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血清總膽紅素及結(jié)合膽紅素測定Ⅰ重氮反應法測定總膽紅素和結(jié)合膽紅素【實驗原理】

血清中結(jié)合膽紅素可直接與重氮試劑反應，產(chǎn)生偶氮膽紅素；非結(jié)合膽紅素須有加速劑咖啡因-苯甲酸鈉-醋酸鈉作用，其分子內(nèi)氫鍵破壞后才能與重氮試劑反應，也產(chǎn)生偶氮膽紅素。本法重氮反應pH6.5，最后加入堿性酒石酸鈉使紫色偶氮膽紅素(吸收峰530nm)轉(zhuǎn)變成藍色偶氮膽紅素，在600nm波長比色，使檢測靈敏度提高。

【試劑】1．咖啡因-苯甲酸鈉試劑2．堿性酒石酸鈉溶液3．72.5mmol/L亞硝酸鈉溶液4．28.9mmol/L對氨基苯磺酸溶液5．重氮試劑6．5.0g/L疊氮鈉溶液。7．膽紅素標準液

【操作步驟】1.樣品的測定取3支試管，按下表程序操作.

混勻后，波長600nm，對照管調(diào)零，讀取吸光度，在標準曲線上查出相應的膽紅素濃度。2.標準曲線制作

取5支試管，分別編號，然后按表稀釋膽紅素儲存液配制膽紅素標準液。

混勻(不可產(chǎn)生氣泡)，按總膽紅素測定法操作。每一濃度作3個平行管，并分別做標準對照管，用各自的標準對照管調(diào)零，讀取標準管的吸光度。配制標準液用的溶劑血清中尚有少量膽紅素，同樣測定后得一吸光度值。每個標準管的吸光度值均應減去此吸光度，然后與相應膽紅素濃度繪制標準曲線

2．血清結(jié)合膽紅素測定的意義結(jié)合膽紅素與總膽紅素的比值可用于鑒別黃疸類型。(1)比值＜20%溶血性黃疸，陣發(fā)性血紅蛋白尿，惡性貧血，紅細胞增多癥等。(2)比值40%～60%肝細胞性黃疸。(3)比值＞60%阻塞性黃疸。但以上幾類黃疸，尤其是(2)、(3)類之間有重疊?！九R床意義】

【原理】膽紅素呈黃色，在450nm附近有最大吸收峰。膽紅素氧化酶(BOD)催化膽紅素氧化，隨著膽紅素被氧化，A450nm下降，下降程度與膽紅素被氧化的量相關。在pH8.0條件下，未結(jié)合膽紅素及結(jié)合膽紅素均被氧化，因而檢測450nm吸光度的下降值可反映總膽紅素含量；加入SDS及膽酸鈉等陰離子表面活性劑可促進其氧化。在pH3.7～4.5緩沖液中，BOD催化單葡萄糖醛酸膽紅素(mBc)、雙葡萄糖醛酸膽紅素(dBc)及大部分δ膽紅素氧化，非結(jié)合膽紅素(Bu)在此pH條件下不被氧化。用配制于人血清中的二?；撬崮懠t素(ditaurobilirubin，DTB)作標準品，檢測此條件下450nm吸光度的下降值可反映結(jié)合膽紅素的含量?！静僮鞑襟E】總膽紅素和結(jié)合膽紅素測定分別按表標準管進行。取4支試管，標明標準空白管，測定空白管，標準管和測定管。加入BOD工作液后立即混勻，置37C水浴5min

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