大豆分離蛋白的提取實(shí)驗(yàn)講義

實(shí)驗(yàn)一大豆分離蛋白的提取1．實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握大豆分離蛋白的堿提酸沉法。2．分離原理：大豆分離蛋白的制取方法，按工藝特點(diǎn)主要有三種：第一種是堿提酸沉法；第二種是離子交換法；第三種是超濾法。堿提酸沉法生產(chǎn)大豆分離蛋白的原理，是將脫脂大豆內(nèi)的蛋白質(zhì)溶解在稀堿溶液中，分離除去豆粕中的不溶物，然后用酸將大豆蛋白質(zhì)提取液的 pH值調(diào)至大豆蛋白的等電點(diǎn)，使大豆蛋白質(zhì)沉淀析出，再經(jīng)分離清洗，回調(diào)pH，得到粉狀大豆分離蛋白。3.試劑材料：豆粕，5%NaOH，2NHCl（17ml濃鹽酸，緩慢用水稀釋至100ml）。4.提取方法：將2g大豆磨碎，得到可通過80目篩的豆粕。用重量10倍于豆粕的蒸餾水與脫脂豆粉混合，用5%NaOH水溶液將豆粉懸浮液的pH調(diào)節(jié)到8.5，室溫或40℃攪拌1.5h。然后將提取液離心除渣4000rpm×15min，得上清液。用2N的HCl將上清液的pH值調(diào)到4.5，同時(shí)輕度攪拌均勻，可見開始出現(xiàn)沉淀，室溫靜置30min，然后以4000rpm×15min離心，用蒸餾水清洗沉淀2次，將蛋白沉淀物溶于20ml水中，并調(diào)節(jié)pH到7.0，考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算蛋白提取率。5.產(chǎn)品測(cè)定指標(biāo)：1）可溶性蛋白質(zhì)的濃度：采用考馬斯亮藍(lán)法。2）蛋白質(zhì)的提取率計(jì)算公式：可溶蛋白質(zhì)的濃度(ug/ml)稀×釋度×體積(ml)1/5提取率（%）＝×100%6原料質(zhì)量(g)×10（附）考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆湛捡R斯亮藍(lán)結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法，掌握離心機(jī)和移液器的正確使用方法。二、實(shí)驗(yàn)原理考馬斯亮藍(lán)G-250是一種甲基取代的三苯基甲烷，在465nm處有最大吸收值。考馬斯亮藍(lán)G-250能與蛋白質(zhì)通過范得華相互作用形成蛋白質(zhì)-考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物藍(lán)色溶液，引起該染料的最大吸收λmax的位置發(fā)生轉(zhuǎn)移，在595nm處有最大吸收值。在一定范圍內(nèi)(蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1000μg／mL)，蛋白質(zhì)-考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物溶液顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。三、實(shí)驗(yàn)試劑1．標(biāo)準(zhǔn)蛋白液：準(zhǔn)確稱取100mg牛血清白蛋白，用蒸餾水溶解并定容至1000ml，制成100μg/ml的原液。2．考馬斯亮藍(lán)G250試劑：準(zhǔn)確稱取 100mg考馬斯亮藍(lán)G250，溶于50ml90％～95％乙醇中，再加入 85%磷酸（m/v）100ml，用蒸餾水定容至 1000ml。常溫下可放置1個(gè)月。四、操作步驟1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備2/5取7支具塞試管，按下表進(jìn)行編號(hào)并加入試劑。以第 1管為空白，于波長(zhǎng)595nm處比色，讀取吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)液濃度 (μg／mL)作為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備（0～100μg／mL）及樣品測(cè)定參考表管號(hào)試劑標(biāo)準(zhǔn)蛋白液(ml)水(ml)樣品提取液(ml)考馬斯亮藍(lán)試劑(ml)蛋白質(zhì)濃度(μg/m1)A595nm1（空白）01.0／5.00＃23/50.20.8／5.020＃30.40.6／5.040＃40.60.4／5.060＃50.80.2／5.080＃61.04/50／5.0100＃7／／1.05.0待測(cè)＃充分混勻，室溫靜置 3min2．樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定根據(jù)樣品吸光度值，推出樣品中蛋白質(zhì)含量。七、注意事項(xiàng)1．樣品蛋白質(zhì)含量應(yīng)在 10～100ug為宜。一些陽離子如 K、Na、Mg、NH4）2SO4、乙醇等物質(zhì)對(duì)測(cè)定無影響，而大量的去污劑如TritonX-100、SDS等會(huì)嚴(yán)重干擾測(cè)定。2．蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合十分迅速，在2min左右即可達(dá)到平衡，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5min～20min之間顏色穩(wěn)定性最好。3．試管內(nèi)溶液要充分混合，但應(yīng)避免不正確的振蕩而產(chǎn)生大量的氣泡。4．染料易吸附在比色杯上（注意盡量不用石英比色杯），比色杯用后可用乙醇洗去藍(lán)色。5．由于各種蛋白質(zhì)