薄層掃描法課件

薄層掃描法09中藥一班薄層掃描法一、定義薄層掃描法(TLCS)又稱(chēng)原位定量薄層色譜掃描法（QTLC）系指用一定的波長(zhǎng)的光照射在薄層板上，對(duì)薄層色譜中有紫外或可見(jiàn)吸收的斑點(diǎn)或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品定性定量的分析方法?；仡櫛由V法（TLC)1、薄層板的制備（硅膠板,Al2O3板，聚酰胺薄膜等）2、點(diǎn)樣（選擇合適的展開(kāi)劑，在薄板底1cm處畫(huà)基線，點(diǎn)樣）3、展開(kāi)（浸入展開(kāi)劑，展開(kāi)到距薄板頂端1~2cm)4、檢視(在紫外光燈下觀察斑點(diǎn)）表7-5-2國(guó)外幾種主要專(zhuān)用薄層色譜掃描儀二、TLCS基本原理與方法薄層掃描法可分為薄層吸收掃描及薄層熒光掃描兩類(lèi)方法。1.薄層吸收掃描法的基本原理薄層吸收掃描法是用可見(jiàn)光或紫外線的單色光照射展開(kāi)后的薄層色譜板，測(cè)定薄層色譜斑點(diǎn)(簡(jiǎn)稱(chēng)斑點(diǎn))的吸光度(A)隨展開(kāi)壓離(L)的變化，而獲得A—L成A—Rf曲線，即薄層色譜掃描圖(簡(jiǎn)稱(chēng)掃描圖)。曲線上的色譜峰峰面積可用于定量分析。由于薄層板存在著明顯的散射現(xiàn)象，而使斑點(diǎn)中物質(zhì)的濃度與吸光度的關(guān)系不服從Beer定律，所以需田Kubelka—Munk(古柏爾卡—曼克)理論來(lái)描述。該方程式是薄層掃描法的定量分析基礎(chǔ)。定量校正方法可分為曲線校直法及非線性回歸法等。設(shè)薄板固定相的厚度為X,入射光的強(qiáng)度為I.,當(dāng)透過(guò)厚度x的的固定相后，照射在微分薄層厚度dx上的入射光強(qiáng)與反射光強(qiáng)分別為i和j時(shí)，如左圖。其入射光強(qiáng)的增量與反射光強(qiáng)的增量分別符合以下兩個(gè)微分方程：

在薄層掃描時(shí)，人們只是對(duì)進(jìn)入薄層和由薄層出來(lái)的光有興趣，也即上式的極端情況，x=0及x=X時(shí)對(duì)比兩圖很易發(fā)現(xiàn)，由于薄層固定相的散射作用使在透射法中所測(cè)得的斑點(diǎn)的吸光度產(chǎn)生正偏差，而在反射法測(cè)定時(shí)產(chǎn)生負(fù)偏差。這是因?yàn)檎丈涔獗簧⑸?，降低了透射率，吸光度增加；散射光增加了反射光光?qiáng)，增加了反射率，而降低了吸光度的緣故。其次，還可發(fā)現(xiàn)后圖比前圖的橫座標(biāo)大25倍，這說(shuō)明了反射法的靈敏度(響應(yīng)值)比透過(guò)法小。1·1Kubelka-Munk曲線校直Kubelka－Munk曲線說(shuō)明了薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度與其濃度間呈非線性關(guān)系，該曲線是薄層掃描法進(jìn)行定量分析的理論依據(jù)。曲線處理采用兩類(lèi)方法：曲線校直法及計(jì)算機(jī)回歸法(線性及非線性回歸)。CS系列儀器采用前者，CAMAG儀器采用后者方法。曲線校直法是根據(jù)薄層板的散射參數(shù)SX值，將Kubelka－Munk曲線校正為直線，簡(jiǎn)化A與KX間的關(guān)系，以利于定量分析。應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意：

曲線校直法是一種簡(jiǎn)便的薄層掃描定量校準(zhǔn)方法，但比較粗糙，且有時(shí)難于準(zhǔn)確知道薄層板的SX值。為了降低定量誤差，應(yīng)使標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰峰面積與待測(cè)品(供試品)的色譜峰面積盡量接近為好。2.薄層吸收掃描法的掃描方式及條件的選擇薄層吸收掃描法的掃描條件，包括掃描方式、波長(zhǎng)及測(cè)光方式等。掃描方式分為直線式及鋸齒式掃描。掃描波長(zhǎng)的選擇至關(guān)重要，不僅關(guān)系檢測(cè)靈敏度，而且關(guān)系干擾的排除等。測(cè)光方式分為透射式及反射式2.1掃描方式選擇(1)直線掃描直線式掃描是用一光帶先照射在薄層板的一端，而后作直線運(yùn)動(dòng)至另—端。在作直線式掃描時(shí)，實(shí)際上是光帶固定，薄層板相對(duì)于光帶作直線運(yùn)動(dòng)。在作直線掃描時(shí)，光帶的長(zhǎng)度對(duì)掃描后所得的色諾峰峰面積影響很大，下圖說(shuō)明了光帶越長(zhǎng)，所得的色譜蜂面積越小，反之則峰面積越大。光帶太長(zhǎng)，檢測(cè)靈敏度低，光帶太短，光帶只通過(guò)斑點(diǎn)的一部分，所得的蜂面積，不能真實(shí)反砍斑點(diǎn)的吸收情況。因此，正常掃描時(shí)，應(yīng)使光帶長(zhǎng)度略大于斑點(diǎn)直徑。在多斑點(diǎn)掃描的，光帶長(zhǎng)度略大于最大斑點(diǎn)直徑。為了降低定量誤差，應(yīng)使標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)的直徑與檢品斑點(diǎn)的直徑盡量接近。樣品斑點(diǎn)為帶狀時(shí)，光帶長(zhǎng)度應(yīng)約為樣帶的2/3。

不規(guī)則斑點(diǎn)，用直線式掃描定量，即使光帶長(zhǎng)度適宜，定量誤差仍然較大，因?yàn)樗梅迕娣e還與掃描方向有關(guān)。

綜上所述，直線式掃描較適用于規(guī)則圓形薄層色譜斑點(diǎn)及條狀薄層色譜斑點(diǎn)的定量分析。所能測(cè)定斑點(diǎn)的大小，以?xún)x器的光帶長(zhǎng)度為上限。例CS—930薄層掃描儀，出射狹縫最大長(zhǎng)度(高度)為6mm，只能測(cè)定小于6mm的斑點(diǎn)。在作直線式掃描叫，光帶的步進(jìn)距離ΔY也影響蜂面積。斑點(diǎn)小應(yīng)選小步進(jìn)距離，選擇適宜，能降低定量誤差。有關(guān)TLC及HPTLC板的光帶長(zhǎng)度及步進(jìn)距離的具體選擇見(jiàn)表。(2)鋸齒式掃描

用截面積為正方形的光束照射薄層板，光束的運(yùn)動(dòng)軌跡為矩齒形。CS系列的擺動(dòng)距閡最大為30mm，因此鋸齒式掃描適用于直徑小于30mm的斑點(diǎn)。

直線式掃在做鋸齒形掃描時(shí)，由于光束來(lái)回通過(guò)斑點(diǎn)，吸光度積分值比描大，重復(fù)性較好。鋸齒掃描還適用于不規(guī)則斑點(diǎn)的定量。雖然掃描方向不同時(shí)，所得的色譜峰形狀有差別，但積分值差別較小。機(jī)械鋸齒式描儀器掃描速度慢是其缺點(diǎn)，飛點(diǎn)掃描型儀器(如CS－9000型薄層掃描儀)則克服了此缺點(diǎn)。(3)雙校長(zhǎng)法的優(yōu)點(diǎn)

a.可以排除分離度不佳的兩個(gè)斑點(diǎn)間的相互干擾，能用于分離度不佳以至于完全重疊斑點(diǎn)的定量分析。

b.可以排除背景污染的干擾，使基線平直。

c.可以提高靈敏度。

d.可以改變色譜峰的倒正。

這些優(yōu)點(diǎn)的實(shí)現(xiàn)，主要取決于波長(zhǎng)對(duì)的選擇。

3·定量分析方法TLCS最常用的定量方法是外標(biāo)法，包括外標(biāo)一點(diǎn)法和外標(biāo)二點(diǎn)法。1外標(biāo)一點(diǎn)法標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)原點(diǎn)（截距為零）時(shí)可用外標(biāo)一點(diǎn)法定量。即只需一種濃度的對(duì)照品溶液，與供試液同板展開(kāi)，分別測(cè)定其峰面積A,即C待=A標(biāo)C標(biāo)/A待2外標(biāo)二點(diǎn)法該法是TLCS法中主要的定量分析方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過(guò)或一種濃度原點(diǎn)時(shí)只能用該法定量，至少需點(diǎn)兩種不同濃度兩種點(diǎn)樣量的對(duì)照品溶液，與供試液同板展開(kāi)，分別測(cè)定其峰面積A，用對(duì)照品求直線方程：A=Km+B,代入即得。例1山楂化滯丸中熊果酸的含量測(cè)定1、+H2O10ml溶解，濾過(guò)+H2O10ml洗滌，干燥至松軟粉末狀100℃烘干索氏提取法+乙醚適量加熱回流4h殘?jiān)兔眩?0~60℃）浸泡2次，5ml/次殘?jiān)?適量無(wú)水乙醇-三氯甲烷（3：2）混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移定容至5ml供試液

2、另取熊果酸對(duì)照品適量，精稱(chēng)+無(wú)水乙醇制成0.5mg/ml溶液對(duì)照品溶液3、精吸供試液6ul及對(duì)照品溶液4ul與8ul，分別交叉點(diǎn)于同一硅膠G板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（20:5:8:0.1）展開(kāi)，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在110℃加熱5~7min，至斑點(diǎn)顯色清晰，取出，在薄層板上覆蓋同樣大小的玻璃板，周?chē)媚z布固定，進(jìn)行薄層掃描，波長(zhǎng)波長(zhǎng)λs=535nm,λR=650nm,分別測(cè)量供試品與對(duì)照品A，計(jì)算即得.本品每丸含山楂以熊果酸（C30H48O3）計(jì)取本品3g,剪碎，精稱(chēng)例2香連丸中鹽酸小檗堿的含量測(cè)定測(cè)定法：取本品適量，研細(xì)，取約0.2g，精密稱(chēng)定，置索氏提取器中，加鹽酸-甲醇（1：100）的混合液適量，加熱回流提取至提取液無(wú)色，將提取液移至100ml量瓶中，用少量上述混合液洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加上述混合液至刻度，搖勻，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試液。另取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1ml含20ug的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密吸取供試液4ul、對(duì)照液2ul與6ul，分別交叉點(diǎn)于同一硅膠G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-水（4：2：1：1：0.2）為展開(kāi)劑，在另一槽中加等體積的濃氨試液，預(yù)飽和15min后，展開(kāi)，展距約10cm，取出，晾干，進(jìn)行熒光掃描，激發(fā)波長(zhǎng)：λ=366nm，測(cè)供試品熒光強(qiáng)度與對(duì)照品熒光強(qiáng)度的積分值，計(jì)算即得。本品每1含黃連以鹽酸小檗堿（C20H18ClNO4）計(jì)。例2香連丸中鹽酸小檗堿的含量測(cè)定置索氏提取器+鹽酸-甲醇（1：100）的混合液加熱回流至提取液無(wú)色轉(zhuǎn)移至100ml量瓶用混合液洗滌容器并入量瓶，至刻度精取10ml與50ml量瓶+甲醇至刻度供試液2、另取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精稱(chēng)+甲醇制成20ug/ml溶液對(duì)照品溶液3、精密吸取供試液4ul、對(duì)照液2ul與6ul，分別交叉點(diǎn)于同一硅膠G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-水（4：2：1：1：0.2）為展開(kāi)劑，在另一槽中加等體積的濃氨試液，預(yù)飽和15min后，展開(kāi)，展距約10cm，取出，晾干，進(jìn)行熒光掃描，激發(fā)波長(zhǎng)：λ=366nm，測(cè)供試品熒光強(qiáng)度與對(duì)照品熒光強(qiáng)度的積分值，計(jì)算即得。本品每1含黃連以鹽酸小檗堿（C20H