病原微生物檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

病原微生物檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展云云;汪長(zhǎng)中;吳璇【摘要】Therearemanykindsofmicroorganismswhosevariationsareveryfast.Technologiesofrapiddetectionofpathogensdevelopcontinuously.Thesemethodsincludedirectsmearmicroscope,isolationandculture,biochemicalreactions,serologicalreaction,nucleicacidhybridization,genechip,polymerasechainreactionandsoon.Thispaperreviewedtheprogressesofthesedetectiontechnologies.%病原微生物種類繁多,變異迅速,快速鑒定病原微生物的檢驗(yàn)技術(shù)也在不斷發(fā)展前進(jìn)著.目前,應(yīng)用比較廣泛的病原微生物檢測(cè)方法主要有直接涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)、核酸分子雜交、基因芯片、多聚酶鏈反應(yīng)等,該文對(duì)這些檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展做一綜述.【期刊名稱】《安徽醫(yī)藥》【年(卷),期】2013(017)003【總頁(yè)數(shù)】3頁(yè)(P501-503)【關(guān)鍵詞】病原微生物;血清學(xué)反應(yīng);PCR;基因芯片【作者】云云;汪長(zhǎng)中;吳璇【作者單位】安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,安徽,合肥,230032【正文語(yǔ)種】中文對(duì)人和動(dòng)物具有致病性的微生物稱為病原微生物，又稱病原體，有病毒、細(xì)菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、真菌、放線菌、朊粒等。這些病原微生物可引起感染、過(guò)敏、腫瘤、癡呆等疾病，也是危害食品安全的主要因素之一。近年來(lái)出現(xiàn)的SARS、高致病性禽流感、西尼羅病毒感染等疾病的傳染性極強(qiáng)，往往造成世界性大流行，因此對(duì)病原體的檢測(cè)必須做到快速、準(zhǔn)確。常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)方法操作繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，而且對(duì)操作人員技術(shù)水平要求比較高。隨著醫(yī)學(xué)微生物學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，病原學(xué)診斷已不再局限于病原體水平，深入到分子水平、基因水平的檢測(cè)手段不斷出現(xiàn)并被應(yīng)用于臨床和實(shí)驗(yàn)室［1］。核酸分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等檢測(cè)方法，自動(dòng)化程度高，快速省時(shí)、無(wú)污染、結(jié)果精確，可以準(zhǔn)確靈敏地鑒定病原微生物［2］。傳統(tǒng)的病原微生物的檢測(cè)方法傳統(tǒng)的病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢查以染色、培養(yǎng)、生化鑒定等為主，將標(biāo)本直接涂片染色鏡檢和接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)是對(duì)細(xì)菌或真菌感染性疾病進(jìn)行病原學(xué)診斷的常用方法。直接涂片鏡檢病原微生物體形體積微小，大多無(wú)色半透明狀，將其染色后可然是十分重要的病原微生物檢測(cè)手段。MicroscanWalk/Away全自動(dòng)微生物分析儀，可同時(shí)做細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，檢驗(yàn)500多個(gè)菌種?？琉B(yǎng)菌如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌等對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求比較高，常規(guī)培養(yǎng)陽(yáng)性率低。雍剛［3］等將不要同比例的葡萄糖、玉米淀粉、生長(zhǎng)因子、酵母粉、氨基酸等特殊增菌劑加入到巧克力培養(yǎng)基中制成了新型淋病奈瑟菌培養(yǎng)基，大大提高了淋病奈瑟菌的分離培養(yǎng)率。蘇盛通［4］等在營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入了中藥紅棗、赤小豆培養(yǎng)甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、肺炎鏈球菌等細(xì)菌，生長(zhǎng)指數(shù)明顯高于血平板。組織細(xì)胞培養(yǎng)活組織細(xì)胞培養(yǎng)適于專營(yíng)活組織細(xì)胞內(nèi)生存的病原體，包括病出現(xiàn)特異的病理學(xué)改變。往往可以根據(jù)這些特異的病變對(duì)病原體進(jìn)行鑒定。血清學(xué)與免疫學(xué)檢測(cè)血清學(xué)檢測(cè)是通過(guò)已知的抗體或抗原來(lái)檢測(cè)病原體的抗原或抗體從而對(duì)病原體進(jìn)行熒光抗體檢測(cè)技術(shù)、協(xié)同凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫測(cè)試技術(shù)等。酶聯(lián)免疫技術(shù)的應(yīng)用大大提高了血清學(xué)檢測(cè)的敏感性和特異性，不僅可檢測(cè)樣本中病原體抗原，也可檢測(cè)50%～80%，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)唾液中抗HP抗體來(lái)診斷HP感染，其結(jié)果滿意。乙型肝炎病毒(HBV)在我國(guó)人群中感染率極高，ELISA應(yīng)用于乙型肝炎病人早期血清學(xué)診斷的效果最為明顯［5］。臨床上致病菌往往和非致病菌混合在一起，如何從這些細(xì)菌中分離出目標(biāo)菌是關(guān)鍵。免疫磁珠分離技術(shù)(IMBS)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的在微生物檢測(cè)領(lǐng)域中一種新技術(shù)。其基本原理是將特定病原體的單抗或多抗或二抗偶聯(lián)到磁珠微球上，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)形成磁珠—目標(biāo)病原體復(fù)合物或磁珠—一抗—目標(biāo)病原體復(fù)合物，在外部磁場(chǎng)磁力的作用下，將目標(biāo)病原體分離出來(lái)［6］。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了針對(duì)各種病原級(jí)科研和實(shí)驗(yàn)室［7-8］IMBS4h。IMBS［9-13］，0157200cfu·g-12cfu·g-1;IMBS(IMBS-PCR)可對(duì)培養(yǎng)條件IMBS-PCR10h10cfu·g-1，有研究IMBSPCR(IMBSRT-PCR)成功檢測(cè)出了水中的輪狀病毒和草莓的諾如病毒，檢測(cè)時(shí)間大大縮短;Leon-Velarde等利用IMBS結(jié)合酶聯(lián)檢測(cè)，大大提高了沙門菌的檢測(cè)效率?；驒z測(cè)隨著科技水平發(fā)展，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)日新月異，對(duì)病原微生物的鑒定已不再局核酸水平。病原微生物的核酸序列即基因片段都是特異的，有別于其他種或?qū)?，檢測(cè)其特有的基因片段序列可用來(lái)鑒別病原微生物。隨著科技的發(fā)展，基因檢測(cè)技術(shù)逐漸代替其它檢測(cè)技術(shù)，成為臨床檢驗(yàn)科和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室對(duì)病原體的主流檢測(cè)技術(shù)。核酸雜交技術(shù)具有一定互補(bǔ)序列的核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補(bǔ)配在病原微生物檢測(cè)中核酸分子雜交主要包括膜上印跡雜交和核酸原位雜交兩種。膜上印跡雜交是指將核酸從微生物細(xì)胞中分離出來(lái)，純化后在體外結(jié)合到一定的固相支持物上，與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。核酸原位雜交是指標(biāo)記的核酸探針直接與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交。探針還可以用熒光標(biāo)記，在熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡下即可鑒別病原體還可顯示在三維空間中的位置［14］特異。Wong［15］2假單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬的細(xì)菌，最低檢測(cè)限為 103cfu·mL-1，特異度為100%，檢測(cè)時(shí)間不到2h。寡核苷酸探針是針對(duì)病原體特異基因序列設(shè)計(jì)的，可以將待檢測(cè)的病原體定位在不同的分類等級(jí)，如科、屬、種、亞種［16］。(DNAchipDNA(DNAmicroarray)或DNA［17］，是核酸分子雜交技術(shù)發(fā)展延伸而來(lái)的。通DNADNA那些抗生素耐藥、對(duì)那些抗生素敏感。Naas［18］等設(shè)計(jì)的基因芯片可以檢測(cè)出β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因。蔡挺［19］17Batchelor［20］等開(kāi)發(fā)的基因芯片β47降低芯片的制作成本等，而且多數(shù)芯片都需要昂貴的檢測(cè)儀器，這些問(wèn)題使得基因PCR(PolymeraseChainReaction，PCR)是一種在體外是用已知寡核苷酸引物引導(dǎo)未知片段中微量待測(cè)基因片段并進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)。由于PCR20Jbara［22］PCR7587.3100%。1988ChamberianPCRPCRPCR具有:(1)高效性，在同一反應(yīng)體系內(nèi)可同時(shí)檢出多種病原微生物，或?qū)ν徊≡⑸锏牟煌蛣e進(jìn)行分型;(2PCR種肝炎病毒同時(shí)感染;淋球菌、梅毒螺旋體、艾滋病病毒等多重性病病原體的感染;需特殊培養(yǎng)的無(wú)芽胞厭氧菌感染;破傷風(fēng)桿菌，炭疽桿菌，產(chǎn)氣莢膜桿菌，鼠疫耶爾森菌等戰(zhàn)傷感染細(xì)菌感染;(3)經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性，多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)被檢出，節(jié)省試劑、節(jié)約費(fèi)用、節(jié)省時(shí)間，為臨床提供更快更多更準(zhǔn)確的診斷信息。Reyes［23］PCR90100%，敏89%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程。具有高度靈敏、高度特異、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR基因變異分析和預(yù)后評(píng)估等具有重要價(jià)值，為流行病學(xué)調(diào)查提供幫助［24］。王娉等［25］PCRA反映病原體感染和藥物療效，特別適用于不可人工培養(yǎng)和難以培養(yǎng)的病原體如病毒、衣原體等感染的診斷?；蛐酒夹g(shù)與多重PCR結(jié)合可以通過(guò)PCR對(duì)目的基因進(jìn)行放大，通過(guò)基因芯片的熒光探針增加檢測(cè)的靈敏性和特異性，使得兩種檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，已廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)［26］。將病原體特異性基因作為靶基因設(shè)計(jì)出引物與探針，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，制備出寡核苷酸芯片，再對(duì)待測(cè)樣本靶基因進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與病原菌多重PCR基因芯片檢測(cè)體系雜交，可根據(jù)雜交信號(hào)直觀地判讀樣品中所含病原體的種類、型別、毒力、侵襲力，從而對(duì)病原體進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。2000(loop-mediatedisothermalamplificationofDNALAMP)，針對(duì)靶基因序列上6846DNADNALAMPLAMP60min1644×102。有研究報(bào)道［28］LAMP200Variable-numberTandem-repeatAnalysis，MLVA)是一種根據(jù)病原體基因組中可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列的特征來(lái)對(duì)病原體基因分型的一種技術(shù)，廣泛應(yīng)用于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、炭疽芽胞桿菌等的基因分型與鑒定［30］。小結(jié)與展望對(duì)病原體進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)和鑒定是傳染病防治工作的首要問(wèn)題。隨著生物學(xué)研究由宏觀領(lǐng)域向微觀領(lǐng)域的發(fā)展，病原體檢測(cè)方法也從組織形態(tài)學(xué)水平深入到分子水平、基因水平。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的病原微生物高通量檢測(cè)技術(shù)樣本需要量少、快這些高通量診斷技術(shù)和方法必將在病原微生物的診斷分析方面起到越來(lái)越重要的作用，而多種檢測(cè)技術(shù)的聯(lián)合和綜合更是有著廣闊的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn):【相關(guān)文獻(xiàn)】［1］羅淵，劉伯華，祝慶余，等.懸浮芯片在核酸和蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.微生物學(xué)雜志，2007，27(2):78-82.［2］PCR-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用及比較［J］.學(xué)進(jìn)展，2011，39(4):81-83.［3］雍剛，楊曦，廖巫山.三種淋球菌培養(yǎng)基分離效果對(duì)比分析［J］.實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2008，5(2):46-47.［4］蘇盛通，陳惠業(yè)，龐璐，等.中藥改良營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)苛養(yǎng)菌的研究［J］.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8(7):1110-1113.［5］鮑俊杰，楊紅玲，郭彩嬌，等.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法與化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法檢測(cè)廣州地區(qū)兒童HBsAb結(jié)果分析［J］.中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，19(1):44-46.［6］［J］.2011，23(5):478-481.［7］VanheeLM，MeerssemanW，LaqrouK，etal.RapidanddirectquantificationofviableCandidaspeciesinwholebloodbyuseofimmunomagneticseparationandsolid-phasecytometry［J］.JClinMicrobiol，2010，48(4):1126-1131.［8］DattaS，JanesME，SimonsonJG.ImmunomagneticseparationandcoagglutinationofVibrioparahaemolyticuswithanti-flagellarproteinmonoclonalantibody［J］.ClinVaccineImmunol，2008，15(10):1541-1546.［9］YangZY，ShimWB，KimKY，etal.RapiddetectionofenterotoxigenicClostridiumperfringensinmeatsamplesusingimmunomagneticseparationpolymerasechainreaction(IMBS-PCR)［J］.JAgricFoodChem，2010，58(12):7135-7140.［10］楊萬(wàn)，何苗，李丹，等.免疫磁珠分離與實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)水中輪狀病毒的研［J］.環(huán)境科學(xué)，2009，30(5):1368-1375.［11］TatavarthyA，PeakK，VequillaW，etal.AnacceleratedmethodforisolationofSalmonellaentericaserotypeTyphimuriumfromartificiallycontaminatedfoods，usingashortpreenrichment，immunomagneticseparation，andxylose-lysine-desoxycholateagar(6I×method)［J］.JFoodProt，2009，72(3):583-590.［12］ParkY，ChoYH，JeeY，etal.Immunomagneticseparationcombinedwithreal-timereversetranscriptasePCRassaysfordetectionofnorovirusincontaminatedfood［J］.ApplEnvironMicrobiol，2008，74(13):4226-4230.［13］Leon-VelardeCG，ZosherafateinL，OdumeruJA.Applicationofanautomatedimmunomagneticseparation-enzymeimmunoassayforthedetectionofSalmonellaentericasubspeciesentericafrompoultryenvironmentalswabs［J］.JMicrobiolMethods，2009，79(1):13-17.［14］YuregirOO，SahinFI，YilmazZ，etal.Fluorescentinsituhybridizationstudiesinmultiplemyeloma［J］.Hematology，2009，14(2):90-94.［15］WongEH，SubramaniamG，NavaratnamP，etal.Rapiddetectionofnon-enterobacteriaceaedirectlyfrompositivebloodcultureusingfluorescentinsituhybridization［J］.IndianJMedMicrobiol，2007，25(4):391-394.［16］PalominoJC，MartinA，VonGrollA，etal.Rapidculture-basedmethodsfordrug-resistancedetectioninMycobacteriumtuberculosis［J］.JMicrobiolMethods，2008，75(2):161-166.［17］YooSM，LeeSY.DiagnosisofpathogensusingDNAmicroarray［J］.RecentPatBiotechnol，2008，2(2):124-129.［18］NaasT，CuzonG，TruongH，etal.EvaluationofaDNAmicroarray，thecheck-pointsESBS/KPCarray，forrapiddetectionofTEM.SHV，andCTX-Mextended-spectrumbeta-lactamasesandKPCcarbapenemases［J］.AntimicrobAgentsChemother，2010，54(8):3086-3092.［19］［J］醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21(21):4411-4414.［20］BatchelorM，HopkinsKL，LiebanaE，etal.DevelopmentofaminiaturizedmicroarrayfortherapididentificationofantimicrobialresistancegenesinGram-negativebacteria［J］.IntJ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