結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)新進(jìn)展

結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)新進(jìn)展

山東省結(jié)核病防治中心王海英第一頁，共五十二頁。

主要內(nèi)容

結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室常用的診斷技術(shù)和方法結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室新的診斷技術(shù)和方法未來實(shí)驗(yàn)室結(jié)核病的診斷模式2第二頁，共五十二頁。1、細(xì)菌學(xué)方法2、免疫學(xué)方法3、分子生物學(xué)方法33一、目前實(shí)驗(yàn)室常用檢測方法第三頁，共五十二頁。1、細(xì)菌學(xué)方法（抗酸染色雙目顯微鏡、固體或液體培養(yǎng)）44一、目前實(shí)驗(yàn)室常用檢測方法培養(yǎng)onplatesorinbrothidentificationbybiochemicalorserologicaltestsonpuregrowthfromsinglecolony顯微鏡檢查脫色復(fù)染染色unstainedorstainedwithe.g.Gramstain

第四頁，共五十二頁。2、免疫學(xué)方法抗體檢測是結(jié)核病輔助診斷手段，對(duì)菌陰肺結(jié)核有一定的參考價(jià)值。

1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)2、免疫膠體金標(biāo)技術(shù)

55一、目前實(shí)驗(yàn)室常用檢測方法第五頁，共五十二頁。6第六頁，共五十二頁。7潛伏結(jié)核感染者的篩查結(jié)核菌素PPD試驗(yàn)第七頁，共五十二頁。3、分子生物學(xué)方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：也稱分子信標(biāo)技術(shù)，是今年發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。是PCR與核酸探針技術(shù)的結(jié)合，將PCR較高的靈敏度和核酸探針的高特異性相結(jié)合。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

88一、目前實(shí)驗(yàn)室常用檢測方法第八頁，共五十二頁。99

二、

新診斷技術(shù)和方法

分類

新方法用途細(xì)菌學(xué)檢查LED(發(fā)光二極管顯微鏡)涂片檢查

免疫學(xué)方法-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)潛伏感染者分子生物學(xué)LAMP(等溫?cái)U(kuò)增)涂陰\涂陽LPA(線性探針)

MDR-TB,鑒定Genechip(基因芯片)MDR-TB,鑒定GeneXpert(多色巢式定量PCR)耐RFP,涂陰分子分型技術(shù)指紋圖譜分析

其他DNA測序法突變檢測

HPLC胞壁成分檢測

第九頁，共五十二頁。1010

二、

新診斷技術(shù)和方法

1、細(xì)菌學(xué)檢查

發(fā)光二極管（LED）熒光顯微鏡光源壽命長（30,000h）不需要預(yù)熱不需要暗室可用現(xiàn)有的顯微鏡可使用電池電源與通常熒光顯微鏡的判定一致率98.0%第十頁，共五十二頁。兩種方法觀察結(jié)果Z-N染色鏡檢結(jié)果LED鏡檢結(jié)果

二、

新診斷技術(shù)和方法

第十一頁，共五十二頁。中蓋項(xiàng)目LED評(píng)估結(jié)果初診患者LED涂陽患者檢出率為14.96%（552/3691），萋尼氏染色明場顯微鏡涂陽患者檢出率12.46%(460/3691)，前者較后者提高2.5個(gè)百分點(diǎn)（P=0.000）隨訪患者LED和明場顯微鏡的檢出率分別為7.09%(178/2509)和2.83%（71/2509)，提高4.26個(gè)百分點(diǎn)（P=0.000）第十二頁，共五十二頁。中蓋項(xiàng)目LED評(píng)估結(jié)果讀片時(shí)間LED讀片時(shí)間120.03±38.88秒，明場顯微鏡206.31±75.86秒（p=0.00）使用接受度調(diào)查對(duì)于進(jìn)一步推廣建議，大多數(shù)(8/9)認(rèn)為應(yīng)進(jìn)一步推廣，但其中有2人認(rèn)為應(yīng)在日工作量大的實(shí)驗(yàn)室優(yōu)先使用第十三頁，共五十二頁。1414二、

新診斷技術(shù)和方法

單核細(xì)胞分離TB抗原刺激，IFN-

釋放與標(biāo)記的二抗結(jié)合

酶作用標(biāo)記物－顯色每一斑點(diǎn)代表釋放IFN-的一個(gè)細(xì)胞YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYIFN-抗原一抗捕獲IFN-

2、免疫學(xué)方法：-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)第十四頁，共五十二頁。BCG進(jìn)化過程第十五頁，共五十二頁。1616二、

新診斷技術(shù)和方法分子生物學(xué)LAMP(等溫?cái)U(kuò)增)LPA(線性探針)Genechip(基因芯片)GeneXpert(多色巢式定量PCR)分子分型技術(shù)第十六頁，共五十二頁。1717二、

新診斷技術(shù)和方法（1）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)：Eiken,Japan?可同時(shí)檢測患者是否感染結(jié)核所用儀器設(shè)備極其簡單63℃擴(kuò)增（避免非特異性擴(kuò)增多對(duì)引物（提高特異性和速度）：靶基因6個(gè)不同區(qū)域，設(shè)計(jì)4種引物?對(duì)涂陰培陽病人具有非常高的敏感性和特異性?密閉系統(tǒng)(沒有污染的風(fēng)險(xiǎn)）?快速，兩小時(shí)內(nèi)即可得到檢測結(jié)果，?肉眼觀察

第十七頁，共五十二頁。1818二、

新診斷技術(shù)和方法（1）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)臨床標(biāo)本（咯痰等）DNA提取基因擴(kuò)增基因檢出標(biāo)本處理Extractionsolution1and210min,100℃1min,2000gSupernatant，captureDNAReconstitutereactionmix40min,67℃LAMPamplification＋－第十八頁，共五十二頁。PCR

LAMP?需要使用PCR擴(kuò)增儀?設(shè)計(jì)特異性的兩條引物?擴(kuò)增效率:107?不需要使用PCR擴(kuò)增儀?多對(duì)引物保證擴(kuò)增的特異性?擴(kuò)增效率:1010二、

新診斷技術(shù)和方法（1）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)19第十九頁，共五十二頁。2020二、

新診斷技術(shù)和方法3、分子生物學(xué)（2）

線性探針檢測技術(shù)（LPA）可進(jìn)行結(jié)核桿菌復(fù)合群的鑒定可用于MDR-TB高危人群的篩查對(duì)利福平的抗藥性(通過檢測rpoB基因的最常見突變)對(duì)異煙肼的抗藥性(通過檢測katG基因和inhA基因的最常見突變)檢測的樣本可以是純培養(yǎng)物或是涂片陽性的痰標(biāo)本內(nèi)部控制保證了結(jié)果的正確可以獲得商品化的試劑盒約五小時(shí)內(nèi)即可得到檢測結(jié)果需要配備生物安全柜的生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室需要至少三間房子Whopolicystatement，June2008第二十頁，共五十二頁。2121二、

新診斷技術(shù)和方法3、分子生物學(xué)（2）

線性探針檢測技術(shù)（LPA）耐藥分子診斷的基本原理利福平/異煙肼耐藥性的產(chǎn)生與結(jié)核分枝桿菌特定基因某些位點(diǎn)的突變相關(guān)。抗結(jié)核藥基因基因功能耐藥百分比利福平rpoB編碼DNA依賴RNA聚合酶，參與mRNA轉(zhuǎn)錄過程>90%異煙肼katG編碼過氧化氫-過氧化物酶，參與INH體內(nèi)的轉(zhuǎn)化40-100%高水平耐藥inhA編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依賴的enoyl-ACP還原酶，參與脂酸的合成appr25%低水平耐藥第二十一頁，共五十二頁。2222

DNA提取標(biāo)本①固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌種②抗酸染色涂片陽性標(biāo)本方法①超聲波裂解②GenoLyse試劑盒0.5～1

h第二十二頁，共五十二頁。2323

PCR擴(kuò)增①不同標(biāo)本,擴(kuò)增參數(shù)不同培養(yǎng)菌種：擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)涂陽標(biāo)本：擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)②引物：生物素標(biāo)記③多重PCR擴(kuò)增2.5～3h第二十三頁，共五十二頁。2424

雜交采用反向雜交法:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物→變性（DNA成單鏈）→與線性探針雜交→洗滌→顯色→判斷結(jié)果1～2h第二十四頁，共五十二頁。2525

結(jié)果判讀0.5h第二十五頁，共五十二頁。

中蓋項(xiàng)目線性探針檢測利福平評(píng)價(jià)

利福平線性探針傳統(tǒng)藥敏合計(jì)一致率靈敏度特異性PPVNPV耐藥敏感合計(jì)耐藥1354117693.6%75.0%96.5%76.7%96.2%敏感451127172合HOPOLICYSTATEMENT27JUNE2008通過系統(tǒng)評(píng)估和META分析（和DST比較）：結(jié)核分枝桿菌或涂陽的痰標(biāo)本RIP：敏感性≥97%，特異性≥99%第二十六頁，共五十二頁。

中蓋項(xiàng)目線性探針檢測異煙肼評(píng)價(jià)

異煙肼線性探針傳統(tǒng)藥敏總計(jì)一致率靈敏度特異性PPVNPV耐藥敏感合計(jì)耐藥1493017993.2%71.0%97.4%83.2%94.8%敏感6111081169合計(jì)21011381348WHOPOLICYSTATEMENT27JUNE2008通過系統(tǒng)評(píng)估和META分析（和DST比較）：結(jié)核分枝桿菌或涂陽的痰標(biāo)本INH：敏感性≥90%，特異性≥99%第二十七頁，共五十二頁。

中蓋項(xiàng)目線性探針檢測MDR評(píng)價(jià)

MDR線性探針傳統(tǒng)合計(jì)一致率靈敏度特異性PPVNPVMDR非-MDR合計(jì)MDR792810795.0%66.4%97.7%73.8%96.8%非-MDR4012011241合計(jì)11912291348WHOPOLICYSTATEMENT27JUNE2008通過系統(tǒng)評(píng)估和META分析（和DST比較）：結(jié)核分枝桿菌或涂陽的痰標(biāo)本MDR-TB檢測準(zhǔn)確性：99%。第二十八頁，共五十二頁。WHOPOLICYSTATEMENT

27JUNE2008countylevel.線性探針分析不能替代目前傳統(tǒng)的培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，涂陰標(biāo)本和XDR-TB的證實(shí)都需要進(jìn)行傳統(tǒng)的培養(yǎng)。29第二十九頁，共五十二頁?；蛐酒蛐酒覆捎霉鈱?dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將核酸片段有序地固化于支持物的表面，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。二、

新診斷技術(shù)和方法（3）Genechip(基因芯片)30第三十頁，共五十二頁。檢測過程雜交反應(yīng)雜交清洗清洗干燥掃描檢測數(shù)據(jù)分析檢測分析PCR擴(kuò)增DNA提取樣品制備二、

新診斷技術(shù)和方法（3）Genechip(基因芯片)31第三十一頁，共五十二頁。芯片結(jié)果圖例芯片雜交質(zhì)控芯片制備質(zhì)控芯片制備質(zhì)控芯片雜交質(zhì)控靶基因擴(kuò)增質(zhì)控陰性對(duì)照質(zhì)控空白對(duì)照質(zhì)控二、

新診斷技術(shù)和方法（3）Genechip(基因芯片)32第三十二頁，共五十二頁。3333二、

新診斷技術(shù)和方法（3）Genechip(基因芯片)結(jié)核耐藥檢測基因芯片結(jié)核耐藥檢測芯片獲北京市自主創(chuàng)新產(chǎn)品證書獲國家醫(yī)療器械證書和歐盟CE認(rèn)證樣品制備儀雜交儀通

量：兩個(gè)一線抗結(jié)核藥速

度：

6小時(shí)（比傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)法快50-100倍）靈敏度：103CFU/反應(yīng)特異性：對(duì)照設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)；自動(dòng)判讀基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測分離株或者痰樣本中結(jié)核桿菌多藥耐藥（利福平、異煙肼）。軟件判讀激光共焦掃描儀InternationalJournalofTuberculosisandLungDisease,13:914-920,2009（IF=2.3）第三十三頁，共五十二頁。是一種半定量巢式實(shí)時(shí)PCR的檢測方法，能檢測桿菌和利福平耐藥性。擴(kuò)增出ropB基因含有81bp的核心區(qū)序列，探針能夠區(qū)分野生型基因序列與突變型基因序列。集樣本準(zhǔn)備、擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測于一體。盒子中含有凍干的試劑，緩沖液和洗滌液。使用6色激光檢測裝置對(duì)靶核酸進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。二、

新診斷技術(shù)和方法（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)檢測技術(shù)34第三十四頁，共五十二頁。?標(biāo)本類型：臨床痰標(biāo)本，或濃縮處理后的標(biāo)本（涂陽或涂陰培陽），不能用于用于治療隨訪的病人。?對(duì)涂陰培陽病人具有非常高的敏感性和特異性?可同時(shí)檢測患者是否結(jié)核以及是否對(duì)利福平耐藥?兩小時(shí)內(nèi)即可得到檢測結(jié)果，所用儀器設(shè)備簡單?不需要生物安全柜，滿足涂片試驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)室?二、

新診斷技術(shù)和方法（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)檢測技術(shù)35第三十五頁，共五十二頁。?利福平耐藥陰性預(yù)測值：

在結(jié)核病利福平耐藥流行低或高的地區(qū)，NPV大于99%.即陰性結(jié)果能排除RIP耐藥?利福平耐藥陽性預(yù)測值：RIP耐藥流行＞15%，PPV＞90%RIP耐藥流行5%～10%，PPV：71%～84%RIP耐藥流行＜5%，PPV：＜70%，在這種情況下，RIP耐藥的結(jié)果需要傳統(tǒng)的DST證實(shí)。二、

新診斷技術(shù)和方法（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)檢測技術(shù)36第三十六頁，共五十二頁?；诤怂釘U(kuò)增的一步法利福平耐藥檢測XpertTMMTB/Rif技術(shù)平臺(tái)利福平的耐藥性分析

喹諾酮類藥物耐藥性

HIV病毒載量分析自動(dòng)化得標(biāo)本處理和檢測，可以在2小時(shí)內(nèi)出結(jié)果二、

新診斷技術(shù)和方法（4）GeneXpert(多色巢式定量PCR)檢測技術(shù)第三十七頁，共五十二頁。3838結(jié)核分枝桿菌菌株水平鑒定最早采用生化分析、血清學(xué)技術(shù)和噬菌體分型等技術(shù)進(jìn)行分析，但由于這些方法的局限性而未得到廣泛應(yīng)用?；诤怂峄A(chǔ)上的分子流行病學(xué)研究技術(shù)是對(duì)結(jié)核病等感染性疾病進(jìn)行檢測的一個(gè)強(qiáng)有力的手段，可以進(jìn)行結(jié)核菌傳播的研究，結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室交叉污染的研究，判斷結(jié)核再感染或復(fù)發(fā)以及國際間傳播的研究。二、

新診斷技術(shù)和方法（5）分子分型技術(shù)第三十八頁，共五十二頁。3939

簡單介紹以下三種分型技術(shù)：（1）插入序列6110限制性片段長度多態(tài)性分析：IS6110（2）直接重復(fù)片段及寡核苷酸多態(tài)性分型：間隔寡核苷酸分

型(spaceroligonucleotidetyping,Spoligotyping)（3）分枝桿菌分散重復(fù)單元-可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列：(mycobacterialinterspersedrepetitiveunits-variablenumbertandemrepeats,MIRU-VNTR)二、

新診斷技術(shù)和方法3、分子生物學(xué)（5）分子分型技術(shù)第三十九頁，共五十二頁。4040插入序列6110限制性片段長度多態(tài)性分析：

IS6110是一個(gè)只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群基因組中的插入序列，長度為1355bp，具有高度的保守性，屬于IS3家族。不同結(jié)核菌株IS6110的數(shù)目和位置不同。在IS6110序列中，限制性內(nèi)切酶PvuII的酶切位點(diǎn)只有一個(gè)，經(jīng)酶切后產(chǎn)生大小兩個(gè)不同的片段，再與只針對(duì)酶切位點(diǎn)右側(cè)的245bp探針雜交，則雜交后產(chǎn)生的條帶數(shù)即為菌株IS6110拷貝數(shù)。二、

新診斷技術(shù)和方法（5）分子分型技術(shù)第四十頁，共五十二頁。4141插入序列6110限制性片段長度多態(tài)性分析：IS6110這種方法存在一定的缺陷：①對(duì)于基因組中IS6110低拷貝<6或缺陷的分辨能力有限；②需要大量的基因組DNA，操作步驟繁瑣且工作量大；③各實(shí)驗(yàn)室所采用的IS6110-RFLP分型方法的標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，不同實(shí)驗(yàn)室的IS6110-RFLP分型結(jié)果難于進(jìn)行比對(duì)。二、

新診斷技術(shù)和方法（5）分子分型技術(shù)第四十一頁，共五十二頁。4242直接重復(fù)片段及寡核苷酸多態(tài)性分型：

基于直接重復(fù)區(qū)（RD區(qū)）的多態(tài)性。DR區(qū)只出現(xiàn)于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中。由若干個(gè)保守的長為36bp的直接重復(fù)序列組成，并被非重復(fù)序列即間隔區(qū)分開。每隔間隔區(qū)序列長為34-41bp。通常間隔區(qū)的順序在所有菌株都是相同的，但可能發(fā)生某一間隔區(qū)的插入或缺失，因此利用Spoligotyping就可以對(duì)結(jié)核分支桿菌進(jìn)行株水平的鑒定。

可以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和M.bovis以及M.bovisBCG二、

新診斷技術(shù)和方法（5）分子分型技術(shù)第四十二頁，共五十二頁。4343直接重復(fù)片段及寡核苷酸多態(tài)性分型：Spoligotyping①該方法對(duì)菌株的分辨能力明顯弱于IS6110一RFLP方法，特別是不能有效分辨北京家族菌株，而在我國目前流行的結(jié)核菌株中，大約50%屬于北京家族；②同時(shí)與其他方法相比有高估菌株間流行病學(xué)聯(lián)系的傾向。二、

新診斷技術(shù)和方法3、分子生物學(xué)第四十三頁，共五十二頁。4444可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列：MIRU-VNTR該技術(shù)是近年發(fā)展起來的以PCR為基礎(chǔ)的分型技術(shù)。MIRU為40-100bp的DNA元件，通常以串聯(lián)重復(fù)形式散步于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群基因中。H37Rv基因組中含41個(gè)MIRU區(qū)，其中有12個(gè)區(qū)具有多態(tài)性，其拷貝數(shù)在不同菌株之間12個(gè)區(qū)拷貝數(shù)在不同菌株之間存在差異。MIRU技術(shù)利用不同菌株之間這12個(gè)區(qū)拷貝數(shù)的差異達(dá)到鑒定菌株的目的。二、

新診斷技術(shù)和方法3、分子生物學(xué)第四十四頁，共五十二頁。4545可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列：MIRU-VNTR該方法操作簡單,分辨率高,結(jié)果容易分析,具有很高的可重復(fù)性,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間具有非常好的可比性,并能提供數(shù)字化的分型信息,適宜于進(jìn)行大量樣本和網(wǎng)絡(luò)化分析。二、

新診斷技術(shù)和方法3、分子生物學(xué)（5）分子分型技術(shù)第四十五頁，共五十二頁。4646DNA測序法被認(rèn)為是檢測變異的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可檢測出待檢基因上的所有突變位置和突變情況。已用于RFP、INH、PZA、EMB等耐藥基因的檢測。

缺陷：專業(yè)設(shè)備，專業(yè)技術(shù)，限制其廣泛應(yīng)用。

二、

新診斷技術(shù)和方法

4、其他（1）DNA測序法第四十六頁，共五十二頁。4747在應(yīng)用某項(xiàng)新技術(shù)時(shí)，需要考慮的一般性問題：——是否有足夠的經(jīng)過培訓(xùn)的人員——有效的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體制——能否得到備用設(shè)備和耗材——技術(shù)支持的可獲得程度——工作環(huán)境的條件

等等

二、

新診斷技術(shù)和方法

第四十七頁，共五十二頁。未來實(shí)驗(yàn)室的診斷模式

需要8-10周時(shí)間需要4天時(shí)間患者標(biāo)本分子方法傳統(tǒng)方法菌種鑒定藥敏試驗(yàn)涂片培養(yǎng)菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)第四十八頁，共五十二頁