步驟將PCR擴(kuò)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳在紫外分析儀中，用刀片將凝膠中的目的段切下用回收試劑盒（離心柱型）回收凝膠的目的（操作步驟見試劑盒使用說明書）用泳檢測方法對回收產(chǎn)物的純度和回收率進(jìn)行分析八、思題片的分離與回收在DNA重組技術(shù)中的作用是什么？九、實報告要求學(xué)生在實驗之前認(rèn)真閱讀實驗指導(dǎo)及相關(guān)資料，進(jìn)行歸納總結(jié)，完成實驗預(yù)習(xí)報告。實驗8過程中，認(rèn)真記錄實驗步驟，觀察實驗現(xiàn)象，記錄實驗結(jié)果。實驗報告的內(nèi)容包括1）驗?zāi)康模炘恚┪锪?、試劑、實驗儀器）實驗步驟）驗結(jié)果和分析（畫出回收片段電泳結(jié)果示意圖考。要求學(xué)生在實驗指導(dǎo)及實驗操作的基礎(chǔ)上，獨立進(jìn)行歸納總結(jié)，完成一份內(nèi)容完整、條理清晰、重點突出的實驗報告。十、注事項及其它明規(guī)范使用實驗儀器，并注意電源安全。涉及揮發(fā)性有毒試劑的操作，需在通風(fēng)躕進(jìn)行。其他有毒試劑需戴手套進(jìn)行操作。本實驗電泳、切膠步驟需戴手套進(jìn)行操作。溶膠液含有誘變劑溴化乙錠，避免接觸。廢液集中處理。9實驗三DNA的連接一、實目的重技術(shù)是基因工程的三大核心技術(shù)之一DNA連反應(yīng)是重組過程關(guān)鍵步驟過本實驗的學(xué)習(xí)，要求學(xué)生掌握DNA的接方法，了解連接反應(yīng)中各因素對連接效率的影響；掌握隆的原理與方法。二實驗內(nèi)用DNA連接酶將回收的NA段載連接形成重D。三、實要求集中授課四、實準(zhǔn)備在進(jìn)行實驗之前，要求學(xué)生在對課堂相關(guān)知識點理解和掌握的基礎(chǔ)上，認(rèn)真閱讀本實驗指導(dǎo)，并進(jìn)行歸納總結(jié)，完成預(yù)習(xí)報告。五、實原理、方法手段連接反應(yīng)在重組技術(shù)中是非常關(guān)鍵的一步割純化后的目的基因片段只有經(jīng)過與帶有自主復(fù)制起點的載體連接后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，才能得到真正的克隆，所以說連接酶的發(fā)現(xiàn)也是對基因工程發(fā)展的一個巨大貢獻(xiàn)早在年界上就5個驗同時發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌中有連酶；年國威斯康新大學(xué)的Khoro現(xiàn)，經(jīng)噬體感染的大腸桿菌中有基因所編碼的連接酶1972年人們已經(jīng)掌握了多種連接DNA的法這些工作的基礎(chǔ)上，于1972首次實現(xiàn)了DNA體外重組。當(dāng)時的實驗是用T4DNA接酶將Ⅰ切割的λ噬體與同樣切割的猴病毒連，結(jié)果在電子顯微鏡的觀察下，證實出現(xiàn)了重組。連接酶能夠催化在2條鏈之間形成磷酸二酯鍵連酶的作用條件是需要在一條鏈3’—端具有一個游離的羥基OH)在一條鏈5－端具有一個磷酸基團(tuán)(）在大腸桿菌及其它細(xì)菌中，連接酶催化的連接反應(yīng)，是利用（氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）作能源；而在動物細(xì)胞及噬菌體中，則是利用（三磷酸腺苷）作能源只封閉缺口nick能閉裂口響接酶連接效率的主要因素有溫度，一采用至℃）插入片斷與載體分子的摩爾≥3（3連接反應(yīng)的時間12小以上。10TA克隆系統(tǒng)由Invitrogen公司發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于P產(chǎn)物的克隆和測序。其原理是利用aq酶夠PCR產(chǎn)的’端加上一個非模板依賴的A，而載是種帶有3’T突出端的載體（圖1連酶作用下，可以快速PCR產(chǎn)物直接插入質(zhì)粒載體的多克隆位點（MCS中。六、實條件1.試回收的目的基因克試劑盒TIANGEN2.器保溫瓶、臺式離心機(jī)、微量移液器、溫度計圖T-體圖譜七、實步驟在量離心管中依次加入下列試劑（1目的片段T-載體×連接反應(yīng)T連酶11（5

加至終體積102.稍離心，14-16℃水浴連接過夜。注意事項：要獲得目的基因的TA克隆PCR產(chǎn)物的特異性要好。PCR產(chǎn)物在A克隆前要通過純。八、思題連反應(yīng)中如何確定供體DNA與體的加入量？九、實報告要求學(xué)生在實驗之前認(rèn)真閱讀實驗指導(dǎo)及相關(guān)資料，進(jìn)行歸納總結(jié)，完成實驗預(yù)習(xí)報告。實驗過程中，認(rèn)真記錄實驗步驟，觀察實驗現(xiàn)象，記錄實驗結(jié)果。實驗報告的內(nèi)容包括1）實目的）驗原理生物材料、試劑、實驗儀器實驗步驟）實驗結(jié)果和分析；（）考題。要求學(xué)生在實驗指導(dǎo)及實驗操作的基礎(chǔ)上，獨立進(jìn)行歸納總結(jié)，完成一份內(nèi)容完整、條理清晰、重點突出的實驗報告。十、注事項及其它明規(guī)范使用實驗儀器，并注意電源安全。1222實驗四腸桿菌感受態(tài)細(xì)的制備一、實目的通過本實驗的學(xué)習(xí)，要求學(xué)生掌C法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的原理和方法。2二實驗內(nèi)用aCl法備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞三、實要求集中授課四、實準(zhǔn)備在進(jìn)行實驗之前，要求學(xué)生在對課堂相關(guān)知識點理解和掌握的基礎(chǔ)上，認(rèn)真閱讀本實驗指導(dǎo)，并進(jìn)行歸納總結(jié)，完成預(yù)習(xí)報告。五、實原理、方法手段感受態(tài)，即指受體細(xì)胞容易接受外源DNA片的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。大腸桿菌是分子生物學(xué)常用的實驗材料，但是在自然條件下，大腸桿菌很難吸收外。后來的研究發(fā)現(xiàn)，處大腸桿菌細(xì)胞，能夠2誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)。將正在生長的大腸桿菌在℃加入到低濃度CaCl溶液中，便會使細(xì)胞2膨脹成球形，外源DNA和離子作用形成抗DNase的復(fù)合物并粘附在細(xì)胞表面42短暫熱激處理，粘附在細(xì)胞表面的DNA進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。六、實條件材料大腸菌DH5試劑(1)無mmol/l2(2)LB培基胰蛋白胨10g酵母提取物5NaCl10加入蒸餾水至終體積1000mL，節(jié)pH值7.0，高溫高壓滅菌后備用。50mg/mL卡霉素20mg/mLX-gal13(5)200mg/mLIPTG（丙基硫代β半乳糖苷）3.器恒溫?fù)u床、分光光度計、冷凍離心機(jī)、恒溫水浴37恒溫培養(yǎng)箱、涂布棒、微量移液器七、實步驟將ml第次活化的菌液加入至LB培基中，37振蕩培養(yǎng)至≈；600取ml菌液，冰浴分鐘，4rpm離心分收集菌；用μl冰冷的100CaCl重沉淀，冰浴10鐘后?C，rpm離心分2鐘收集菌體；用100l預(yù)冷00mmol/lCaCl懸沉淀2八、思題大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備的第一步，為什么要嚴(yán)格監(jiān)控細(xì)菌的生長情況？九、實報告要求學(xué)生在實驗之前認(rèn)真閱讀實驗指導(dǎo)及相關(guān)資料，進(jìn)行歸納總結(jié)，完成實驗預(yù)習(xí)報告。實驗過程中，認(rèn)真記錄實驗步驟，觀察實驗現(xiàn)象，記錄實驗結(jié)果。實驗報告的內(nèi)容包括1）實目的）驗原理生物材料、試劑、實驗儀器實驗步驟）實驗結(jié)果和分析；（）考題。要求學(xué)生在實驗指導(dǎo)及實驗操作的基礎(chǔ)上，獨立進(jìn)行歸納總結(jié)，完成一份內(nèi)容完整、條理清晰、重點突出的實驗報告。十、注事項及其它明規(guī)范使用實驗儀器，并注意電源安全。14實驗五組NA的轉(zhuǎn)化一、實目的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是基因工程的三大技術(shù)之一。通過本實驗的學(xué)習(xí)，要求學(xué)生掌握大腸桿菌的轉(zhuǎn)基因方法。二實驗內(nèi)將重組DNA入大腸桿菌，通過微生物培養(yǎng)，得到含有重的大腸桿菌菌株。三、實要求集中授課四、實準(zhǔn)備在進(jìn)行實驗之前，要求學(xué)生在對課堂相關(guān)知識點理解和掌握的基礎(chǔ)上，認(rèn)真閱讀本實驗指導(dǎo)，并進(jìn)行歸納總結(jié)，完成預(yù)習(xí)報告。五、實原理、方法手段轉(zhuǎn)化一詞最初是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA，導(dǎo)致性狀發(fā)生遺傳性改變的生命過程。后來這個術(shù)語的范圍擴(kuò)大，可以指任何細(xì)胞吸收外源DNA發(fā)生的可遺傳的性狀改變的過程。外源NA進(jìn)入大腸桿菌的方式有四種：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、電穿孔法、接轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)化是常用的一種方式，通常受體細(xì)胞要經(jīng)過一定的處理進(jìn)入感受態(tài)，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本實驗CaCl法制備的大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將連接物加入到處于感受態(tài)的大腸桿菌中，42短暫熱激處理，粘附在細(xì)胞表面的DNA進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)基因大腸桿菌細(xì)胞的篩選方法是藍(lán)白篩選T載體帶有一個大腸桿菌短區(qū)段。其中含有半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和頭146個基酸的編碼信息這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點。它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能。這種載體適用于可編碼-半乳糖苷酶C端分序列的宿主細(xì)胞。雖然主和質(zhì)粒編碼的片段各自都沒有酶活性，但它們可以融為一體，形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。此宿主細(xì)菌易于識別，因為它們在生色底物

5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷(X-gal)存下形成藍(lán)色落（X-gal在－半乳糖苷酶的作用下分解生成半乳糖和深藍(lán)色的溴4-氯靛藍(lán)而源片段插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，導(dǎo)一乳苷酶無活性。因此，帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這一簡單的顏色試驗大大簡化了在這種質(zhì)粒載體中鑒定重組體的工作。僅僅通過目測15就可以輕而易舉地篩選數(shù)千個菌落可能帶有重組質(zhì)粒的菌落通過小量制備質(zhì)DNA進(jìn)行限制酶切分析，就可以確證這些質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。六、實條件材料感受大腸桿菌試劑LB培基胰蛋白胨酵母提取物

10加入蒸餾水至終體積1000mL，調(diào)節(jié)值，溫高壓滅菌后備用?？敲顾豂PTG（丙基硫－-D-乳糖苷）3.器恒溫?fù)u床、恒溫水浴37℃恒溫培養(yǎng)箱、涂布棒、微量移液器七、實步驟向冰浴保存的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中加入μl連產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30分；42?C熱激秒冰迅速冷卻分鐘加入μl培基37振培養(yǎng)至少2時；在含抗生素的平板上加入一定體積的和溶液菌璃涂布器把溶液涂布于整個平板的表面，于?C培至所有液體消;取μl菌涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，吹干37倒培養(yǎng)小時；）觀察平板上菌落的數(shù)量和顏色，并統(tǒng)計白色菌落的比例。八、思題本實驗中將外源DNA導(dǎo)入大腸桿菌，還可以采用哪種方法？這種方法的原理是什么？九、實報告要求學(xué)生在實驗之前認(rèn)真閱讀實驗指導(dǎo)及相關(guān)資料，進(jìn)行歸納總結(jié)，完成實驗預(yù)習(xí)報告。實驗過程中，認(rèn)真記錄實驗步驟，觀察實驗現(xiàn)象，記錄實驗結(jié)果。實驗報告的內(nèi)容包括1）實目的）驗原理生物材料、試劑、實驗儀器實驗步驟）實驗結(jié)果和分析；（）考題。要求學(xué)生在實驗指導(dǎo)及實驗操作的基礎(chǔ)上，獨立進(jìn)行歸納總結(jié)，完成一份內(nèi)容完整、條理清晰、重點突出的實驗報告。16十、注事項及其它明規(guī)范使用實驗儀器，并注意電源安全。17實驗六速分離大腸桿菌的重組質(zhì)粒一、實目的質(zhì)粒NA是用最廣泛的基因克隆載體。分離得到高質(zhì)量的質(zhì)粒是基因克隆載體和目的基因進(jìn)行重組以及對重組載體進(jìn)行鑒定的前提條件。通過本實驗的學(xué)習(xí)，要求學(xué)生掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和方法。二實驗內(nèi)用堿裂解法提取大腸桿菌中的質(zhì)D三、實要求集中授課四、實準(zhǔn)備在進(jìn)行實驗之前，要求學(xué)生在對課堂相關(guān)知識點理解和掌握的基礎(chǔ)上，認(rèn)真閱讀本實驗指導(dǎo)，并進(jìn)行歸納總結(jié)，完成預(yù)習(xí)報告。五、實原理、方法手段質(zhì)粒（）一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不，為雙鏈、共價閉合環(huán)狀DNA，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)并表達(dá)所攜帶的遺傳信息環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒子具有三種構(gòu)型：①共價合環(huán)形，兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，這樣的通呈超螺旋構(gòu)型，在電泳時泳動速度最快；②開環(huán)，條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個缺口線DNA，質(zhì)粒發(fā)雙斷裂而形成性分子。質(zhì)粒是重組技術(shù)中常用的載體。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的礎(chǔ)上為適應(yīng)實驗室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的。分離得到高質(zhì)量的質(zhì)粒，是基因克隆載體和目的基因進(jìn)行重組以及對重組載體進(jìn)行鑒定的前提條件。從細(xì)菌中分離質(zhì)粒的方法都包括3個本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。粒分離純化主要有兩種方法，即氯化銫——溴化乙錠密度梯度離心法和堿裂解法。氯化銫——溴化乙錠密度梯度離心法的基本原理是質(zhì)粒和色體合溴化乙錠的量不同。溴化乙錠通過嵌入基之間而與結(jié)，進(jìn)而使雙螺旋解旋。質(zhì)粒具有超螺旋結(jié)構(gòu)，解旋的程度有限，因此結(jié)合的溴化乙錠較少。片段化的染色是性分子，能夠結(jié)合較多的溴化乙錠分子直至飽和每２個堿基對大約結(jié)合１個溴化乙錠分)結(jié)溴化乙錠18后分子的密度減小。因此在飽和濃度的化乙錠溶液中質(zhì)粒具有更高的密度。然后用氯化銫密度梯度離心分離質(zhì)粒。年來，氯化銫——溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒的選方法。然而該過程既昂貴又費時，為此發(fā)展了許多替代方法。堿裂解法是目前最常用的質(zhì)粒提取方法。該方法最基本的原理是利用染色體與質(zhì)粒的性與復(fù)性的差異來分離質(zhì)粒。先強(qiáng)堿條件下，使染色體與質(zhì)粒DNA變性然后降低體系pH值共價閉合環(huán)狀由具有超螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈不會相互分，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。線狀染色體DNA片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，形成沉淀。本實驗采用堿裂解法結(jié)合硅質(zhì)吸附柱分離純化質(zhì)粒DNA。在離液劑（例如鹽酸胍）存在的條件下選性的吸附在硅質(zhì)吸附柱，其他雜質(zhì)均可以過濾去除，然后DNA洗下來，得到高純度。六、實條件材料藍(lán)白選平板上的白色菌落試劑（1質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校═IANGEN）溶液Ⅰ：mmol/l葡萄糖；25mmol/lTris-HClpH；mmol/lEDTA溶菌酶水解菌體細(xì)胞壁EDTA為溶菌酶提供低離子強(qiáng)度的環(huán)；抑制DNase活性葡萄糖增加溶液粘度，防止細(xì)菌染色體DNA受機(jī)械剪切力作用降解，從而染質(zhì)粒溶液Ⅱ：0.2mol/l；SDSNaOH使色體及粒堿變性SDS破細(xì)胞膜、使蛋白變性溶液Ⅲ：3mol/l（pH4.8）從性調(diào)至中性時質(zhì)粒復(fù)以來的構(gòu)型存在于溶液中而色體蛋白等以沉淀的形式存在。培基瓊脂糖凝膠電泳所需試劑器臺式離心機(jī)、恒溫?fù)u床、恒溫水浴℃恒溫培養(yǎng)箱、微量移液器DNA電泳設(shè)備七、實步驟實驗之前先將藍(lán)白篩選平板上的白色菌落接種在含有氨芐青霉素mg/L的LB液培養(yǎng)基中，1937夜培養(yǎng)。．堿裂解法提取質(zhì)粒取ml菌液離心30秒收集菌體；100μl預(yù)的溶液Ⅰ重懸菌體，劇烈振蕩，使菌體在溶液Ⅰ中完全分散；加入200μl配制的溶液Ⅱ，蓋緊管口，快速顛倒離心數(shù)次，混勻后冰浴鐘；加入預(yù)冷的150μl溶液Ⅲ，蓋緊管口，將離心管倒置后和地振蕩數(shù)次，使溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后冰浴分；4，離心分，取上清，加入等體積/仿1:1)振蕩混勻?C，離心5分；取上清液，加入兩倍體積的無水乙醇，冰浴10分，?C，離心鐘；沉淀用70%乙醇兩遍，吹干100μL溶，加入10μg/μl1μl,37保分鐘；加入等體積/氯仿(抽提一次；取上清液，加入體的3mol/lNaAC和兩倍體積的無水乙醇，混勻，冰浴分鐘；4，離心10分，沉淀用乙醇洗兩遍，吹干，μlTE或ddHO溶；10取少許質(zhì)粒溶液進(jìn)行電泳，觀察質(zhì)粒提取的量和純度。．堿裂解法結(jié)合硅質(zhì)離心吸附柱快速、高效提取質(zhì)粒（具體操作步驟請參看試劑盒套的說明書）收集1.5-3菌的沉淀于ml離管中，加入μl溶Ⅰ，振蕩至徹底懸?。患尤?50μl液Ⅱ，立即輕柔顛倒離心管數(shù)次，使菌體分裂解，裂解后的菌體變得清亮，隨后將離心管放置于冰上分；加入150μl液Ⅲ，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，室溫放分鐘，離心分鐘；將420μl結(jié)緩沖液加入硅質(zhì)離心吸附柱中，然后將步驟中得上清液加入離心吸附柱中，混勻，離心30秒倒掉廢液收集管中的廢液；加入750μl洗緩沖液于離心吸附柱中，12,000rpm離心秒倒掉廢液收集管中的廢液；重復(fù)步驟5）一次，再次于rpm離分，盡量除去漂洗緩沖；小心取出離心吸附住，將其套入一個干凈的離心管中，加入適洗脫緩沖液，室溫放置2-5分鐘后，12,000rpm離鐘離心收集的液體即可用于游操作（對于大于kb的質(zhì)，可將洗脫緩沖液于?C水放置5-10分，以確保質(zhì)粒的完全洗脫20）取少許質(zhì)粒溶液進(jìn)行電泳，觀察質(zhì)粒提取的量和純度。八、思題你提取質(zhì)粒的電泳結(jié)果中有幾條帶？為什么？在堿裂解法提取質(zhì)粒操過程中應(yīng)注意哪些問題？在堿裂解法提取質(zhì)粒的方法中，染色體DNA質(zhì)粒DNA分的主要依據(jù)是什么？九、實報告要求學(xué)生在實驗之前認(rèn)真閱讀實驗指導(dǎo)及相關(guān)資料，進(jìn)行歸納總結(jié)，完成實驗預(yù)習(xí)報告。實驗過程中，認(rèn)真記錄實驗步驟，觀察實驗現(xiàn)象，記錄實驗結(jié)果。實驗報告的內(nèi)容包括1）實目的）驗原理）物料、試劑、實驗儀器）實驗步驟）驗結(jié)果和分析（畫出電泳圖譜示意圖考題。要求學(xué)生在實驗指導(dǎo)及實驗操作的基礎(chǔ)上，獨立進(jìn)行歸納總結(jié)，完成一份內(nèi)容完整、條理清晰、重點突出的實驗報告。十、注事項及其它明規(guī)范使用實驗儀器，并注意電源安全?；蚬こ叹N不可隨意丟棄，要統(tǒng)一進(jìn)行滅菌處理。21實驗七組質(zhì)粒的酶鑒定一、實目的了解轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選方法掌握限制性核酸內(nèi)切酶酶解分析法鑒定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的原理和方法二實驗內(nèi)用限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒進(jìn)行酶切反后電泳檢測。三、實要求集中授課四、實準(zhǔn)備在進(jìn)行實驗之前，要求學(xué)生在對課堂相關(guān)知識點理解和掌握的基礎(chǔ)上，認(rèn)真閱讀本實驗指導(dǎo)，并進(jìn)行歸納總結(jié)，完成預(yù)習(xí)報告。五、實原理、方法手段轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選方法包括遺傳表型直接篩選法析重組結(jié)特核分子雜交檢測法、免疫化學(xué)檢測法等多種方法。其中分析重DNA結(jié)特征是常用的方法之一，包括快速裂解菌落鑒定質(zhì)粒DNA分大小、限制核酸內(nèi)切酶酶解分析法、利用方篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞等方法。限制性核酸內(nèi)切酶酶解分析法的原理是選用重時用到的限制性內(nèi)切酶，或根據(jù)重組的構(gòu)特征選用一種或兩種限制性內(nèi)切酶，重組進(jìn)酶切反應(yīng)，然后電泳檢測酶切產(chǎn)物。如果是重組，出現(xiàn)已知大小的目的基因片段和載體段。六、實條件1.試LB培養(yǎng)50mg/mL卡霉素質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?TIANGEN)限制性內(nèi)切酶EcoRI(Promega)50×TAE電緩沖液：10mg/mLEB瓊脂糖DNA分量標(biāo)記(TIANGEN)22(9)×樣緩沖液2.器材恒溫?fù)u床、無菌牙簽、渦旋振蕩器、臺式離心機(jī)、微量移液器、℃溫培養(yǎng)箱、電泳儀（一套波爐、紫外分析儀、七、實步驟1．在微量離心管中依次加入如試劑：1.0-2.0μg10酶切反應(yīng)bufferμl限制性內(nèi)切酶

U-15U加至終體積μl2.?C反應(yīng)個小時左右3．電泳檢測酶切結(jié)果八、思題本實驗中還可以選用哪些限制性內(nèi)切酶對重DNA行鑒定？九、實報告要求學(xué)生在實驗之前認(rèn)真閱讀實驗指導(dǎo)及相關(guān)資料，進(jìn)行歸納總結(jié)，完成實驗預(yù)習(xí)報告。實驗過程中，認(rèn)真記錄實驗步驟，觀察實驗現(xiàn)象，記錄實驗結(jié)果。實驗報告的內(nèi)容包括1）實目的）驗原理）物料、試劑、實驗儀器）實驗步驟）驗結(jié)果和分析（畫出電泳圖譜示意圖考題。要求學(xué)生在實驗指導(dǎo)及實驗操作的基礎(chǔ)上，獨立進(jìn)行歸納總結(jié)，完成一份內(nèi)容完整、條理清晰、重點突出的實驗報告。十、注事項及其它明規(guī)范使用實驗儀器，并注意電源安全。23實驗八源基因誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)檢測一、實目的學(xué)習(xí)并掌握外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的特點及其在蛋白的電泳檢測方法和技.二實驗內(nèi)用IPTG導(dǎo)腸桿菌表達(dá)重組蛋白，然后SDS泳，用考馬斯亮蘭染色方法檢測重組蛋白，同時用免疫印跡方法檢測重組蛋白。三、實要求集中授課四、實準(zhǔn)備在進(jìn)行實驗之前，要求學(xué)生在對課堂相關(guān)知識點理解和掌握的基礎(chǔ)上，認(rèn)真閱讀本實驗指導(dǎo)，并進(jìn)行歸納總結(jié)，完成預(yù)習(xí)報告。五、實原理、方法手段通過基因重組可將外源基因?qū)爰?xì)并使之?dāng)U增或表外源基因被克隆在Lac啟子下,與表達(dá)質(zhì)粒載體連接構(gòu)成重組經(jīng)CaCl轉(zhuǎn)導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi).當(dāng)有IPTG(異丙基--D-硫半乳糖苷)時Lac啟子被誘導(dǎo)而啟動其下游基因進(jìn)表達(dá),從在轉(zhuǎn)化導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生外源基因表達(dá)的產(chǎn).通過電泳可檢測表達(dá)產(chǎn)物蛋白的存聚丙烯酰胺凝膠電泳(是在蛋白質(zhì)溶液加入SDS巰基乙醇后,巰乙醇還原蛋白質(zhì)分子的二硫鍵;能打開蛋白質(zhì)的氫鍵疏水同時結(jié)合成多復(fù)合.在一定條件下SDS-多肽復(fù)合物(克SDS與性蛋白結(jié)合使蛋白質(zhì)均帶電.所以在電泳中的遷移率只與分子量有關(guān)而與其本身的電荷無.六、實條件菌株,載體培液及培養(yǎng)用試劑:GST-GFPvector,培養(yǎng)液，(50ug/ml),溶菌酶。制備聚丙烯酰胺凝膠用試劑:丙烯酰胺，N′,N′亞丙烯酰胺，過酸胺，四甲基乙二胺，十二烷基硫酸鈉。聚丙烯酰胺凝膠電泳用試劑及材甘氨酸，protein溴藍(lán)，轉(zhuǎn)印膜油濾紙，Tris-HCl(pH6.8),，；Runningbuffer:25mMbase,glycine,1%24Transferbuffer:20mMTris,150mMglycine,methanol(膜移用;5xsamplebuffer:250mMTris-HCl(pH6.8),電級,0.5MDTT,10%glycerol,100mM陽對照樣品制備用試劑及材:10XPBS，脫脂奶粉，自制一抗，偶聯(lián)二抗，小鼠腦組織，lysisNaCl,1mMEGTA,1mMEDTA,1mMNaVO10%1%Triton檢所需試劑及材:考馬斯亮藍(lán)染液:0.25%brilliantblue,methanol,7.5%glacialacid；脫色液10%methanol,10%glacialacid;自制一抗，酶偶聯(lián)二抗，，片，壓片暗盒，增感屏，顯影液，定影液儀及用具:垂電泳裝置，電轉(zhuǎn)移裝置，組織勻漿機(jī)℃培養(yǎng)箱，臺高速離心機(jī)水箱水平搖床，制機(jī)電磁爐熱鍋，染缸脫色缸鑷子;托盤，乳膠手;1.5ml離管，錐;離管等七、實步驟外基誘表達(dá)預(yù)培養(yǎng)過夜.過夜培養(yǎng)的菌液按1:100比接新的含有抗生素的LB培液中.在℃震蕩培養(yǎng)小時使OD600=0.6-0.8之.IPTG誘過.離心用洗兩次菌體-20保存上,SDS聚丙酰凝電(加入5X點,100沸水浴加熱五分鐘,蛋白質(zhì)充分變.室溫將品上樣凝加樣孔內(nèi).同時用蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品作陽性對照.當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)膠末端時停止電泳.將凝膠從中間切,一作膜轉(zhuǎn)移,下一半作染色檢測。將凝膠移入染缸,放平緩的搖床上于室溫染色時?；厥杖疽阂詡浜笥?將膠浸泡于脫色液中,放平緩的搖床上于室溫色3-5小時,其更換脫色液3-5次.脫色越充分蛋質(zhì)檢出下限越,一可檢測到單一條帶中含量低的蛋白質(zhì)八、思題．SDS中下層膠中為什么不p的Tris-HCl(pH6.8和H8.8)?．電泳液中為什么用甘氨?25．比較蛋白質(zhì)檢測方法中染色法與印跡法的異同．比較E和westernblotting的異同．Westernblotting中如何減少非特異性條帶的出現(xiàn)？九、實報告要求學(xué)生在實驗之前認(rèn)真閱讀實驗指導(dǎo)及相關(guān)資料，進(jìn)行歸納總結(jié)，完成實驗預(yù)習(xí)報告。實驗過程中，認(rèn)真記錄實驗步驟，觀察實驗現(xiàn)象，記錄實驗結(jié)果。實驗報告的內(nèi)容包括1）實目的）驗原理生物材料、試劑、實驗儀器實驗步驟）實驗結(jié)果和分析；（）考題。要求學(xué)生在實驗指導(dǎo)及實驗操作的基礎(chǔ)上，獨立進(jìn)行歸納總結(jié)，完成一份內(nèi)容完整、條理清晰、重點突出的實驗報告。十、注事項及其它明規(guī)范使用實驗儀器，并注意電源安全。26實驗九胞凝集反應(yīng)一、實目的觀察細(xì)胞凝集現(xiàn)象并了解其原理。二實驗內(nèi)用土豆凝集素對雞血細(xì)胞進(jìn)行凝集反應(yīng)。三、實要求集中授課四、實準(zhǔn)備在進(jìn)行實驗之前，要求學(xué)生在對課堂相關(guān)知識點理解和掌握的基礎(chǔ)上，認(rèn)真閱讀本實驗指導(dǎo)，并進(jìn)行歸納總結(jié)，完成預(yù)習(xí)報告。五、實原理、方法手段細(xì)胞膜是雙層脂鑲嵌蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，脂和蛋白質(zhì)又能與糖分子結(jié)合為細(xì)胞表面的分枝狀糖外被。目前認(rèn)為：細(xì)胞間的聯(lián)系，細(xì)胞的生長和分化，免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生都和細(xì)胞表面的分支狀糖分子有關(guān)。凝集素（）一類含糖的（少數(shù)例外）并能與糖專一結(jié)合或的蛋白質(zhì)，它具有凝集細(xì)胞和刺激細(xì)胞分裂的作用。凝集素使細(xì)胞凝集是由于它與細(xì)胞表面的糖分子廉潔，在細(xì)胞間形成“橋”的結(jié)果，加入與凝集素互補(bǔ)的糖可以抑制細(xì)胞的凝集。六、實條件．土塊莖．顯鏡，粗天平，載玻片，滴，離心管2．PBS緩液．紅細(xì)胞液七、實步驟．稱取土豆去皮塊莖2g加緩沖液浸泡2h浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素。．用滴管吸取土豆凝集素和紅胞各一滴，置載玻片上充分混勻。靜置后于低倍顯微鏡下觀察血球凝集現(xiàn)象。．以液代替土豆凝集素與2%細(xì)胞做對照實驗。八、思題．如何檢測紅細(xì)胞表面哪些成分與土豆凝集素發(fā)生反應(yīng)？27試出其他凝集素引起細(xì)胞凝集反應(yīng)的例子九、實報告要求學(xué)生在實驗之前認(rèn)真閱讀實驗指導(dǎo)及相關(guān)資料，進(jìn)行歸納總結(jié)，完成實驗預(yù)習(xí)報告。實驗過程中，認(rèn)真記錄實驗步驟，觀察實驗現(xiàn)象，記錄實驗結(jié)果。實驗報告的內(nèi)容包括1）實目的）驗原理生物材料、試劑、實驗儀器實驗步驟）實驗結(jié)果和分析；（）考題。要求學(xué)生在實驗指導(dǎo)及實驗操作的基礎(chǔ)上，獨立進(jìn)行歸納總結(jié)，完成一份內(nèi)容完整、條理清晰、重點突出的實驗報告。十、注事項及其它明規(guī)范使用實驗儀器，并注意電源安全。28實驗十胞膜的滲透性一、實目的了解細(xì)胞膜的滲透性及各類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度。二實驗內(nèi)將紅細(xì)胞置于不同的等滲溶液中，觀察溶質(zhì)能否進(jìn)入細(xì)胞以及進(jìn)入細(xì)胞的速度。三、實要求集中授課四、實準(zhǔn)備在進(jìn)行實驗之前，要求學(xué)生在對課堂相關(guān)知識點理解和掌握的基礎(chǔ)上，認(rèn)真閱讀本實驗指導(dǎo)，并進(jìn)行歸納總結(jié)，完成預(yù)習(xí)報告。五、實原理、方法手段將紅細(xì)胞放入各種等滲溶液中，由于紅細(xì)胞對各種溶質(zhì)的透性不同，有的溶質(zhì)可以滲入，有的溶質(zhì)不能滲入，滲入的溶質(zhì)能提高紅細(xì)胞的滲透壓，所以促使水分進(jìn)入細(xì)胞，引起溶血。由于溶質(zhì)透入速度互不相同，因此溶血時間也不相同。六、實條件．器：50mL小杯，移管，試管，試管架，顯微鏡．試NHCl0.17mol/LNHAcNaNO0.12mol/L43草酸胺0.12mol/LSO0.32mol/L萄糖0.32mol/L甘0.32mol/L乙2丙酮。．材：雞血七、實步驟．雞細(xì)胞懸液取50mL小杯一只，加羊血和份0.17mol/LNaCl，混勻成不透明紅色液體。此即為稀釋雞血。．低溶液取試管一支，加入蒸餾水10mL和釋雞血1mL注意觀察溶液顏色的變化，由不透明的紅色逐漸澄清，說明紅細(xì)胞發(fā)生破裂造成紅胞溶血，使光線比較容易透過溶液。．雞細(xì)胞的滲透29取試管一支，加入NaCl稀釋雞血1mL，輕搖動，注意觀察顏色有無變化？有無溶血現(xiàn)象？為什么？取試管一支，加入NHCl和釋雞血，輕輕搖動，注意觀察顏4色有無變化？有無溶血現(xiàn)象？若發(fā)生溶血，記下時間（自加入稀釋羊血到溶液變成紅色透明澄清所用時間分別在另外種滲溶液中進(jìn)行同樣的誓言。步驟同。平行取樣品于顯微鏡下觀察細(xì)胞形狀變化八、思題除了用溶血時間標(biāo)志各種低滲溶液的溶血作用，還有哪些方法可以采用？能否定量表示？九、實報告將觀察到的現(xiàn)象記入下表，對實驗結(jié)果進(jìn)行比較和分析。表不同低滲溶液的溶血現(xiàn)象編號

試驗溶液

是否溶血

時間

結(jié)果分析

蒸餾水NHCl4NHAc4NaNO3草酸胺Na24葡萄糖甘油醇酮要求學(xué)生在實驗之前認(rèn)真閱讀實驗指導(dǎo)及相關(guān)資料，進(jìn)行歸納總結(jié)，完成實驗預(yù)習(xí)報告。實驗過程中，認(rèn)真記錄實驗步驟，觀察實驗現(xiàn)象，記錄實驗結(jié)果。實驗報告的內(nèi)容包括1）實目的）驗原理生物材料、試劑、實驗儀器實驗步驟）實驗結(jié)果和分析；（）考題。要求學(xué)生在實驗指導(dǎo)及實驗操作的基礎(chǔ)上，獨立進(jìn)行歸納總結(jié)，完成一份內(nèi)容完整、條理清晰、重點突出的實驗報告。十、注事項及其它明進(jìn)入實驗室，必須穿實驗服。保持實驗臺的整潔，自己的物品需放置在指定位置，貴重物品隨身攜帶。規(guī)范使用實驗儀器，并注意電源安全。30實驗十一胞工程基實驗技術(shù)一、實目的學(xué)會并掌握微藻培養(yǎng)基的配置方法；植物細(xì)胞培養(yǎng)基MS的制；動物細(xì)胞RPMI1640培養(yǎng)基的配制，各種附加成分母液的配制；滅菌方法。二實驗內(nèi)常用植物細(xì)胞培養(yǎng)基MS母的制以動物細(xì)胞培養(yǎng)中各種附加成分母液的配制；培養(yǎng)基的配制；滅菌。三、實要求集中授課四、實準(zhǔn)備在進(jìn)行實驗之前，要求學(xué)生在對課堂相關(guān)知識點理解和掌握的基礎(chǔ)上，認(rèn)真閱讀本實驗指導(dǎo)，并進(jìn)行歸納總結(jié)，完成預(yù)習(xí)報告。五、實原理、方法手段每種微藻都有最適宜的培養(yǎng)基，但海水藻f/2為一般培養(yǎng)基，淡水藻以朱10號或一般培養(yǎng)基，若培養(yǎng)螺旋藻采AB培養(yǎng)基。無論哪種培基由于試驗的需要，常常要求在短期時間內(nèi)獲得大量的培養(yǎng)物，所以在微藻允許范圍內(nèi)富集大量營養(yǎng)元素，加速藻的生長。植物培養(yǎng)基中含有外植體生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，是組織培養(yǎng)中外植體賴以生存和發(fā)展的基地。培養(yǎng)基的成分大致可分五類即水、無機(jī)營養(yǎng)、有機(jī)營養(yǎng)、植物生長物質(zhì)和天然附加物。和培養(yǎng)基含有較高的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，合于多種培養(yǎng)物的生長。此外還有N、B培養(yǎng)基等。應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)的目的選擇一種適宜的培養(yǎng)基。本實驗制培養(yǎng)基。6動物細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)基培養(yǎng)基PMI1640主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)離子及其他一些輔助物質(zhì)。胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。平衡鹽溶液balancedsaltsolution，BSS)或鹽溶液，細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體。它主要由無機(jī)鹽和葡萄糖配制而成，起著維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度等重要作用。六、實條件（一）儀高壓滅菌鍋電磁爐31純水儀電子天平（二）材微藻培養(yǎng)所需KClKBrO22BO33MgClO2Na24NaHCO3CaCl

2NaNO312.NaH24NaSiO·9HO2FeCH·5H6515.·4HO416.MnCl·4HO217.CoCl·6H2218.NaEDTA219.CuSOO420.Na·2HO24221.

1222.等1植物愈傷組織傳代所需萘酸芐基氨基嘌呤硝酸銨32硝酸鉀氯化鉀硫酸鎂磷酸二氫鉀碘化鉀硼酸硫酸錳硫酸鋅鉬酸鈉氯化鈷硫酸銅硫酸亞鐵乙二胺四乙酸二鈉甘氨酸煙酸鹽酸吡多醇鹽酸硫胺素肌醇蔗糖瓊脂三角瓶（50mL）棕色瓶（100mL，500mL，mL26.鑷27.玻燒mL，，mL28.玻棒棉塞或封口膜記號筆腫瘤細(xì)胞傳代所需養(yǎng)基胎牛血清33Na?HO242KHPO2CaCl

2MgSO?7H4葡萄糖胰酶EDTA三蒸水（三）試微藻培養(yǎng)所需工海水配方g/LKBr0.096；0.003g/L·6H0.024；22H33

g/L；MgCl·6HOg/L2Na24NaHCO3

g/L；g/L；

2

g/L；g/L；f/2培養(yǎng)液的配方（1）NaNO3（2）NaHPO24

mg/L；4.4mg/L；NaSiO·9HO；22FeCHOO3.9mg/L65微量元素母液配方Omg/L；434MnCl·4Hmg/L2CoClOmg/L；22NaEDTA；2CuSO·5H10mg/L；4NaOmg/L242（6維生素母液配方1000

121

0.5；mg/L氏10號養(yǎng)基配方：)32KHPO24

g；g；MgSO·7HOg；42Na23NaSiO23

；；g；H1000ml；2培養(yǎng)基中的三價鐵離子用量極少，為保證用量，將其配制成倍母液。由于實驗室中的FeCl含結(jié)晶水稱量0.13g的FeCl·6H用ml蒸水溶解即為母液1000ml32培養(yǎng)基中加入1ml。4AB培基，其配方成分下表所示培養(yǎng)基配方L）Workingsolution:glassdistilledwaterNaHCO3Na23KHPO2NaNO3KSO2

35-1-1-1-1-1-1-1-1MgSO·7HO42·2H0.04g2PIVsolution6ml–1mlVitamin0.15μgsolution:of–distilledallthefollowingsaltsinamountsHBO33

MnCl·4H181mg2O4MnSO·7HO250mg42CuSO·5H4Na24PIVmetal

2.1mg1000mlofdistilledwater,all0.750gofNaEDTA,andthe2followingintheamountindicated:O32MnCl·4H22

CoClO2mg22NaO4mg242植物愈傷組織傳代所需1.MS基本培養(yǎng)基貯液：大量元素(10×)

微量元素mg·L(100×)

鐵母液/g·L（100×

有機(jī)營養(yǎng)mg·(100mL)(100×)NHNO43

KI

NaEDTA·7HO2

肌醇

KNO3

H33

·7HO4

煙酸

·2H2MgSO·7H3.742

MnSO·4HO22304·7HO8604

鹽酸吡哆醇鹽酸硫胺素

36-3-3-3-3KH2

1.74

甘氨酸

CoCl·6HO2.522CuSO4NaOHHCl生長調(diào)節(jié)劑貯液（1mol/L的萘乙酸溶液：稱取18.6mg的乙酸溶液用少量NaOH解后，用水稀釋并定容至100mL。（2mol/L的芐基氨基嘌呤溶液：稱取22.5mg的芐基氨基嘌呤，用少量1mol/LHCl解后，用水稀釋并定容至mL5.70%或的消毒酒精（用的醫(yī)用酒精配制）腫瘤細(xì)胞傳代所需常用平衡鹽溶液配方）試劑Na242KH2NaHCO32MgSO?7HO42葡萄糖

PBS

D-Hank’s

七、實步驟微藻培養(yǎng)基所需將f培養(yǎng)液的種養(yǎng)鹽分別配置成母液，而后℃、20min濕滅菌）~（）號營養(yǎng)鹽冷卻后常溫保存，維生素溶液4冷藏存。按照配方配制人工海水然后進(jìn)加熱滅菌冷卻至室溫?zé)o菌操作加入f營養(yǎng)鹽37-6-7-6-7（）號溶液各1ml，量元素和維生素各ml混勻即為海藻培養(yǎng)基，備用。朱氏10號養(yǎng)基的配法相似。植物愈傷組織傳代所需各種貯液按一定比例混合，配制成MS基培養(yǎng)基。分別加入一定濃度的NAA和BA（在10-10

mol/L圍內(nèi)，植物愈傷組織NAA和BA的濃度比為，也可設(shè)計不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)生根生芽培養(yǎng)基中加入蔗糖，0.7%脂。加去離子水到一定體積。用1N的調(diào)pH至5.8。將培養(yǎng)基煮沸，分裝到50mL三瓶中。每瓶mL左。用封口膜或棉塞包扎瓶口。將三角瓶放入高壓滅菌鍋，在120℃、1200Pa滅菌。待溫度降低到℃以下，打開放氣閥排氣后，取出三角瓶、平放冷卻備用。按上述方法高壓滅菌去離子水，燒杯，培養(yǎng)皿和相關(guān)用具。注意事項：在配制植物激素時，溶解試劑的NaOH和HCl用量要少，用蒸餾水稀釋時，慢慢燒杯內(nèi)壁加入。對培養(yǎng)基和材料及器皿的滅菌要嚴(yán)格。分裝培養(yǎng)基時，不能把培養(yǎng)基沾附到瓶口上，以免引起污染。腫瘤細(xì)胞傳代所需1640培液稱10.4g末(售進(jìn)口產(chǎn)品一般為一)溶于1000mL三水，待溶解后通入CO約52分鐘液體呈檸檬色后加入0.3g/L谷氨酰胺先用1N調(diào)pH6.8以用N調(diào)至～無菌玻璃濾器或金屬濾器0.22μm或0.3μm微孔濾膜過濾除菌按所需量分裝置低溫保存。衡鹽溶液配制配制所需用水均為三蒸水，以配制Hanks（1L液為例a稱量將溶于100ml水中；2將其他成分依次溶于800ml水中；緩慢將a倒b中攪動防止沉淀；補(bǔ)水加至1000ml混；分裝至試劑瓶或鹽水瓶中－min壓滅菌，℃存；38f、調(diào)pH值。化液配制所需試劑為胰酶0.25EDTA(0.02和D-Hank液以配制為例：量取80mlHank’s液，加入0.02EDTA攪拌至完全溶解；往a中加入g胰，玻璃棒攪拌助溶；調(diào)節(jié)pH值7.4。0.22μm器過濾除菌裝入螺口試劑瓶，℃存?zhèn)溆?。牛血清處理一般來說，未使用的胎牛血清使用前需要6℃浴鍋中水浴處理0～30，以滅活補(bǔ)體。由于胎牛血清一般需－℃存，且應(yīng)盡量減少反復(fù)凍融過程，所以滅活后應(yīng)進(jìn)行分裝八、思題f/2培養(yǎng)基配置時的加樣順序應(yīng)注意哪些，為什么MS培養(yǎng)基的組成成分有哪幾類，在離培養(yǎng)中的功能是什么？胰蛋白酶的作用是什么？九、實報告制備好待用的、朱氏號和培基MS培養(yǎng)基RPMI1640培基平衡鹽溶液消化液等要求學(xué)生在實驗之前認(rèn)真閱讀實驗指導(dǎo)及相關(guān)資料，進(jìn)行歸納總結(jié)，完成實驗預(yù)習(xí)報告。實驗過程中，