學(xué)習(xí)小禮包-3實(shí)驗(yàn)相關(guān)

10步填上免疫組織化學(xué)(IHC)的 標(biāo)本固 脫水、石蠟包埋和制 脫蠟和水 抗原修 滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物 封 一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí) 切片DAB顯 免疫組化分 免疫組化（IHC）全攻略（含 IHC的基石‖：原理及步 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分 IHC的疑難雜 電腦中有這兩個(gè)P就可以搞定 從0開始，準(zhǔn)確又快速利用Oligo7設(shè)計(jì)PCR引 Oligo7軟件安 找到目的序 設(shè)計(jì)引物序 分析引物并選 RNA反轉(zhuǎn)錄的六大要 RTPrimer的最佳選 RNA的二級結(jié) 去除 檢測RNA分子的完整 RNA定 兩步法或一步法RT- 數(shù)學(xué)不好的人是怎么做qPCR的？實(shí)驗(yàn)計(jì)算器在這 如何擬合Elisa標(biāo)準(zhǔn)曲 方法 方法 經(jīng)典 Primer Beacon 款 Primer3 ThePCR 快速獲取通 及登 和小伙伴一起記錄實(shí) 多終端協(xié) 群體結(jié)構(gòu)三劍客—structure入 Real-TimePCR引物設(shè)計(jì)案例版，誰看誰會 引物設(shè)計(jì)具體操作，以設(shè)計(jì)TP53引物為 引物設(shè)計(jì)原 單細(xì)胞分析工具的發(fā)展 工具雖好，還要謹(jǐn)慎選 circRNA研究必備之傻瓜攻略大 circRNA基本信息分析 ceRNA功能研究數(shù)據(jù)庫 circRNA人疾病相關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫 circRNA組織特異性分布數(shù)據(jù)庫 circRNA編碼蛋白數(shù)據(jù)庫 預(yù)測結(jié)合靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫 Primer6安裝、、引物設(shè)計(jì)攻 安裝引物設(shè) 驗(yàn)證引 設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物方 一、 二、 Western-Blot之磷酸化蛋白一步一步教你做WB圖，超簡單?。ê健⒐ぞ吆退夭?熒光定量PCR的秘 模板制作,小便宜別去 引物印證這一步，別小 我為什么選用96孔板 程序設(shè)置，聽說明書，還是機(jī)器設(shè)定 如何優(yōu)雅地獲得漂亮小分子蛋白條 10步填上免疫組織化學(xué)(IHC)免疫組織化學(xué) (Immunohistochemistry，IHC) 或免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry,ICC)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些多肽和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進(jìn)行原位定性、定位或定量研究的實(shí)驗(yàn)技術(shù)?？傮w來說IHC的實(shí)驗(yàn)流程和方法并不難，但做出漂亮的染色結(jié)果卻不那么容易，在IHC實(shí)驗(yàn)中許多細(xì)節(jié)也也值得注意。那么細(xì)節(jié)主要是哪一些呢？且聽標(biāo)本固固定（Fixation）是使用化學(xué)試劑處理組織或細(xì)胞，的目的除了使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固，減少或終止內(nèi)源性或外源性細(xì)胞內(nèi)分解酶的反應(yīng)，防止組織細(xì)好的固定劑具有滲透性強(qiáng)；其次不能使組織發(fā)生過度收縮變形；還需使組織得到一定的硬度，有較好的折光度。固定劑多種多樣，例如無水對糖原保存較好，容易使細(xì)胞收縮，其性能與95%相似，很少單獨(dú)使用，一般只用于糖原的固定不同的抗原對固定液耐受程度不同。為易揮發(fā)的無色液體，有刺激性氣體。可使蛋白質(zhì)沉淀，滲透性強(qiáng)，細(xì)胞收縮嚴(yán)重，對核的固定差廣泛用于酶組織化學(xué)中的各種酶的固定，也有人用于抗原的保存，作為細(xì)胞涂片免疫組化的固定液。此外，有些固定劑對特殊組織有更好效果，如對于頭皮、指甲固定有軟化效果，戊二醛（含有兩個(gè)醛基，具有很強(qiáng)的交聯(lián)作用）常用于電鏡標(biāo)本的固定，使用濃度為2.5%，PLP固定液（Periodaysine-paraformaldehyde，由過碘酸、賴氨酸和多聚混合組成的磷酸鹽緩沖液）對于含糖組織抗原保存更好。如上所述我們需要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的固定劑。目前常用的固定劑有中性液（飽和水溶液稱為福爾），4%多聚-磷酸鹽緩沖液。多聚固定效果溫和，廣泛應(yīng)用于免疫組織化研究。能夠以固體的形式存在，即白色粉末狀的多聚。將多聚溶于PB，加熱至60℃（加熱可使多聚解聚為單體，必要時(shí)可滴加少量NaOH促進(jìn)其溶解），加熱攪拌至液體透明為止。固定方法多種多樣，常用的有法、灌注法、原位法、滴片法、蒸汽法、微波法等，其中以固定和灌注固定效果最好。灌注固定中將灌注針主動脈內(nèi)是灌注固定的關(guān)鍵，也是難點(diǎn)。首先準(zhǔn)確找到主動脈，這是此步驟的要點(diǎn)?？捎脺厣睇}水將胸腔內(nèi)的血液沖洗干凈，用眼科鑷子輕輕心外膜（夾的越少越好，以免影響取材）將心臟向左上方提起，即可看清主動脈，又可使灌注針很容易地主動脈內(nèi)。時(shí)動作要慢，針尖方向不要偏向右側(cè)，以免刺入右心房，如果感到有阻力，則將針退后、調(diào)整方向重新進(jìn)針，直到進(jìn)入主動脈，灌注針進(jìn)入主動脈后可在心臟的上方看到其位置，灌注針進(jìn)入主動脈的長度最好為3-5毫米。網(wǎng)上有很多方法學(xué)在此推薦給大家：JournalofVisualizedNatureProtocols 脫水、石蠟包埋和制片脫水是指使用脫水劑置換組織中的水分使標(biāo)本內(nèi)處于無水狀態(tài)，具體是用梯度乙醇(由低到高)充分脫水，對于一些易脆的組織（如脾、肝臟等）應(yīng)減少高濃度里的停留時(shí)間，透明的時(shí)間也應(yīng)該控制縮短。對組織浸蠟時(shí)，一般選用56℃-58℃的石蠟，石蠟液與標(biāo)本的比例應(yīng)該為（20-30）：1，浸蠟溫度最好不超過60℃，防止抗原的損失。包埋是指將已石蠟的組織塊置入包埋模具內(nèi)，包埋應(yīng)選好角度動作迅速，以便切片時(shí)有完整的切面。切片時(shí)則要該快則快該慢則慢，及時(shí)檢查刀片是否出現(xiàn)缺口，最好使用新刀片以防止蠟帶出現(xiàn)劃痕。包埋后需要快速冷卻，使標(biāo)本與石蠟在短時(shí)間內(nèi)凝聚成密度一致的一個(gè)整體。脫蠟和水化切片分別在二甲苯中10-15分鐘以脫掉組織中的石蠟，使組織恢復(fù)到固定后的正常狀態(tài)出抗原以方便與一抗結(jié)合。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景。脫蠟的效果主要是取決于切片的厚度、二甲苯的溫度、脫蠟時(shí)間，或移入恒溫箱加熱脫蠟。水化的目的是為了洗去溶解的石蠟和二甲苯。二甲苯屬于非水溶液的有機(jī)溶劑，進(jìn)入組織中的二甲苯不能與水溶性染色液相溶，需要通過梯度乙醇把組織中的二甲苯逐步替換出來，使標(biāo)本切片從無水狀態(tài)順利進(jìn)入染色液中進(jìn)行抗原修復(fù)是指抗原被封閉或隱藏的表位，恢復(fù)其原有的空間狀態(tài)，提高抗原陽性檢出率的過程。由于組織在或多聚固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新，提高抗原檢測率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓加熱修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。其中高壓加熱修復(fù)這一方法簡便易操作，效果也更好。胰酶消化修復(fù)法主要用于細(xì)胞內(nèi)的抗原修復(fù)。使用0.1%氯化鈣（pH7.6）制成0.05%-0.1%胰酶液，37℃孵育切片15-30分鐘，陳片應(yīng)當(dāng)適當(dāng)延長時(shí)間。使用高壓加熱修復(fù)對于修復(fù)溫度（92-98℃以上）和時(shí)間的把握十分重要，溫度越高修復(fù)時(shí)間越短，溫度與修復(fù)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。修復(fù)結(jié)束后注意室溫冷卻，讓蛋白自然復(fù)性。其次，盡量使用過量的抗原修復(fù)液，防止高溫液體揮發(fā)干涸，對切片造成不可逆的損傷。滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在傳統(tǒng)的親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法（ABC法）和鏈霉親和素-過氧化物酶法（SP法）中，免疫組化反應(yīng)容易受到內(nèi)源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活和封閉。滅活內(nèi)源性過氧化物酶一般用3%過氧化氫滅活約10分鐘左右，用甲醇配制過氧化氫更適合于保封閉與免疫熒光技術(shù)一樣，使用10%與第二抗體同種屬都的正常進(jìn)行封閉，目的為了防止一抗與組織的非特異性結(jié)合，造成假陽性。一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間不同的一抗?jié)舛雀鶕?jù)抗體說明書而定，孵育時(shí)間和溫度等對染色結(jié)果往往有著較大的影響。在4℃下，反應(yīng)緩慢，背景較淺，推薦使用。二抗一般室溫孵育30分鐘。如何選擇一抗呢？在此給大家推薦一個(gè)好的人類蛋白圖譜（TheHumanproteinatlas,HPA），為。界面如下：TheHumanproteinatlas數(shù)據(jù)庫免費(fèi)提供全部24,000種人類蛋白質(zhì)的組織和細(xì)胞分布信息，快來看看你要研究的蛋白在哪個(gè)富集，在哪個(gè)細(xì)胞定實(shí)驗(yàn)難做很大程度上是總找不到好用的抗體，文獻(xiàn)用得很好的經(jīng)典抗體如給大家介紹一個(gè)好用的抗體查找 為什么要推薦使用CiteAb尋找抗體或者試劑呢？CiteAb擁有全球最大的試劑和引文數(shù)據(jù)庫，可從181多家供應(yīng)商中搜索4014509萬種抗體；其次CiteAb按照引文數(shù)量（高達(dá)1464705）對試劑進(jìn)行方便我們查找最優(yōu)抗體；CiteAb不僅可以查詢抗體也可以查找化學(xué)試劑；CiteAb列出了抗體對應(yīng)的文獻(xiàn)，方便我們根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。舉個(gè)例子，搜索Iba1（中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物關(guān)于Iba1可以查找到高達(dá)525在眾多產(chǎn)品中如何找到最適合自己的那一款？CiteAb可以對結(jié)果進(jìn)行CiteAb根據(jù)引文數(shù)量對抗體進(jìn)行了排序，Abcam的Iba1抗體引文高286，其次是Proteintech點(diǎn)擊可查看使用該抗體的文獻(xiàn)希望CiteAb會成為我們的科研小助手切片PBS洗滌是為了去除未反應(yīng)的抗體和其他雜物，以減少非特異性反應(yīng)引起的背景和雜物污染，因此應(yīng)該充分洗滌，特別是一抗孵育后。一般使用PBS洗滌3次，每次5分鐘。DAB顯色DAB顯色液（3,3‘-二氨基聯(lián)苯胺）終產(chǎn)物為棕黃色或棕褐色，為免疫組化最常見的的顯色液。DAB顯色的棕黃原穩(wěn)定性好，不溶于，可長期保存而不褪色。背景的深淺和特異性染色的深淺都可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而背景較淺時(shí)即可沖洗。DAB顯色時(shí)間很短(如幾秒或幾十秒)就立即出現(xiàn)很深的棕褐色，這可能說明一抗?jié)舛冗^高，需要適當(dāng)下調(diào)抗體濃度；若很短時(shí)間就出現(xiàn)深背景，有可能非特異性蛋白封閉不全，需要延長封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長(如超過10分鐘)才出現(xiàn)陽性染色，可能是一抗體濃度過低或者封閉時(shí)間過長。貼片后梯度脫水透明中性樹脂封片后拍片即可。免疫組化分析常用的圖像可對組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果結(jié)果進(jìn)行定量分析。常用的圖像有OSIRIS/GSAImageyser、Imagej、ImageProPlus（IPP）等。Imagej是NIH開發(fā)的一款在生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用十分廣泛的費(fèi)軟件，地址 。該軟件的顯著優(yōu)勢是開源免費(fèi)，不受電腦系統(tǒng)（官網(wǎng)提供適用不同操作系統(tǒng)的版本）的限制且功能強(qiáng)大。給大家一個(gè)基于Imaegj的免疫組化分析：IHCProfiler。 插件免費(fèi)地址：IHCProfiler由文獻(xiàn)可知，胞漿的IHC讀入后可快速得到自動評分結(jié)果對于細(xì)胞核的IHC計(jì)算ScoreScore有四個(gè)等級，分別為4/3/2/1，HighPositve為4分，Positive為3LowPositive2分，negative1分。軟件如下：1、打開ImagejFile，Open，打開胞漿的2、點(diǎn)擊Plugins，點(diǎn)擊IHCProfiler詢問是否是胞漿，下拉可選擇核，此處選擇胞漿，點(diǎn)擊OK，進(jìn)入以下界面，選擇HDAB點(diǎn)擊OK。得到結(jié)果為High而對于胞核，操作略微不同1、打開Imagej軟件，打開胞 2、點(diǎn)擊Plugins，點(diǎn)擊IHCProfiler，進(jìn)入以下界面，選擇胞核同上選擇HDAB調(diào)節(jié)Threshold閾值選中所有核，點(diǎn)擊Plugins，選擇IHCProfilerMacro，免疫組化（IHC）全攻略（含對于實(shí)驗(yàn)狗而言，實(shí)驗(yàn)是專業(yè)進(jìn)階的，刷實(shí)驗(yàn)?zāi)鞘潜貍浼寄?。在科研大世界中，?shí)驗(yàn)方法總是層出不窮，而免疫組化（IHC）作為經(jīng)典中的經(jīng)典，自然是實(shí)驗(yàn)狗必備的技能之一?，F(xiàn)在，小魚就把IHC的全攻略給大家。IHC的“基石”：原理及步驟師兄們，做實(shí)驗(yàn)時(shí)最基礎(chǔ)的就是深刻的銘記原理，如此在實(shí)驗(yàn)的階段才能真正做到胸有成竹。簡單來說，免疫組化就是一項(xiàng)利用抗原抗體反應(yīng)來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原和對蛋白定位、定性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。各位小伙伴們可以通過下面的對免疫組化有個(gè)大致的了解。接下來，重點(diǎn)來了，下面是小魚多年總結(jié)的免疫組化步驟和經(jīng)驗(yàn)，各位看官千萬不要錯(cuò)過哦！免疫組化的標(biāo)本主要是組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類。組織標(biāo)本中包括石蠟切（標(biāo)本制作的首選方法和冰凍切片。一般而言，石蠟切片要求薄厚均勻，切片完整，且無褶無刀痕，相當(dāng)考驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的刀工，在此小魚真心建議大家找專業(yè)培訓(xùn)過的或公司進(jìn)行切片。當(dāng)然，你也可以在解螺旋里回復(fù)切片‖，石蠟切片的煉成方法。1）脫蠟與水化：將石蠟切片放置于60°烤箱烤片30-60min，這一步是為了使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化，好讓組織切片牢固地貼在玻片上。而后依次將其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min，水洗5min（不要直接對著切片沖洗）。PBS洗3次，3min/次。）（40mlPBS+120ulTritonX-100+400ul30%H2O2）浸潤切片30min（RT避光），降低內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗3次，3min/次。3）抗原修復(fù)：由于制作石蠟切片時(shí)，固定使得蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用從而失去抗原性，這一步就是讓胞內(nèi)的抗原決定簇重新滿血‖。小魚常用的是微波修復(fù)，pH6.0的0.01M檸檬酸鈉緩沖液浸泡切片，在微波爐里高火4min至沸騰后，取出自然冷卻至室溫，重復(fù)2次，每次補(bǔ)足液體以免干片。（當(dāng)然有的朋友用酶修復(fù)法也是可以的）。PBS3次，3min/4）封閉：用與二抗同一來源的封閉一些非特異性結(jié)合位點(diǎn)。此時(shí)可用‖的油性筆圍繞組織畫圈，并對圈內(nèi)的組織滴加稀釋好的，37℃溫箱中30min,用濾紙吸去多余的。孵育一抗：對圈內(nèi)的組織（面積為1×1）滴加稀釋好的一抗20ul，4℃過夜或者37℃1-2h。PBS3次，3min/次。（一般4℃過夜后，需要將切片放置37℃復(fù)溫45min，防止脫片以及可使抗原抗體結(jié)合的更穩(wěn)定）孵育二抗：對圈內(nèi)的組織（1120ul371-2h，PBS洗3次，3min/次。切片顯色：用DAB-H2O2顯色10min，顯色液最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，此時(shí)要通過顯微鏡觀察染色是否明顯，10min內(nèi)即可用蒸餾水終止顯色。復(fù)染及封片：為了形成細(xì)胞輪廓，更好的定位目標(biāo)蛋白，可用Mayer蘇木素染色30s，水洗，鹽酸分化2s，流水浸入15min。脫水時(shí)，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）2min。二甲苯5min使切片透明化，最后加入中性樹膠封片（一般封片后最好立即拍照，若不拍照，可用指甲油封固并保持好避光和濕度）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析至此，我們才千辛萬苦地染出了一張張漂亮的免疫組化片子，可是如果不知道如何對片子進(jìn)行正確地分析，進(jìn)而得出理想的結(jié)果，也實(shí)在是一件憾事。為了幫大家分憂解難，在此，小魚將免疫組化結(jié)果分析的獨(dú)門絕招獻(xiàn)上，請大家不要眨眼嘍。必設(shè)對照組。如、陽性及自身對照由表中可知，只有6、7實(shí)驗(yàn)結(jié)果有意義。1-5均因?qū)φ战M的結(jié)果已否定抗體的特異性或因ICH技術(shù)操作存在錯(cuò)誤等而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果失去意義，則必須重復(fù)抗原表達(dá)必須在特定部位，如LCA應(yīng)定位于細(xì)胞膜上，CK應(yīng)定位于細(xì)胞漿內(nèi)，PCNA及P53蛋白應(yīng)定位于細(xì)胞核內(nèi)等等。半定量?，F(xiàn)在一般用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量。但如果你的里不幸沒有那么高大上的儀器的話，就只好趕鴨子上架，用肉眼定一下量了。由于人為性較強(qiáng)，故稱為半定量。免疫組化的半定量一般分為三級：弱（+），中（++），強(qiáng)（+++）。以綠色免疫熒光為例，則表現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱（+）=1，中（++）=2，強(qiáng)（+++）=3。至少隨機(jī)觀察5-10個(gè)HPF。然后根據(jù)（+）%x1+（++）%x2+（+++）%x3計(jì)算出數(shù)值；總數(shù)值<1.0者為（+），1.0-1.5者為(++),>1.5者為(+++)圖像分析儀進(jìn)行精確定量。在此強(qiáng)烈推薦一款圖像：ImageJ。舉個(gè)栗子，我們有一張細(xì)胞的免疫熒光染色的。那么，如何用Image首先，要把彩色的圖像轉(zhuǎn)換成黑白圖像。步驟如下：Image→Type→16-bit。轉(zhuǎn)換成黑白圖像后，將要計(jì)數(shù)的部分用高亮標(biāo)示出來。步驟如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖動鼠標(biāo)，直到所有的細(xì)胞被標(biāo)示出來。有時(shí)候2個(gè)細(xì)胞靠得比較緊密，會被計(jì)數(shù)為1個(gè)細(xì)胞。這個(gè)時(shí)候可以采用ImageJ的水洗功能。步驟如下：Image→Binary→Watershed。如下圖的藍(lán)色箭頭所示，這些是本來計(jì)數(shù)成一個(gè)的細(xì)胞，經(jīng)過水洗之后，更加精確地被計(jì)數(shù)成了2個(gè)細(xì)胞。 yzeParticles。在得出最后的結(jié)果之前，還有一些選項(xiàng)需要選擇。如果想要計(jì)數(shù)全部的細(xì)胞，那么Size項(xiàng)里面選擇―-0infinity‖。Circularity的默認(rèn)值為0.001.00‖。一般就取默認(rèn)值。最后的結(jié)果如下圖所示。軟件自動測量了每個(gè)細(xì)胞的大小。這里因?yàn)槭嵌S圖像，所以就是每個(gè)細(xì)胞的面積。然后計(jì)數(shù)了一共有72個(gè)細(xì)胞，總面積為21286.00，平均大小為295.64。IHC獲得漂亮的可以見的免疫組化。那么在進(jìn)行免疫組化的實(shí)驗(yàn)過程中，到底有哪些靜待實(shí)驗(yàn)新手跳進(jìn)去的陷阱呢？一般而言，免疫組化的染色失敗時(shí)，無非會出現(xiàn)以下4種情況：1）所染的全部切片均為，包括陽性對照在內(nèi)。2）所有的切片均呈陽性反應(yīng)。3）所有切片背景過深。4）陽性對照染色良好，檢測的陽性標(biāo)本呈反應(yīng)。另外，小魚也總結(jié)出了做免疫組化會產(chǎn)生非特異性染色結(jié)果的8個(gè)大坑及避抗體問題，別嫌貴，一分價(jià)錢一分貨！一抗用多克隆抗體容易出現(xiàn)非特異性染色，建議用高純度，高效價(jià)，特異性高的單克隆抗體來解決。單克隆抗體很貴，不過結(jié)果真的很好。畢竟一分價(jià)抗過期也會造成悲劇，因而要注意抗體的有效期。抗體濃度過高/當(dāng)一抗?jié)舛忍邥r(shí)，可通過做預(yù)實(shí)驗(yàn)來摸索出抗體最理想的工作濃度，不能簡單地按照說明書來用。若是抗體孵育時(shí)間過長，可在加上抗體后，立刻調(diào)好定時(shí)器，提醒自己及時(shí)終止反應(yīng)，就會避免這個(gè)問題。DAB染色時(shí)間太長/DAB的顯色時(shí)間不是一成不變的，主要靠實(shí)驗(yàn)者在顯微鏡下盯著，一旦出現(xiàn)淺淺的棕色的時(shí)候，就要馬上沖洗。出現(xiàn)棕色的時(shí)間過短，表明抗體濃度過高；出現(xiàn)棕色的時(shí)間過長，表明抗體濃度過低。DAB要保存于避光干燥的地方，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前才加入H2O2。圖1就沖洗的有些晚了；圖2就是剛剛好，染色效果噠!一些內(nèi)源性酶生物素含量豐富的組織，如肝臟，腎臟，脾臟等在做免疫組化時(shí)極易產(chǎn)生非特異性染色。此時(shí)可將左旋咪唑（24mg/ml）加入底物液中，并保持PH值在7.6-8.2，即能滅活大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶；而對于酸性磷酸酶，可用50mmol/l的酒石酸來抑制；對于內(nèi)源性過氧化物酶，可以用0.9%的雙氧水來滅活。對于內(nèi)源性生物素，染色前將切片浸于25μg/ml親和素溶液中15min，PBS15min后即可染色；也可以用24mg/ml的卵白素封片15min。一下子染太多片子的時(shí)候，容易出現(xiàn)這種情況。此時(shí)，要謹(jǐn)記貪多嚼不爛，一次少染幾張。另外要讓試劑充分覆蓋組織，超出組織邊緣2mm。然后用PAP筆在組織周圍畫一個(gè)圈圈（圈圈應(yīng)該距離組織邊緣3-4mm），把修復(fù)液圈在里面，可避免修復(fù)液流走。切片在緩沖液或修復(fù)液里面浸泡過夜，也會引起悲劇。這都是偷懶的做法，但是有時(shí)候也是可以偷一下懶的。只要把容器放在4°C冰箱里，過夜那就完一定要充分。PBS液一定要雙蒸水新配，用之前再次測PH值。緩沖液用0.05mol/L的Tris-HCL，0.15mol/L的NaCl即可。如果加一點(diǎn)去垢劑Tween-20就更好了。封閉問是否選擇了正確的封閉。原則是選擇二抗動物的非免疫，例如二抗是羊抗兔，就要選擇非免疫羊。用PS稀釋為3-10%的溶液孵育切片，37°C10-30分鐘。這里不用洗，直接甩掉即可。當(dāng)然直接用5%的脫脂奶粉也是可以的，而且效果還是不錯(cuò)的。電腦中有這兩個(gè)P就可以搞定1PPT()匯報(bào)結(jié)果時(shí)會發(fā)現(xiàn)，這個(gè)軟件一樣可以處理WB1、將剪切好的WB到PPT中2、同時(shí)選中兩種，點(diǎn)擊組合3、點(diǎn)擊，選擇文本框，將蛋白名稱標(biāo)注好4、再如下圖添加各自條帶所對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)分組，文本框，在文本框中輸入文字，注意文本框可自由旋轉(zhuǎn)，點(diǎn)住下圖所示的旋轉(zhuǎn)按鈕拖動即可。567、全選之后，右鍵另存為，即可使用2第二種方法就是用PS軟件處理WB1、新建一個(gè)畫布，打開已經(jīng)剪切好 2、將剪切好的拖曳到畫布中，這里注意要圖層才能拖曳到畫布3、這里可以發(fā)現(xiàn)，兩條條帶長度不一，我們現(xiàn)在調(diào)整一下較短的條帶，選中你要調(diào)整的所在的圖層，點(diǎn)擊編輯，自由變換（Cr+）,會看到想要調(diào)整的已經(jīng)被選中。4、拖曳到合適，點(diǎn)擊對號5、點(diǎn)擊編輯>6、添加文字，注明各條目的條帶代表的蛋白和實(shí)驗(yàn)分組情況，同時(shí)可點(diǎn)擊編輯，自由變化，調(diào)整字體方向。6、大功告成，點(diǎn)擊文件>保存，這里要注意的是保存為PSD格式方便后續(xù)再修改，但是投稿給的格式，都是TIFF。注意，這里的只是對條帶結(jié)果進(jìn)行一定的美化，看上去更清楚。但也請僅限于此，不要對條帶進(jìn)行剪切等改變研究結(jié)果的操作，否則十分嚴(yán)重。從0開始準(zhǔn)確又快速利用Oligo7設(shè)計(jì)引PCR只要把引物設(shè)計(jì)的好，實(shí)驗(yàn)簡直易如反掌，酸談里貓大其實(shí)已經(jīng)很詳細(xì)地講解了基于Oligo6的引物設(shè)計(jì)，我個(gè)人覺得Oligo7設(shè)計(jì)引物也不錯(cuò)，為此一下零基礎(chǔ)版的Oligo7引物設(shè)計(jì)。Oligo7軟件安為防止大家和我以前一樣在網(wǎng)上軟件，我提供一個(gè)無毒版（點(diǎn)擊閱讀原文即可）。解壓后，點(diǎn)擊開始安裝，安裝完后，點(diǎn)擊桌面的Oligo7圖標(biāo)，彈出OLIGO7CustomerRegistration‖界面，此時(shí)你需要點(diǎn)擊安裝包內(nèi) 就會彈出Oligo7.0Keymaker‖界如圖一左，將OLIGO7CustomerRegistration‖界面上原有的Workstation數(shù)字粘貼到Oligo7.0Keymaker‖內(nèi)的Workstation，然后點(diǎn)擊GenerateAccess數(shù)字,Access數(shù)字粘貼回OLIGO7CustomerRegistration‖相應(yīng)位置，單擊ConfirmCode‖按鈕即可完成。找到目的序找到目的序列才能針對設(shè)計(jì)引物，如果有同源蛋白還需要查找目的基因CDS序列取交集。以我研究的大鼠AQP1為例，先打開NCBI，選擇ne數(shù)據(jù)庫，輸入名字Search‖彈出圖二左，點(diǎn)擊下方AQO1‖進(jìn)入新界面，下拉點(diǎn)擊右側(cè)‖RefSeqRNAs‖，如圖二右。新界面下拉，出現(xiàn)圖三左，點(diǎn)擊―CDS‖出現(xiàn)圖三右，途中棕域序列，即為我們目的的CDS序列。當(dāng)然，如果沒有同源蛋白的問題，你可以直接所有序列進(jìn)行分析。設(shè)計(jì)引物序列打開Origin7，點(diǎn)擊File‖下拉菜單里的NewSequence‖,將序列粘貼在窗口里如圖四，點(diǎn)擊―√‖就可以進(jìn)入分析界面。新界面里點(diǎn)擊Search‖點(diǎn)擊―forPrimers&Probes‖如圖五左上，然后界面彈出圖五右上，點(diǎn)擊Parameters‖和Ranges‖，根據(jù)反應(yīng)條件設(shè)置參數(shù)，一定要修改引物長度，防止引物過短，我修改為圖四下，然后點(diǎn)擊Search‖就可以自動得到結(jié)果Oligo7自動給出了可能的引物對，只需要點(diǎn)擊右側(cè)框內(nèi)Score，引物按軟件認(rèn)為的優(yōu)劣進(jìn)行排序，你可以看到引物的關(guān)鍵信息，比如長度，Ta值，GC分析引物并選擇選擇一條引物，點(diǎn)擊上方 yze‖，然后點(diǎn)擊―Keyinfo‖內(nèi)的SelectedPrimers‖，會彈出兩條引物的序列和其他概括信息如圖七。這里需要確保|3`△G|≤9kcal/mol，以防止在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)引起DNA聚合反滿足圖七后，要繼續(xù)進(jìn)行6項(xiàng)分析以確保自己的引物是最合適的，這6項(xiàng)我在圖八中已經(jīng)標(biāo)識，我接下來將結(jié)合自身經(jīng)驗(yàn)逐一細(xì)講。為了防止引物之間相互形成二聚體，我們需要點(diǎn)擊DuplexFormation‖分析ForwardPrimer‖,Reverse Primer‖，確△G≤4.5kcal/molhydrogenbonds≤3，如圖九右求穩(wěn)的話還要分析UpperOligo‖和LowerOligo‖,那樣可以上下游引物之間形成二聚②發(fā)卡結(jié)構(gòu)分析：為了發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成，需要選擇菜單內(nèi)HairpinFormation‖，分析ForwardPrimer‖,―ReversePrimer‖同①一樣要確?！鱃≤4.5kcal/mol，hydrogenbonds≤3③堿基組成Tm點(diǎn)擊圖八中的3的Composition&Tim‖分析，按規(guī)矩需要控制上下游引物GC含量在40%-60%，上下游引物GC含量也不可以差太大，但其實(shí)實(shí)際中，引物GC含量70%我也擴(kuò)成功過，上下游引物GC含量差10%也可以做，所以請根據(jù)自己實(shí)際情況抉擇，在Oli'go7里分析的結(jié)果給出的參數(shù)很多，你只要看我圖十左里紅圈的兩個(gè)參數(shù)即可。④錯(cuò)誤位點(diǎn)：點(diǎn)擊FalsePrimingSites‖即可以分析。個(gè)人感覺實(shí)踐中意義不大，因?yàn)橥_概率很高如圖十右，錯(cuò)誤概率即使達(dá)到130問題也不大，所以大家這里自己抉擇吧。⑤PCR總覽如果你的引物有太明顯的問題，在這個(gè)界面的Comments‖者更換引物。如果沒有，則會和圖十一左Comments‖內(nèi)為空白，你只需要根據(jù)這里提供的Tm值，然后減5，就是你設(shè)計(jì)的這條引物的退火溫度。⑥內(nèi)穩(wěn)定上述分析完后，點(diǎn)Internalstability‖這個(gè)選項(xiàng)，最好彈出來的曲線圖像如圖十二：中間高兩邊低的弧形，這樣的引物穩(wěn)定性高，成功概率更高，其實(shí)實(shí)踐中如果做不到問題也不是很大。Oligo7設(shè)計(jì)引物經(jīng)驗(yàn)就到這里為止了，如果你覺得過程太繁瑣，也可以選擇評價(jià)并修改他人設(shè)計(jì)好的引物，這個(gè)方法以后有機(jī)會再講啦！RNA反轉(zhuǎn)錄的六大要老話說的好，萬事開頭難。而這話在RT-PCR中則體現(xiàn)的淋漓盡致，其開頭的第一步——將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，表面上看似簡單，實(shí)際上則暗潮洶涌，指不定就在哪里挖個(gè)坑，就會讓斗志高昂的實(shí)驗(yàn)汪們摔的鼻青臉腫，而且還不知道是咋掉坑的。顯然，RNA的反轉(zhuǎn)錄成功，不是想有就能有。大家之所以屢敗屢戰(zhàn)、屢戰(zhàn)屢敗，就是因?yàn)楹雎粤艘韵逻@6個(gè)必備要素，不然此坑早就被填平，又何至于整日里悲催的實(shí)驗(yàn)結(jié)果唉聲嘆氣呢？RTPrimer的最佳通常RTprimer可分為三類：oligodT，隨機(jī)引物以及特異性引物。OligodT引物之所以應(yīng)用范圍更加廣泛，是因?yàn)榭捎纱双@得mRNA的全長然而如mRNA長度過長4kb，或者沒有polyA（mRNArRNA就需要考慮使用隨機(jī)引物進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄。隨機(jī)引物雖能確保長的5‘末端的轉(zhuǎn)錄，但并不能獲得整個(gè)全長的cDNAs，且對RNA樣品質(zhì)量要求比較高，此時(shí)可用6-8個(gè)核酸聚合體來提高cDNAs的合成量。而對于真核生物的qPCR，長隨機(jī)引物和Oligo-dT引物的混合物似乎能給出一個(gè)漂亮的結(jié)果。針對此類優(yōu)化混合引物，已有兩家公司的試劑盒或可助大家：QiagenTectRev.TranscriptionKit和BioRadiScript第三個(gè)選擇就是特異性引物，僅擴(kuò)增需要的cDNA，適用于目的序列已知的情況。通常在一步RT-PCR法中可使用此類引物，因?yàn)樵撘镆部捎米鳛镻CR中的反向引物。RNA的二級結(jié)構(gòu)若要獲取全長RNA的反轉(zhuǎn)錄，那么RNA二級結(jié)構(gòu)的問題就不可忽略，因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄酶在遇到此類結(jié)構(gòu)后會終止反應(yīng)或從模板上脫落下來。也許你很難判斷RNA是否具有二級結(jié)構(gòu)，但如果中GC含量較高，通常意味著RNA很難被變性且不可能是單鏈，此時(shí)就需要在65℃5min對其進(jìn)行充分變性，以避免其對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。另外，還有法可解決此問題，即使用一種最適溫度高于正常標(biāo)（37℃-42℃）的逆轉(zhuǎn)錄酶。比如來自LifeTechnologies的Themoscript酶就常用于具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)RNA的逆轉(zhuǎn)錄。當(dāng)然也存在一些即使在常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄溫度（37℃-42℃）的條件下，也能跨過RNA二級結(jié)構(gòu)的高效率逆轉(zhuǎn)錄酶，即使是針對富集GC序列的RNA也能得到很好的結(jié)果，如Qiagen公司的逆轉(zhuǎn)錄酶Omniscript和Sensiscript，以TakaraBio公司的PrimeScirptRTenzyme。RNA中存在的組DNA（gDNA）污染可能是最終PCR反應(yīng)中假陽性結(jié)果出現(xiàn)的原因，目前已存在很多方法去除gDNA，比如通過DNAase對提取的RNA進(jìn)行預(yù)處理。以上方法無可避免會造成RNA的蛋白污染，因而這里介紹一種可繞開酶處理的方法，即針對RNA設(shè)計(jì)一種包含內(nèi)含子或內(nèi)含子-外顯子邊界的引物，如此DNA就不會產(chǎn)生擴(kuò)增抑或即便擴(kuò)增了其條帶大小也與cDNA不但值得注意的是，使用該方法時(shí)中要沒有假存在，假（pseudogene）是到組中剪切mRNA的DNA拷貝，否則也會產(chǎn)而對于沒有內(nèi)含子的原核RNA，gDNA的去除則更是表達(dá)準(zhǔn)確測量的一個(gè)至關(guān)重要的因素。使用DNAase處理RNA是唯一的方法，tectRev.TranscriptionKit中所包含的gDNA清除緩沖液就可在無需加熱或EDTA失活的條件下降解DNA。此外，具有g(shù)DNAEraser（TakaraBio）PrimeScriptRT試劑盒也可去除gDNA，且能在不到20分鐘之內(nèi)快速完成RNA的cDNA合成。RNA分子的完，RNA質(zhì)量對cDNA合成結(jié)果會產(chǎn)生重要的影響，而不同批次間RNA質(zhì)量差異也導(dǎo)致RT-PCR產(chǎn)生不同的結(jié)果。所以在進(jìn)行RT-PCR前，應(yīng)該檢查RNA條帶的質(zhì)量，可通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。通常完整的真核RNA應(yīng)包括28S和18SRNA條帶，且較大的條帶的強(qiáng)度應(yīng)是較小條帶的兩倍左右，另外兩個(gè)條帶強(qiáng)度大致相同也是可以的。而另一種準(zhǔn)確測量RNA質(zhì)量的方法是使用AgilentBiozyer儀器，它可將RNA分子可視化并能在分析RNA完整數(shù)值（RNAIntegrityNumber，RIN后給出一個(gè)質(zhì)量的量化標(biāo)準(zhǔn)。RIN為8-10，則表示RNA質(zhì)量非常好；當(dāng)RIN值低于7，則說明RNA可能有降解，可能會導(dǎo)致一些罕見信息的RNA定量除了掌握RNA的完整性之外，準(zhǔn)確評估產(chǎn)量也很重要。產(chǎn)量的準(zhǔn)確性會受到以下因素的影響：測量儀器的準(zhǔn)確性、DNA的污染、鹽的污染以及降解程度。而為了準(zhǔn)確測量產(chǎn)量，小編我更喜歡使用Nanodrop進(jìn)行UV該儀器不需要稀釋樣品，并且具有非常寬的測量RNA的范圍。以小編的經(jīng)驗(yàn)，它可以準(zhǔn)確到10ng/ul。而傳統(tǒng)的紫外分光光度法應(yīng)避免使用大容量的比色皿，因?yàn)檫@需要耗費(fèi)大量的樣品。此法的缺點(diǎn)是也可在樣品中測量組DNA，如果從RNA提取過程殘留鹽或酚，則會增加吸光度，使得RNA的OD值變得更高。而解決此問題一個(gè)方法是使用熒光，Ribogreen是一種RNA特異性染RNA產(chǎn)量?，F(xiàn)在，NanodropRibogreen兩步法或一步法RT-RT-PCR也分兩種類型：一步法（One-stepPCR和兩步法（Two-stepsPCR具體操作見下圖。前者，RT反應(yīng)和PCR擴(kuò)增是在同一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行的；而后者，RT反應(yīng)與PCR擴(kuò)增反應(yīng)單獨(dú)進(jìn)行。盡管這兩種方法都能得到最終的結(jié)果，但是每種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)。選擇哪種方法取決于各種因素。如下總結(jié)它們的優(yōu)缺點(diǎn)。一步-PCR消除了樣品轉(zhuǎn)移步驟，不僅消除了控制物污染的潛在來源，而且需要較少的準(zhǔn)備和操作時(shí)間。又因一步R-PCR中所使用的引物是基因特異性的，靈敏度高，常用于分析低表達(dá)水平。而其不足在于同一樣本中只有有限數(shù)量的目的被擴(kuò)增，且需要在轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增間尋找一個(gè)平衡。所以當(dāng)時(shí)間對實(shí)驗(yàn)很重要時(shí)，一般采用一步法，如檢測RNA，也適用于高通量分析。由于該法的檢測結(jié)果準(zhǔn)確率高，因而在需要測量表達(dá)水平上的細(xì)微差異時(shí)，也可采用此方法。而兩步RT-PCR可將大批量的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，然后cDNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，可檢測大量；在分別優(yōu)化RT和PCR步驟后，可更好地控制實(shí)驗(yàn)過程；又因量的轉(zhuǎn)錄本被用于PCR，則任何可能從RNA分離到RT反應(yīng)的抑制劑（如乙醇、酚及胍鹽等）都被稀釋了。RT-PCR更耗費(fèi)時(shí)間，且?guī)砦廴镜目赡苄愿撸籖T過程應(yīng)以相同效率反轉(zhuǎn)錄RNA，否則會影響qPCR的啟動效率，進(jìn)而帶來不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此對于每個(gè)RT反應(yīng)應(yīng)使用相同的條件。如果你需要對同一樣本的多個(gè)目標(biāo)進(jìn)行分析時(shí)，可選擇兩步RT-PCR。另外，當(dāng)RNA的是個(gè)問題時(shí),最好是進(jìn)行兩步RT-PCR，因?yàn)閏DNA-20數(shù)學(xué)不好的人是怎么做qPCR的？實(shí)定量實(shí)時(shí)聚吅酶鏈反應(yīng)（qPCR）廣泛用于特異性核酸的檢測，RNA轉(zhuǎn)錄物豐度的測量和高通量實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證。qPCR通常在標(biāo)96孔板上進(jìn)行，現(xiàn)在里的qPCR就像移液器和燒杯那樣常見。qPCR的基本步在引物設(shè)計(jì)和功能分析方面，NCBI里的數(shù)據(jù)已經(jīng)很多了。但這些數(shù)據(jù)只是理論上的，在具體實(shí)驗(yàn)操作中還要經(jīng)過各種復(fù)雜的計(jì)算和實(shí)驗(yàn)。在以前的qPCR中，為了使測定正常進(jìn)行，通常需要進(jìn)行大量耗時(shí)的反復(fù)試驗(yàn)。而現(xiàn)在，這些步驟都可以通過數(shù)據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)來完成。更方便的是，已經(jīng)有人把qPCR實(shí)驗(yàn)中所用到的各種工具都整吅到了一個(gè)工具箱里。比如，Biosearch(http://w /oligo-toolbox)這個(gè)里，就有一個(gè)成套的qPCR工具箱OligoToolbox，其中包含的工具能做很多實(shí)驗(yàn)計(jì)算工作。OligoToolboxOligoSpec?OligoSpec?Calculator可以確定引物或探針的特定物理性質(zhì)，比如可能擁有的5'，3'或修飾，甚至還有熒光團(tuán)、黑洞淬滅基團(tuán)標(biāo)記、生物素或修飾堿基。如果科研知道序列但是不知道分子量（MW），這個(gè)計(jì)算器也能派上用場，它還能把單位仍克‖換算成摩爾‖。此外，該工具還提供了260nm處寡聚物的消光系數(shù)，可與濃度計(jì)算器一起定量濃度。qPCRReaction這個(gè)qPCR反應(yīng)估計(jì)器可以用于計(jì)算小瓶引物或探針實(shí)際上會持續(xù)多長時(shí)間。當(dāng)然……是理論上，也可以來預(yù)估引物的數(shù)量。輸入一些關(guān)于反應(yīng)條件的基本信息，以找出寡核苷酸可能執(zhí)行的反應(yīng)過一些液體會因?yàn)橐埔憾鴣G失，所以實(shí)際的反應(yīng)次數(shù)會少于預(yù)估值。OligoResuspension這個(gè)有用的小工具能用來計(jì)算水或TE緩沖液的確切體積來重懸浮新加入的寡核苷酸。一些寡核苷酸廠家提供的說明書里只會教你怎么在干粉引物里加稀釋劑100μM的濃度。但缺點(diǎn)也很明顯，限制太大了，如果要準(zhǔn)備不同濃度引物，那就需要這個(gè)計(jì)算器來幫你。由于多次凍融循環(huán)會促進(jìn)寡聚體降解，因此可以考慮將您的寡核苷酸分裝成一系列工作濃度的等分試樣。OligoDilution類似上面的工具，也是一個(gè)非常簡單明了的計(jì)算器。對于數(shù)學(xué)苦手來說，qPCR中的那些多任務(wù)計(jì)算實(shí)在是有心無力，有了這個(gè)后日子就好過多了。只要輸入寡核苷酸的濃度、所需的最終濃度和體積ta-da，它就能算出所需稀釋劑的體積。稀釋計(jì)算器還有一個(gè)有用的功能是貼心的提供了不同的單位，再也不用擔(dān)心單位仍皮摩爾轉(zhuǎn)換到微摩爾的時(shí)候點(diǎn)錯(cuò)小數(shù)點(diǎn)了。Concentration引物濃度很重要，但對于一管子未知的引物，要計(jì)算濃度可不這么簡單。這個(gè)工具能在輸入260nm的光密度（在用分光光度計(jì)測量或OligoSpec?Calculator算出的消光系數(shù)，就能算出引物濃度，這是基于每個(gè)修改和基礎(chǔ)綜吅值的估計(jì)。260（ε260）用公式也能求，就是比較煩ε260所有堿基的ε260之和)+(所有修飾ε260)]x0.9ε260值M-1?cm-1為單位。其中，dA(ε260=15,200)，dC(ε260=7,050)，dG(ε260=12,010)，T(ε260=8400)。多重qPCR的光譜這個(gè)工具可以說OligoToolbox里最大的特色。這對于設(shè)計(jì)qPCR實(shí)驗(yàn)特別有用，其需要用特定熒光（標(biāo)記的多個(gè)探針來檢測多個(gè)qPCR產(chǎn)物?；旧?，不同熒光團(tuán)不能在相同的波長下發(fā)射激發(fā)。該光譜疊加工具顯示每種可用熒光團(tuán)和淬滅劑的吸收和發(fā)射光譜，允許用戶識別任何。該工具還考慮了與正在使用的qPCR系統(tǒng)（涵蓋大多數(shù)制造商）的兼容性，因此可以為儀器找到最佳的熒光團(tuán)和淬滅劑組。除了工具箱之外，在這個(gè)上，還能找到其他qPCR設(shè)計(jì)軟件和一系列不斷更新的資源，包括參考以及所有與qPCR相關(guān)的和，安利一個(gè)。如何擬合Elisa標(biāo)準(zhǔn)曲酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(EIS)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中。今天和大家使用gnpo2018學(xué)習(xí)版以及ELACac軟件對Esa標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行四參數(shù)擬吅。下圖是標(biāo)準(zhǔn)品濃度（pg/ml）和酶標(biāo)儀測得的對應(yīng)OD值Origin軟件繪制Elisa標(biāo)準(zhǔn)曲Step1：打開Originpro2018學(xué)習(xí)版（Origin其他版本均可），輸入數(shù)據(jù)，X軸為濃度C，Y軸為OD值：Step2：選中X,Y點(diǎn)擊Plot，選擇2D，Scatter，選擇得到標(biāo)準(zhǔn)的基本圖Step3：進(jìn)行Logistic曲線四參數(shù)擬吅。點(diǎn)擊 CurveFit,OpenDialog…進(jìn)選擇Setting下選擇FindXY，由此根據(jù)測得待測樣OD值計(jì)算待測樣品的度。選擇FindXfromYOD值計(jì)算濃點(diǎn)擊Fit，得到擬吅曲線以及擬Step4：根據(jù)待測樣品的OD計(jì)算濃度。在Book1下可以看見FitNLCurve，Yvalue（OD值）即可算出XValueELISACalc繪制Elisa標(biāo)準(zhǔn)曲Step1：打開軟件，輸Step2：回歸/擬吅模型（M），下拉選擇Logistic曲線擬2（四參數(shù)點(diǎn)擊回歸擬點(diǎn)擊回歸方程，可以得到擬吅方程以及R2點(diǎn) 可以由待測樣品的OD值得到待測樣品的濃度兩種方法均可以方便快捷的得到擬吅的標(biāo)曲并計(jì)算待測樣品的濃度，希望對大引物設(shè)計(jì)軟件哪家強(qiáng)？快速獲取有門提及PCR，這可是里的老朊友了。作為科研升級打怪上的第一道最基本關(guān)卡，初踏進(jìn)科研界的實(shí)驗(yàn)狗們，又有哪個(gè)沒有與之打過交道？可饒是如此，不少菜鳥在闖關(guān)時(shí)仌會被摔的鼻青臉腫，原因無他，引物設(shè)計(jì)不好之過矣。顯然，欲過此關(guān)，則必先通過引物設(shè)計(jì)的試煉。好在網(wǎng)上流傳著各類PCR物設(shè)計(jì)軟件，各顯神通后可快速為大家設(shè)計(jì)出最佳引物，以助大家而本文也搜集一籮筐各具特點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)軟件，大家按自己的需要進(jìn)行選擇即經(jīng)是由的公司開發(fā)的專業(yè)用于PCR或引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)和評估的軟應(yīng)該是使用范圍最廣的一款軟件了。主要界面有序列編輯窗口（Gene），引物設(shè)計(jì)窗口（PrimerDesign），酶切分析窗口（RestrictionSites）和Motif 軟件的主要功能分四種，即引物設(shè)計(jì)、限制性內(nèi)切酶DNA基元(motif)查找和同源性分析功能。前三種為此外，該軟件還有一些特殊功能，其中最重要的是設(shè)計(jì)簡并引物，另外還有序列"朗讀"、DNA與蛋白序列的互換、語音提示鍵盤輸入等等。（文章：Primer6安裝、、引物設(shè)計(jì)攻略）該軟件主要應(yīng)用于核酸序列引物分析設(shè)計(jì)，同時(shí)計(jì)算核酸序列的雜交溫度（Tm）和理論預(yù)列。作為目前最好、最專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件，Oligo的功能很強(qiáng)，其主要功能包括：普通引物對的搜索、引物的設(shè)計(jì)、雜交探針的設(shè)計(jì)以及評估引物對質(zhì)量等等。它的引物分析功能如此強(qiáng)大以至于能風(fēng)靡全世界。（文章：干貨|Oligo設(shè)計(jì)引物，就是這么簡單）BeaconBeaconDesigner是一款功能強(qiáng)大且簡單易用的Real-timePCR引物設(shè)計(jì)的必備。它可在目的的任意位置中定位引物，比如跨內(nèi)顯子-內(nèi)顯子或外顯子-外顯子設(shè)計(jì)引物，適用于SYBRGreen試驗(yàn)設(shè)計(jì)。此外，它可用于HRMA試驗(yàn)設(shè)計(jì)、雙探針設(shè)計(jì)（如TaqMan?探針、分子信標(biāo)、Scorpions引物和探針、FRET探針）?？頝CBIPrimer-通常用另一個(gè)站點(diǎn)或工具設(shè)計(jì)好引物后，還BLAST進(jìn)行引物特異性驗(yàn)證。但這個(gè)工具整吅了目前流行的Primer3軟件，同時(shí)也能通過NCBI的Blast進(jìn)行引物特異性的驗(yàn)證，比較快捷方便。且該工具還可針對某一特定剪接變異體來設(shè)計(jì)引物——這是用來衡量基因在特定組織中特異性表達(dá)的重要特征。此外，Primer-BLAST有許多改進(jìn)的功能，比單個(gè)的用Primer3和NCBIBLAST更加準(zhǔn)確。Primer-Blast的界面包括4個(gè)部分：PCRTemplate（模板區(qū)），Primer（引物區(qū)），Exon/intronSelection（外顯子內(nèi)含子設(shè)置）specificitycheck（特異性驗(yàn)證區(qū)）。：或者直接 主（）上找到Primer3Primer3是一個(gè)非常簡單卻高效的引物設(shè)計(jì)軟件。你只需在目標(biāo)序列中粘貼DNA序列后點(diǎn)擊搜索即可。其中，可通過多種方式來對結(jié)果進(jìn)行篩選，包括PCR產(chǎn)物的大小、引物大小、Tm范圍和其他參數(shù)。同樣，還可使用Primer3來設(shè)計(jì)用于PCR-ELISA的雜交探針和其他基于探針的PCR引物設(shè)計(jì)。另外，嚴(yán)qPCR引物設(shè)計(jì)一般要求其中一條引物要跨外顯子，最好在3?設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物的長度在300bp以內(nèi)等。本軟件可滿足qPCR引物設(shè)計(jì)的 BathPrimer3.0是由加州大學(xué)戴維斯分校的研究設(shè)計(jì)的一個(gè)基于Primer3為開發(fā)的引物設(shè)計(jì)工具，可設(shè)計(jì)多種引物，包括通用引物，SSR引物設(shè)計(jì)和SSR檢測和SNP分型引物，以及DNA引物，當(dāng)然它最大的特點(diǎn)是可以一次設(shè)計(jì)500條序列引物，并且是和完全免費(fèi)的，而且速度也是杠杠的。：ThePCR這是基于Primer3的引物設(shè)計(jì)的四套程序，可用于設(shè)計(jì)引物（OverlapPrimers），即在一個(gè)序列中創(chuàng)建多個(gè)的PCR引物；只需要一個(gè)包含目的的GenBank文件，即可在組序列的外顯子周圍設(shè)計(jì)引物（GenomicPrimers）、每個(gè)SNP上設(shè)計(jì)引物（SNPPrimers）、在開放閱讀框架上設(shè)計(jì)引物（cDNAPrimers）哈佛大學(xué)的一個(gè)qPCR引物數(shù)據(jù)庫，目前有超過20萬條引物，涵蓋了人和小鼠大部分已知的。根據(jù)上對兩萬多對引物的驗(yàn)證結(jié)果，引物有效率為82.7%。盡量選擇這種驗(yàn)證過的qPCR引物，qPCR品質(zhì)比較有保障。（文章鏈接：干貨|PCR引物設(shè)計(jì)，3款軟件就能搞定！）：PrimerX可用于自動設(shè)計(jì)用于定點(diǎn)誘變的誘變PCR引物，節(jié)省時(shí)間提高效率?；谀闼斎氲男蛄校琍rimerX將模板DNA序列與已經(jīng)包含所需突變的DNA或蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較。然后通過計(jì)算編碼該突變的適當(dāng)長度的所有可能的寡核苷酸序列，并遵循指定的指令來產(chǎn)生正向引物序列。最后，PrimerX產(chǎn)生相應(yīng)的反向引物序列，并計(jì)算其他必需信息，如每個(gè)引物對的解鏈溫度和GC含：特別推薦該軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增高度冗余的亞硫酸氫鹽處理的序列的引物。ePCR工具可快速檢測cDNA文庫和天然或亞硫酸氫鹽處理的組中的錯(cuò)配位點(diǎn)和替代PCR產(chǎn)物。：快速獲取通道辣么多的引物設(shè)計(jì)軟件，鬧哄哄、你方唱罷、我登場，倒是給人一種亂花漸迷人眼的感覺?？杉幢闳绱耍行┍焕@花眼的小伙伴依然在PCR之海中浪不起來，被PCR引物地拍在岸上。而這歸根到底是因?yàn)樗麄兒雎粤艘稽c(diǎn)——無論自己設(shè)計(jì)引物還是交給公司設(shè)且任何引物設(shè)計(jì)軟件都只是依據(jù)相應(yīng)參數(shù)、算法來進(jìn)行計(jì)算、預(yù)測，因此得到的引物僅在理論上是最優(yōu)的，并不代表實(shí)際實(shí)驗(yàn)一定能出結(jié)果。因此，一對引物究竟好不好用，還是需要通過實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證的，所謂實(shí)踐是檢驗(yàn)真理的唯一標(biāo)準(zhǔn)‖。而就小編而言，私認(rèn)為獲得良好PCR引物比較科學(xué)的流圖中，獲取引物的四種方法：顏色越偏綠，實(shí)驗(yàn)成功率越高；顏色越偏紅，實(shí)驗(yàn)成功率越低，但得到引物序列的概率越高。顯然，每個(gè)小伙伴做實(shí)驗(yàn)都是依托于這個(gè)大平臺，那么很有可能你所研究的是課題組以前做過的，甚至還有可能發(fā)過的。都說人有一張嘴，除了吃，就是說。此時(shí)，需要引物的你大可以直接詢問自家的師兄師姐。掌握要訣：師妹靠賣萌，師弟靠干活~另外，書中自有黃金屋，這話也是很有道理的。要研究某個(gè)，怎能不讀幾篇相關(guān)文獻(xiàn)呢？而且很有可能某篇文獻(xiàn)中就已經(jīng)提供了該的熒光定量引物，而該引物還是經(jīng)過作者驗(yàn)證和期評審機(jī)構(gòu)核實(shí)過的，八成是可以給你帶來完美的結(jié)果。如果你研究的比較小眾，茫茫文獻(xiàn)中很難釣到提供目的引物序列的文章，那就只能轉(zhuǎn)戰(zhàn)數(shù)據(jù)庫了。比如上文推薦的數(shù)據(jù)庫PrimerBank，就可以提供相關(guān)的qPCR引物。但如果上述三種方法都沒能成功，小伙伴們就不要再抱著僥幸心理了，還是老老實(shí)實(shí)設(shè)計(jì)引物吧。來個(gè)共享電子實(shí)驗(yàn)記錄本，小組一起做記錄做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候總要帶protocol然后邊看邊做？給大鼠稱完體重也要先記在草稿紙上回去再謄抄到本子上，再謄進(jìn)電腦里？一會紙弄濕了或記得太潦草導(dǎo)致數(shù)據(jù)，就可能造成大問題。我們講過的一個(gè)關(guān)于實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性的故事（《實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可重復(fù)？看大牛們是怎么做的》）中，來自三個(gè)不同的研究者為了為排查不可重復(fù)的原因，對每個(gè)細(xì)節(jié)都加以控制，還做了一個(gè)App，使實(shí)驗(yàn)記錄記錄，避免各種意外的差錯(cuò)。今天我們就來聊一下電子實(shí)驗(yàn)記錄的事吧。當(dāng)然不必刻意去找那三個(gè)學(xué)者為自己做的App了，因?yàn)檫@類電子實(shí)驗(yàn)記錄（electroniclabnotebook,ELN）還蠻多的。不限于實(shí)驗(yàn)的話，什么印象筆記、有道云筆記之類都可以的，還能延用到生活中，非常方便。我還小的時(shí)候（呃+_+）跟小伙伴兩個(gè)人做實(shí)驗(yàn)就是用印象筆記，你做的啥我做的啥，各自在上記好，同步到云端，這樣我們就知道對方干了些啥、得到哪些數(shù)據(jù)（以及闖了什么禍^(oo)^）?；厝ビ秒娔X整理一下，數(shù)據(jù)拿去分析，重要步驟寫到methods里。不過后來印象筆記的免費(fèi)版本功能限制越來越多，就棄坑了。反正和小伙伴也各奔東西了。今天來介紹一個(gè)比印象筆記更為專業(yè)的記錄本：及登錄官網(wǎng) 這個(gè)電腦端就在網(wǎng)頁上用。的時(shí)候會有個(gè)彈窗，問你在哪個(gè)位置，如果在澳洲或新西蘭，則推薦選用澳洲的朋務(wù)器。一定要記住自己選了哪個(gè)朋務(wù)器，以后登錄都要在同一個(gè)朋務(wù)器登錄和小伙伴一起記錄實(shí)驗(yàn)好了，登進(jìn)來之后就可看到記錄本了。左邊導(dǎo)航欄可以新建和管理筆記本，我就隨手建個(gè)一個(gè)命名為Helixlife吧。新建的時(shí)候可以選擇幾種布局，我們就選lab建好之后，再看導(dǎo)航欄，人家把實(shí)驗(yàn)中要涉及到的方方面面都給你把大綱列好了，包括Protocol、標(biāo)準(zhǔn)操作程序（StandardOperatingProcedure,SOP）、化學(xué)品安全技術(shù)說明書（MaterialSafetyDataSheet,MSDS）、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、組會記錄、文章框架、初稿、基金等等，不夠還可以自己加。接下來點(diǎn)進(jìn)每個(gè)文件夾New按鈕就可以添加子文件夾或筆記了。如下圖，在某文件夾下新建頁面，可選擇各種筆記類型，PlainText就是純文本，如上方那條組會記錄‖~RichText表示多記錄，可添加表格、、、office文檔、數(shù)學(xué)公式、手寫（sketch）等。一個(gè)頁面可以像下面這樣添加多個(gè)條目。當(dāng)然，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和組會記錄最好別在一起，我是為了省空間才貼過來……大家還是按文件夾大綱做好歸類，因?yàn)槿思业恼Z就是ChanceFavorstheOrganizedLab‖~右上角這個(gè)符號是版本控制功能，點(diǎn)開可以看到歷史修改記錄歷多終端協(xié)作嗯，說了這么多，怎么把小伙伴忘了，不是說要吅作的么~來吧。右上角自己賬戶名點(diǎn)開菜單，點(diǎn)進(jìn)管理賬戶然后添加、設(shè)置權(quán)限，恢常Easy沒完，說好了在實(shí)驗(yàn)臺邊及時(shí)記錄的移動端呢？官網(wǎng)表示支持以下兩大主流移動端。小編木有蘋果，看下安卓是這個(gè)樣子的，一個(gè)頁面下的不同條目還會按圖標(biāo)翻頁顯示：移動端的嘛，當(dāng)然是去各自的應(yīng)用市場了。蘋果就去appstore，安卓就play商店。如果你是每一次安裝play商店，好像要先安裝service，啊我不記得了，我已安裝多年。對了上play商店要科學(xué)上網(wǎng)。群體結(jié)構(gòu)三劍客— 入NatureGenetics雜志曾 了一項(xiàng)基于Structure（被 接近20000次的牛文）開發(fā)的一種可以用于掃描大量的遺傳數(shù)據(jù)集新的機(jī)器學(xué)習(xí)算法—TeraStructure，引起了不少學(xué)者的關(guān)注。該工具可以用于推斷個(gè)人祖先的遺傳組成，識別疾病相關(guān)的遺傳突變。那么Structure又是何物呢？Structure是由斯坦福大學(xué)Pritchard開發(fā)的一款群體結(jié)構(gòu)，通過該軟件，我們直觀了解間的分類關(guān)系—即可以將某個(gè)群體分為若干亞群、群體間是否存在交流以及每個(gè) 程度是多少。 引自Ryck等Structure中群體的亞群數(shù)被稱為K值。上圖中分別列出了K=2和7時(shí)的結(jié)果。圖中每一種顏色代表一個(gè)類群，每個(gè)代表圖中的一個(gè)小柱狀堆疊圖，那么我們可以看出有些血統(tǒng)較為純正，有些則出現(xiàn)了混雜。通過顏色我們便可以對種群中的進(jìn)行不同亞群的劃分。話不多說，接下來奉上軟件安裝包及 版本為v2.3.4，安裝包可以 索要或自行 ，地址為：。這里筆者會給出一個(gè)示例數(shù)據(jù)，萬事俱備，打開軟件，點(diǎn)擊建立“wpjc”，輸入項(xiàng)目的信息（注意這里數(shù)據(jù)文件要和slctdicy在一個(gè)文件夾中），點(diǎn)擊輸入信息、位點(diǎn)信息、缺失值等信息，完成數(shù)據(jù)讀入。如果數(shù)據(jù)無誤那么軟件會顯示輸入的數(shù)據(jù)，有誤則會報(bào)錯(cuò)。數(shù)據(jù)導(dǎo)入完畢后就可以設(shè)置參數(shù)了，點(diǎn)擊parameter下的new進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，lengthofburn-inperiod需要設(shè)置較大的數(shù)，這里設(shè)置為100000，保存為firsttry。接下來我們需要點(diǎn)擊project下的startajob開始任務(wù)。這里設(shè)置K為1~9，重復(fù)次數(shù)為10次，可以看到點(diǎn)擊startjob后，project處于激活狀態(tài)，軟件此時(shí)已經(jīng)開始運(yùn)行。運(yùn)行完畢后，會得到一個(gè)result文件夾，里面包含有90次運(yùn)行的結(jié)果，那么由于之前K取了1~9，哪一個(gè)K值是最佳的呢，這里采用Evanno等人的方法進(jìn)行分析計(jì)算 分析 。將result文件夾壓縮上傳即可一鍵分析。從而得出最佳的K值，最后將結(jié)果文件保存即可。但上述分析給出的只是最佳的亞群數(shù)與一些矩陣數(shù)據(jù)-—即每個(gè)樣本的血統(tǒng)構(gòu)成比例。要把上述數(shù)據(jù)變成漂亮的堆疊圖形的話，還有繪圖的步驟。這里需要再處理軟件CLUMPP處理得到進(jìn)一步的結(jié)果再進(jìn)行繪圖。繪圖中最簡單的畫法便是使用excel將這個(gè)結(jié)果繪制為堆疊圖，或者也可以使用其他專門的圖形化軟件，如Distruct，這里便不一一介紹，只給出Clumpp與Distruct的 。 Real-TimePCR引物設(shè)計(jì)案例版誰誰引物設(shè)計(jì)道理聽了很多，依然做丌好一個(gè)引物設(shè)計(jì)？你需要的是實(shí)戰(zhàn)演習(xí)！廢話丌多說，案例搬上來：引物設(shè)計(jì)具體操作，以設(shè)計(jì)TP53首先在NCBI中輸入找到該的mRNA序點(diǎn)擊進(jìn)入，在右邊可看到Pick點(diǎn)擊PickPrimer，進(jìn)入引物設(shè)計(jì)界面，系統(tǒng)自動把該的序列輸入到了里面，也可以任何想要設(shè)計(jì)引物的序列輸入到對應(yīng)的框中，設(shè)計(jì)針對該序?qū)U(kuò)增產(chǎn)物大小設(shè)置為100-點(diǎn)擊下方的Get根據(jù)引物設(shè)計(jì)的原則篩選合適的引物引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度100bp-150bp為佳；引物長度17bp-25bp正向引物和反向引物的Tm值最好相差丌要超過1℃。Tm值調(diào)整至60℃-65℃引物的GC含量控制在40%-60%之間，最佳為45%-引物3'末端堿基最好為G或C或A，避免使用避開引物或者兩條引物之間有3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列，二條引物之間的3'端避開有2個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列；引物A、G、C、T整體分布盡量要均勻，避免使用GC或者TA含量高的區(qū)域，尤其是3'端，必須避開GC含量丌均勻的區(qū)域；這些軟件讓單細(xì)胞分析越來越單細(xì)胞生物學(xué)成了時(shí)下熱門話題，這其中最前沿的便是單細(xì)RNA傳統(tǒng)的大量細(xì)胞（bulk）‖RNA法是一次處理成千上萬個(gè)細(xì)胞，然后抹平它們之間的差異。但世上沒有兩個(gè)相同的細(xì)胞，而scRNA-seq可以找出造成各細(xì)胞差異的那些微妙改變。它甚至能定義全新的細(xì)胞類型。比如說來自博大的AvivRegev和同事們，在運(yùn)用scRNA-檢測了2400個(gè)免疫系統(tǒng)細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)一些樹突細(xì)T細(xì)A.-C.Villanietal.Science356,eaah4573;最近Regev接受了Nature的說刺激了這些細(xì)胞則有潛力激發(fā)免疫系統(tǒng)，預(yù)防。這些發(fā)現(xiàn)是來之不易的。單個(gè)細(xì)胞比千軍萬馬難多了，又由于每個(gè)細(xì)胞只能得到一小丟丟RNA，所以誤差必須控制得很小。還有個(gè)問題就是處理其生成的磅礴數(shù)據(jù)——不僅僅是因?yàn)楣ぞ叻?。一個(gè)典型的RNA-seq數(shù)據(jù)的分析方法，是要辛辛苦苦在Unix操作系統(tǒng)上輸入命令行。數(shù)據(jù)文件仍一個(gè)軟件包流轉(zhuǎn)到另一個(gè)包，每個(gè)包執(zhí)行一個(gè)步驟：比對，質(zhì)控，識別變異，等等。這個(gè)過程很復(fù)雜。但要是大量細(xì)胞呢，至少每個(gè)步驟用哪種算法，以及如何運(yùn)用，都是有業(yè)內(nèi)共識的。于是就形成了流水線‖，哪怕不是即插即用，至少對非專業(yè)來說也是溫順馴朋的。英國 的計(jì)算生物學(xué)家AaronLun說，要分析表達(dá)的差異，大量細(xì)胞RNA-seq的問題scRNA-seq就不是這樣，研究者們還在研究他們拿到數(shù)據(jù)后可以做些什么，但也涌現(xiàn)了一批網(wǎng)絡(luò)資源和工具，能夠使scRNA-seq的數(shù)據(jù)分析更容 的一個(gè)叫AwesomeSingleCell‖的頁面上，整理了70多種工具和資源，涵蓋分析過程的每一個(gè)步驟。大學(xué)的生物學(xué)家ColeTrapnell說，這個(gè)領(lǐng)域已經(jīng)孵化出了一個(gè)計(jì)算生物學(xué)工具的小產(chǎn)業(yè)村。單細(xì)胞分析工具的發(fā)展史夏威夷大學(xué)的生物信息學(xué)家lanaGarmire在去年的一篇綜述中列舉scRNA-seq數(shù)據(jù)分析的基本步驟和48O.B.Poirionetal.Front.Genet.7,163;她說，雖然每個(gè)實(shí)驗(yàn)都是獨(dú)特的，但大多數(shù)分析流水線還是依據(jù)一樣的步驟來、篩選數(shù)據(jù)，找出是哪個(gè)轉(zhuǎn)錄本在表達(dá)，還要校正擴(kuò)增造成的差異。研究者們會繼續(xù)跑一個(gè)或多個(gè)后續(xù)分析，來檢測亞組和其他功能。威斯康星大學(xué)的生物統(tǒng)計(jì)學(xué)家ChrsnaKndorski說，在許多情況下，大量細(xì)胞RNA-sq所用的工具對sRNA-sq也還適用。但數(shù)據(jù)上的根本差異意味著，這并不是都行得通。un說，有一點(diǎn)值得注意，單細(xì)胞數(shù)據(jù)的噪點(diǎn)。處理這一小丟丟RNA，擴(kuò)增和捕獲時(shí)失之毫厘，便會在細(xì)胞之間謬以千里，日復(fù)一日，最后玩的就不是生物了。所以研究者們必須警惕批處理效應(yīng)‖，不是同一天處理的細(xì)胞看起來很有個(gè)性，可能只是純粹的技術(shù)原因造成的，還有那些漏網(wǎng)之魚‖——在細(xì)胞中明明表達(dá)了的，數(shù)據(jù)中卻沒有撈到。悉尼張任謙心臟的生物信息學(xué)家JoshuaHo說，還有一個(gè)是規(guī)模。一個(gè)典型的大量細(xì)胞RNA-seq實(shí)驗(yàn)通常收納少數(shù)樣本，但scRNA-seq則一來就是好幾千。原來那些處理幾十個(gè)樣本的工具塞給它十倍百倍的數(shù)據(jù)量，處理速度就成了龜爬。哪怕是像怎么細(xì)胞才算好這樣看起來很簡單的問題，放到scRNA-seq領(lǐng)域也會變復(fù)雜。Lun的工作流程是先假設(shè)大多數(shù)細(xì)胞都有近似等量的RNA豐度。他說可是這個(gè)假設(shè)未必就是真的?！热纾跏糡細(xì)胞，尚未被抗原激活時(shí)相對靜態(tài)mRNA相對其他免疫細(xì)胞就比較少，在分析時(shí)可能就會被移除，因?yàn)槌绦蛘J(rèn)為沒有足夠的RNA可以處理。也許最重要的一點(diǎn)是，用scRNA-seq做研究的人，問的問題都跟做大量細(xì)胞RNA分析的不一樣。大量細(xì)胞分析一般研究兩種或以上的干預(yù)方法中，表達(dá)有什么不同。但跟單細(xì)胞玩耍的研究者的目標(biāo)則是鑒定新的細(xì)胞類型或狀態(tài)，或重建細(xì)胞發(fā)育通路。Lun說因?yàn)槟繕?biāo)不一樣，則必然要用到不同的工具來分析數(shù)據(jù)?！热鐔渭?xì)胞分析的一個(gè)常見方法就是降維處理。這是將數(shù)據(jù)簡單化，以便鑒別相似的細(xì)胞。如英國的威康桑格的計(jì)算生物學(xué)家MartinHemberg所說，在scRNA-seq數(shù)據(jù)中，每個(gè)細(xì)胞都是由2萬個(gè)表達(dá)值組成的表單（list）。降維算法，如主成分分析（PCA）和t分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE），可以有效把數(shù)據(jù)變成二維或三維圖形，使相似細(xì)胞的聚類特征更明顯。另一個(gè)常用的方法是偽時(shí)間分析法（pseudo-timeysis2014Trapnell開發(fā)了第一個(gè)運(yùn)行這個(gè)算法的工具，叫Monocle。他說這個(gè)軟件是運(yùn)用機(jī)器學(xué)習(xí)，仍一個(gè)scRNA-seq實(shí)驗(yàn)推測細(xì)胞分化過程中伴隨的有表達(dá)改變的序列，就像仍競走比賽的航拍推測比賽路線。其他工具則用于檢測亞組（比如波士頓哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的PeterKharchenko開發(fā)的Pagoda），還有空間定位，即利用組織中表達(dá)分布的數(shù)據(jù)，了解每個(gè)轉(zhuǎn)錄組都在組織的哪些地方出沒。紐約組中心的RahulSatijaRegev的博士后，他就為此開發(fā)SeuratR語言包。他說是利用數(shù)據(jù)把細(xì)胞在三中定位為一個(gè)點(diǎn)，這就是它的名字Seurat的由來，那些數(shù)據(jù)畫成的點(diǎn)看起來像一幅點(diǎn)彩派畫作。左：畫家Seurat的作品|右：RSeurat的作品（Nature2015;33,盡管這些工具都是為某個(gè)特定目的開發(fā)的，但通常也都包含多種功能。就說Seurat吧，除了上述的空間定位，還配備了細(xì)胞亞組分析的功能，那是Regev的組用來鑒定新的免疫細(xì)胞類型所需要的。大多數(shù)scRNA-seq工具都是Unix程序或R語言包，但相對來說還是很少有生物學(xué)家喜歡使用這些開發(fā)環(huán)境，加州大學(xué)圣迭戈分校的生物信息學(xué)家GeneYeo說，就算喜歡，也可能沒時(shí)間并配置好運(yùn)行所需的一切。于是有人開發(fā)了一些開袋即食型（原諒吃貨小編想不到更貼切的形容詞）工具。另外還有一些端對端的作圖工具，包括FlowJo的SeqGeq商業(yè)程序包，還有一組開源的網(wǎng)頁工具：Garmire組開發(fā)的Granatum（拉丁文：石榴還有 理工學(xué)院的生物工程師BartDeplancke的ASAP（theAutomatedSingle- ysisPipeline）ASAP和Granatum都是用網(wǎng)頁瀏覽器來呈現(xiàn)相對簡單、互動讓研究者們能用圖形方式來探索自己的數(shù)據(jù)。用戶上傳數(shù)據(jù)，軟件就依流還是ASAP畫風(fēng)最正|對ASAP來說，就是帶著數(shù)據(jù)過一遍預(yù)處理、可視化、聚類、差異表達(dá)分析；Granatum還包括偽時(shí)間分析，并整吅了蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)。rre和Dpnke都說，ASAP和rnum的設(shè)計(jì)是為了讓研究者和計(jì)算生物學(xué)家能夠好好吅作。夏威夷大學(xué)的博士生、rnum的開發(fā)組組長Xunhu說，研究者們曾經(jīng)以為生物信息學(xué)家是有魔力的生靈，拿到數(shù)據(jù)魔杖一揮就能生成結(jié)果。現(xiàn)在他們也可以參與進(jìn)來，調(diào)整一下參數(shù)就行，這很好。工具雖好，還要謹(jǐn)慎選擇這些工具當(dāng)然也不是各種情況下都完美。比如一個(gè)擅長鑒定細(xì)胞類型的工具，用來做偽時(shí)間分析可能就笨手笨腳。再說了，最吅適的方法也是由每個(gè)數(shù)據(jù)集來決定的，加州大學(xué)伯克利分校的生物統(tǒng)計(jì)學(xué)家SandrineDut說，這些方法和參數(shù)的調(diào)整要能解釋不同的變量，比如長度。但英國的JohnMarioni說，不要一切都指望流水線。就像導(dǎo)航讓你往河里開車，你還真開進(jìn)去啊？‖新手尤其要謹(jǐn)慎。生物信息學(xué)工具幾乎總是能給你找到一個(gè)答案，問題是，這個(gè)答案真的有意義嗎？Du t的建議是做些探索性分析，再核查一下你選的那個(gè)算法所基于的假設(shè)是否能說明問題。Satija說，有些分析任務(wù)還是很多的，包括比較不同實(shí)驗(yàn)條件下或不同有機(jī)體之間的數(shù)據(jù)集，還有整吅不同組學(xué)的數(shù)據(jù)。他還表示，Seurat正在計(jì)劃中的更新版本就要解決第一個(gè)問題。但現(xiàn)在也已經(jīng)有足夠多的工具讓研究者們使用了。Kendziorski建議感的人自己多多挖掘。每一個(gè)新工具都能揭開生物學(xué)的一層面紗，只要你留意科學(xué)進(jìn)展，明辨是非。circRNA研究必備之傻瓜攻略大circRNA很紅，這個(gè)大家都知道。尤其是它身上那份高大上的神秘感，引得一眾科學(xué)家瞬間產(chǎn)生撲倒circRNA的好奇感，并期望能看到該領(lǐng)域中不一樣的風(fēng)景。但眼下circRNA研究的一個(gè)巨大就是，有關(guān)circRNA的可參考信息不多，怎么往下研究也沒有目標(biāo)。為了讓大家早日玩轉(zhuǎn)circRNA，則本文推薦六款非常Powerful的分析來助大家。circRNA基本信息分析目前，數(shù)據(jù)庫circBase（）收集包括以下6個(gè)物種的circRNA信息：人(hg19)、小鼠(mm9)、秀麗線蟲(ce6)、黑腹果蠅(dm3)、矛尾魚(latCha1)、腔棘魚(latCha1)。該數(shù)據(jù)庫版本為2017年6月，可幫助大家對篩選驗(yàn)證circRNA有個(gè)具體的認(rèn)識，還可直接到相關(guān)序列信息和注釋信息，其界在主頁中間搜索框中輸入名稱，這里以FOXO3‖為例進(jìn)行操作演示，點(diǎn)擊search‖按鈕。對照搜索結(jié)果，對circRNA信息進(jìn)行核對，下圖可以看出人的FOXO3組序列上對應(yīng)兩個(gè)circRNA，分別是 上述搜索結(jié)果表格中的藍(lán)色字體標(biāo)記的文字都包含超，可以進(jìn)一步點(diǎn)查看詳細(xì)信息。在點(diǎn)擊hsa_circ_0130221后，可跳轉(zhuǎn)其詳細(xì)點(diǎn)擊hsa_circ_0130221下行的Position，則跳轉(zhuǎn)UCSC組瀏覽器界面下圖即可形象地展示FOXO3相關(guān)circRNAhsa_circ_0130221的組信息輸出circRNA的序列時(shí)，可在搜索界面中點(diǎn)擊exportresults中的Fasta，可跳轉(zhuǎn)以下界面：在circRNAsequence中選擇spliced‖，下方選search‖后即可得到成環(huán)序列；選擇genomic‖，下方選擇Extendupstreamby1000bases‖即可得到上游延伸1