細(xì)胞生物技術(shù)-1.傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)課流程安 （P1000,P200,實(shí)驗(yàn)原理及相關(guān) 關(guān)于轉(zhuǎn)染Transfectionistheprocessof yintroducingnucleicacidscells.Thetermisusednotablyfornon-viralmethodsineukaryoticGeneticmaterial(suchassupercoiledplasmidDNAorsiRNAorevenproteinssuchasantibodies,maybeTransfectionofanimalcellstypicallyinvolvesopeningtransientpores"holes"inthecellmembrane,toallowtheuptakeofDNA小片 體細(xì)胞或細(xì)胞系的過(guò)程，指真核細(xì)胞由于外源DNA摻入獲得新的遺傳標(biāo)志的過(guò)若與宿主細(xì)胞DNA整合并隨后者 稱“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染“瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(transienttransfection)外源DNA不整合到宿主中，因此一個(gè)宿主適用于驗(yàn)證質(zhì)?；蚰康牡谋磉_(dá)情況和監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染步驟的效率?？梢杂脠?bào)告確定優(yōu)化條件。若與宿主細(xì)胞DNA整合并隨后者的而稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(stabletransfection)大部分外源DNA會(huì)被核酸酶降解或隨細(xì)胞而稀釋，僅小部分整合到組上。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)轉(zhuǎn)化(transformation指將質(zhì)粒或其他外源DNA導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)由噬菌體將一個(gè)細(xì)胞的 轉(zhuǎn)染的方TherearevariousmethodsofintroducingforeignDNAintoaeukaryoticChemical-basedtransfection：calciumphosphate；liposomesNonchemicalmethods：ElectroporationParticle-basedmethods：geneViralmethods：viralOther(andhybrid)methods：nucleofection；heat 轉(zhuǎn)染脂（lipe）是磷脂分散在水中時(shí)形成的脂運(yùn)用脂進(jìn)入細(xì)胞的載體。陽(yáng)離子脂表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過(guò)靜電作用將DNA分子入內(nèi)，形成DNA-脂透作用，將N傳遞進(jìn)入細(xì)胞。其中一小部分N

++ ++

— + —+++—

— 細(xì) ————轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的要 轉(zhuǎn)染對(duì)DNA的要求 靶 后小時(shí)在細(xì)內(nèi)進(jìn)行靶 表達(dá)的檢測(cè)等實(shí)。如建立定的胞系則可靶同 最常用的直核表達(dá) 載的標(biāo)物有霉素grcn）和新霉（c）關(guān)于報(bào) (reporter 把它的編碼序列和 表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成合 的 合調(diào)列制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定目的 熒光蛋白報(bào)告系統(tǒng)(GFP)關(guān)于綠色熒光蛋綠色螢光蛋白(greenfluorescentprotein)，簡(jiǎn)稱GFP，最早在一種學(xué)名Aequoreavictoria的水母中發(fā)現(xiàn)。其 基酸殘基組成的單鏈，在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，會(huì)發(fā)出綠色熒光。由水母Aequoreavictoria中發(fā)現(xiàn)的野生型綠色螢光蛋白，395nm和475nm分GF-螺旋上，是蛋白質(zhì)自身催化環(huán)化的結(jié)果，由于環(huán)化是一個(gè)有氧過(guò)程，O使r脫氫氧化形成生色團(tuán)。因此在嚴(yán)格厭氧條件下GF 科學(xué)家下村修（伍茲霍爾海洋生物 ）科學(xué)家馬查爾菲（哥倫比亞大學(xué)）和錢永健（加利福尼亞大學(xué)圣迭戈分校因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)和改造綠色熒光蛋白而獲得了當(dāng)年0）的 化學(xué)獎(jiǎng)。 例：在一96孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，并以一編碼hGRGFP蛋白的質(zhì)粒的組成要 起始位點(diǎn)Ori即控制 b抗生素抗 可以便于加以檢測(cè)，如Amp+c多克隆位點(diǎn)MCS，攜帶外 片dP/E啟動(dòng)子/增強(qiáng)eTerms終止信f加poly（A）信號(hào)可以起到穩(wěn)定mRNA作pEGFP-N1載體具有以下幾方面特點(diǎn)①該質(zhì)粒具有很強(qiáng)的能力，可以滿足隨宿主細(xì)胞時(shí)跟隨胞質(zhì)遺傳給新生的子細(xì)胞，這是保證目的穩(wěn)定表達(dá)的因一以使目的在增殖的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)③具有多克隆位點(diǎn)，便于目的的④該載體具有neo，可以采用G418來(lái)篩選已成這些特殊的結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)目的在靶細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)載體名稱：pEYFP-載體宿主：大腸桿菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞（E.coliMammaliancells）真核篩選標(biāo)記：新霉素 引物：EGFP-NSequencingPrimer6479- 引物：EGFP-CSequencingPrimer6478-載體描述：encodesanenhancedyellow-greenvariantoftheAequoreavictoriagreenfluorescentprotein(GFP).該載體表達(dá)一個(gè)增強(qiáng)信號(hào)的黃色螢光蛋白，的外源位于黃色螢光蛋白的3端，因此表達(dá)的蛋白為螢光蛋白在N端，外源在C端。該類載體可用于檢測(cè)蛋白的定位，分析蛋白在細(xì)胞中的，以及不同蛋白的共pEYFP-C1,PEGFP-在用pEYFP-C1構(gòu)建熒光蛋白融合表達(dá)載體時(shí)， 用pEGFP-N1構(gòu)建熒光蛋白融合表達(dá)載體時(shí),需要 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)原傳代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一。也是幾乎所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細(xì)胞才能繼續(xù)生長(zhǎng)。這一過(guò)程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)所需。(本)貼壁細(xì)胞消化后的應(yīng)用除了繼續(xù)傳代培養(yǎng)外，貼壁細(xì)胞消化后還可有許多其他的應(yīng)用1、計(jì)數(shù)、計(jì)算細(xì) ，了解細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況、 細(xì)胞懸液，以備后期的繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。（重新鋪板，MTT實(shí)驗(yàn)；標(biāo)記流式分析、分選；爬片、免疫熒光；電轉(zhuǎn)；提取和分離；洗滌、動(dòng)物注射等）**傳代培養(yǎng)操一）細(xì)胞的傳代和計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)步代。2、吸去培養(yǎng)皿中原有的細(xì)胞培養(yǎng)加高壓滅菌過(guò)PB，以洗去培養(yǎng)液的殘留（培養(yǎng)液中的 會(huì)抑制胰酶的消化作用）。4、吸去PBS，加200μl0.25％的胰蛋白酶，蓋上蓋輕輕搖晃，使胰酶能均勻地作用于所有皿底的細(xì)胞?！娣昼?，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)觀察到細(xì)胞收回突起變圓時(shí)，加0的含的新鮮反復(fù)輕輕吹打，制成細(xì)代代照傳2或者傳等比例進(jìn)行，也可在完成計(jì)數(shù)后，按一定如液濃度過(guò)大，需先按一定比例稀釋后，再進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)還可計(jì)算出細(xì)胞的 。以稀釋倍為l前）入有l(wèi)PBS的Ependor管中，混勻后吸0l加到數(shù)。6、完成細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞濃度(個(gè)/ml)＝4個(gè)中方格內(nèi)胞總數(shù)/4104×稀釋倍數(shù)（5倍）7、將2.5104個(gè)活細(xì)胞傳35mm的培養(yǎng)Facilitiesforcounting細(xì)胞濃度(個(gè)/ml4個(gè)中方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)/4×104tationofcellviabilitybytrypanblueexclusion.Mixasmallaliquotofcellsuspensionwithanequalvolumeof0.4%trypanblueGFP轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)實(shí)驗(yàn)?zāi)坎牧?、試轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞源DNA摻 具有無(wú)限增殖能力的細(xì)胞1951年誕生至被廣泛應(yīng)用于腫瘤物實(shí)驗(yàn)或者細(xì) 轉(zhuǎn)染試研發(fā)的一種新型陽(yáng)離子貼壁或懸浮細(xì)胞的瞬轉(zhuǎn)及穩(wěn)適用于 的培養(yǎng)毒性低，效率高且穩(wěn)適用于Opti-Opti-MEM?無(wú) 培養(yǎng)基是EMEM的改良型，其中使用了HEPES和碳酸氫鈉進(jìn)行緩沖，并添加次 素和生長(zhǎng)因子。在含 細(xì)胞都能轉(zhuǎn)移到Opti-MEM?培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中 和抗生素影響DNA和HilyMax復(fù)合體形，操作時(shí)注意去除該干擾EMEM是最低必需培養(yǎng)液（Eagle'sminimummedium細(xì)胞轉(zhuǎn)染操4ulHilyMax120ulOpti-MEM pEGFP-N14、培養(yǎng)：37℃5%CO2培養(yǎng)箱24~48注意事 5、分組操作移液槍的使熒光顯微鏡的使熒光顯微鏡的原理、構(gòu)它是由壓光源、濾片系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部 DMI3000B倒置熒光顯微－投射電源開(kāi)－聚光 －載物－物 －調(diào) －透射光檔3－載物 －CCD光 活動(dòng) DMI3000B倒置熒光顯－聚光－載物－物－調(diào) －熒光獨(dú)立電－熒光光柵拉 －熒光轉(zhuǎn) 57注意事項(xiàng) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察及分熒光蛋白轉(zhuǎn)染效率觀明場(chǎng)觀

實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察及分實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察及分熒光下觀實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察及分熒光蛋白顯微觀實(shí)驗(yàn)結(jié)果和記一、每個(gè)實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄表實(shí)驗(yàn)組 123細(xì)胞總活細(xì)胞細(xì)平實(shí)驗(yàn)結(jié)果和記細(xì)胞熒光表達(dá)率的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組（A1-視123總效實(shí)驗(yàn)組值12345平均染效LipofectamineLTX試劑是專門進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的試劑，關(guān)于 轉(zhuǎn)染AveryefficientmethodistheinclusionoftheDNAtobetransfectedinliposomes,i.e.small,membrane-boundedbodiesthatareinsomewayssimilartothestructureofacellandcanactuallyfusewiththecellmembrane,releasingtheDNAintothecell.Foreukaryoticcells,transfectionisbetterachievedusingcationiclipids(ormixtures),becausethecellsaremoresensitive.ApopularagentwasDOPA,andnowmoreeffectivelyLipofectamineandUptiFectin.LipofectamineorLipofectamine2000isacommontransfectionreagent.ItisusedtointroducesiRNAorplasmidDNAintoinvitrocellcultures.ImportantGuidelinesforTransfectionwithTheadditionofantibioticstomediaduringtransfectionmayresultindeathinsomecelllines.Testeachcellline forspecializedtransfectionprotocols(includingcell-typespecificadviceonuseofantibiotics,andaprotocolforvector-basedRNAi). mendOpti-MEM?IReducedSerumMediumtodilutetheandLipofectamine?LTXReagentbeforeMaintainthesameseedingconditionsbetweencanbeperformedbothinthepresenceorabsenceof 400 Note:ReadImportantGuidelinesforTransfectionbeforeusingAdherentcells:Onedaybeforetransfection,platecellsin1600μlofgrowthmedium(ina3.5cm-dish)sothatthecellswillbe50–80%confluentatthetimeoftransfection.Foreachtransfectionsample,preparecomplexesasDilutethe1g(2l)ofplasmidDNAin400μlOpti-MEM?IReducedMedium.MixMixLipofectamine?LTXgentlybeforeuse,andadd5lLTXdirectlytodilutedDNA.MixIncubatefor30minutesatroomtemperature.DNA-lipidcomplexesstablefor6hoursatroomAdd~40