細(xì)胞重編程與iPSCs

細(xì)胞重編程與iPSCsZujia.W摘要：通過實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段可以逆轉(zhuǎn)終末分化細(xì)胞的分化進(jìn)程，從一種基因表達(dá)譜轉(zhuǎn)換成另一套表達(dá)譜，這種實(shí)現(xiàn)細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化的方法稱為“重編程”。目前重編程的主要策略有：體細(xì)胞核移植技術(shù)，細(xì)胞融合，誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞，譜系轉(zhuǎn)化，胞質(zhì)孵育，多能細(xì)胞提取物共培養(yǎng)等。由于細(xì)胞重編程的過程能夠?qū)⒓?xì)胞命運(yùn)逆轉(zhuǎn)成為具有再生能力干細(xì)胞的狀態(tài),因此,細(xì)胞重編程技術(shù)能為再生醫(yī)學(xué)、疾病個(gè)體化治療及藥物篩選提供巨大的前景。關(guān)鍵詞：重編程核移植細(xì)胞融合誘導(dǎo)多能干細(xì)胞ABSTRACT:Theprocessofdifferentiationinterminaldifferentiatedcellscanbereversedthroughexperimentaltechniques,andthegeneexpressionspectrumofcellscanchangefromoneformintoanother.Themethodforrealizationofcelltypetransformationcalled"reprogramming."Themainstrategiesofreprogramminginclude:somaticcellnucleartransfer,cellfusion,inducedpluripotentstemcells,lineagetransformation,cytoplasmicincubation,co-culturewithpluripotentcellextractandsoon.Becausecellreprogrammingcanreversethefateofcellsintoregenerativestemcells,cellreprogrammingtechnologycanprovidegreatpotentialforregenerativemedicine,individualizeddiseasetreatmentanddrugscreening.Keywords:reprogrammingnucleartransfercellfusioninducedpluripotentstemcell細(xì)胞是人體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。成人體內(nèi)的細(xì)胞大概有40-60萬億個(gè)，細(xì)胞種類也是成千上萬的。不同種類的細(xì)胞有著不同的基因表達(dá)譜，從而表現(xiàn)出不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)，具有著不同的生理功能。除了人體細(xì)胞數(shù)量之龐大、功能之復(fù)雜令人震驚之外，更為讓人驚嘆的是人所有的細(xì)胞都來自于一個(gè)細(xì)胞——受精卵。受精卵具有全能性，可逐漸形成人體的不同種類細(xì)胞，這種從同一來源細(xì)胞逐漸產(chǎn)生出形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能特征不同的細(xì)胞系的過程稱為“分化”。多細(xì)胞生物個(gè)體的細(xì)胞分化，受到一系列動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制的調(diào)控并維持其穩(wěn)態(tài),。不同類型分化細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)化不會(huì)在自然條件下自發(fā)發(fā)生，而通過實(shí)驗(yàn)手段可以在體外逆轉(zhuǎn)細(xì)胞分化的進(jìn)程，使其從一種基因表達(dá)譜轉(zhuǎn)換成另一套表達(dá)譜,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)化，這個(gè)過程稱為“重編程”。目前已知的重編程策略主要有：體細(xì)胞核移植技術(shù)，細(xì)胞融合，誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞，譜系轉(zhuǎn)化，胞質(zhì)孵育，多能細(xì)胞提取物共培養(yǎng)等。重編程的關(guān)鍵是有效開啟基因組，從而使得重編程因子與調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合，便于染色質(zhì)重構(gòu)，介導(dǎo)基因表達(dá)改變［1］。一．體細(xì)胞核移植技術(shù)細(xì)胞核移植技術(shù)(somaticcellnucleartransfer)，是指將一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核移植至去核的卵母細(xì)胞中，產(chǎn)生與供細(xì)胞核動(dòng)物的遺傳成份一樣的動(dòng)物的技術(shù)。目前，科學(xué)家們已經(jīng)先后利用這種技術(shù)，克隆出了綿羊、小鼠、牛、豬、山羊等動(dòng)物。最早的核移植是在兩棲動(dòng)物一一非洲爪蟾上嘗試的，并且成功的孵育出了蝌蚪⑵。最為大家熟知的克隆動(dòng)物——世界上第一只克隆羊“多莉”，在1997年被成功地克隆出來，這標(biāo)志著細(xì)胞核移植技術(shù)第一次應(yīng)用在哺乳動(dòng)物身上。細(xì)胞核移植的效率受到多種因素的制約。普遍認(rèn)為，核移植至去核卵母細(xì)胞策略的效率低與DNA甲基化有關(guān)，核移植胚胎發(fā)育異常往往與DNA甲基化缺陷有關(guān)。同時(shí)還有有研究表明，供體細(xì)胞的分化程度也與重編程效率密切相關(guān)：分化程度越低，核重編程的效率越高⑶。另外，組蛋白的修飾，染色體重構(gòu)，基因組印記去除等其他因素也會(huì)影響核移植的效率。核移植技術(shù)的誕生盡管在保存瀕危物種、獨(dú)特的動(dòng)物基因型和轉(zhuǎn)基因等多領(lǐng)域取得了巨大成就，但到目前為止，克隆效率一直很低，家畜產(chǎn)活的后代的比率僅在4%以下，克隆后代也常出現(xiàn)體重較大及對(duì)外界環(huán)境適應(yīng)性差等問題。并且細(xì)胞核移植技術(shù)需要充足的卵細(xì)胞來源，還會(huì)破壞胚胎，受到了極大的倫理質(zhì)疑和挑戰(zhàn)。這些問題在一定程度上制約了該項(xiàng)技術(shù)的快速發(fā)展。二、細(xì)胞融合細(xì)胞融合(cellfusion)是指在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，兩個(gè)不同基因型的細(xì)胞或原生質(zhì)體融合形成一個(gè)雜種細(xì)胞?；具^程包括細(xì)胞融合形成異核體(heterokaryon)、異核體通過細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行核融合、最終形成單核的雜種細(xì)胞。融合的兩個(gè)細(xì)胞中一個(gè)對(duì)另一個(gè)起明顯支配作用,將自己的狀態(tài)強(qiáng)加于另一個(gè)細(xì)胞。所以我們可以通過與胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞等多能性細(xì)胞融合形成雜種細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞重編程。這樣形成的融合細(xì)胞中多能性細(xì)胞處于統(tǒng)治地位,因而體細(xì)胞會(huì)向類多能性細(xì)胞轉(zhuǎn)變，并且能表現(xiàn)出多能性細(xì)胞的所有分子特征。理論上說，任何細(xì)胞都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源，這對(duì)于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。并且融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機(jī)制的限制，這就為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。但同時(shí)細(xì)胞融合也有很多劣勢：比如細(xì)胞融合率很低，需要強(qiáng)烈的細(xì)胞篩選輔助，而且雜種細(xì)胞內(nèi)存在多重基因組,不能用于基因治療。盡管如此，細(xì)胞融合卻能在細(xì)胞不分裂條件下即發(fā)生主動(dòng)DNA去甲基化等重編程過程,因此細(xì)胞融合仍然是研究主動(dòng)去甲基化等重編程機(jī)制的良好模型。三．譜系轉(zhuǎn)化通過發(fā)育生物學(xué)的研究已知，過表達(dá)一種或幾種轉(zhuǎn)錄因子可以深刻影響細(xì)胞表型及特性。所以我們就可以人為地,在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)添加一些轉(zhuǎn)錄因子或者miRNA，誘導(dǎo)已分化的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N細(xì)胞，這種直接誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化的方法也稱為“譜系轉(zhuǎn)化”，這種方法避免了細(xì)胞獲得性免疫原性的問題。理論上轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)能夠使體細(xì)胞重編程為任意理想細(xì)胞類型,但目前轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)重編程體細(xì)胞僅限于幾種特定細(xì)胞,且通常是譜系相近的細(xì)胞類型?？茖W(xué)家們通過導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子或miRNA的方式已實(shí)現(xiàn)了如心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、胰島0細(xì)胞、造血干細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等的轉(zhuǎn)分化(詳見表1)[4]表1通過轉(zhuǎn)錄因子WmiRNA誘導(dǎo)的體細(xì)脂轉(zhuǎn)分化起始細(xì)胞誘導(dǎo)因子冃的細(xì)膛小鼠成纖維細(xì)胞Gata4.MefZc,.Tbx5：心刪細(xì)胞小鼠成纖維細(xì)胞Oct4.Sox2xKlf4.c-Myc心刪細(xì)胞人成纖維細(xì)胞GATA4.HAND?.MYOCD.TBX5.miEt-l.miR-133心肌細(xì)胞小鼠成纖維細(xì)胞th塩4、Hnfla.Foxa3、P19ARF敲減：肝胱干細(xì)胞和肝細(xì)胞小鼠成纖維細(xì)咆Oct4.Sox2.Klf4肝臟干細(xì)胞和肝細(xì)胞人成纖維細(xì)胞IINF1A.IINF4A.FOXA3.SV40大T抗原HMT-細(xì)胞和肝細(xì)胞小鼠支持細(xì)胞Ascii.Ngn2xHe&l,Ldl.Pax6. c-Myc神經(jīng)干紬胞和神經(jīng)元小鼠成纖維細(xì)胞OCT/SOX2.KLF4.c-Myc神經(jīng)干細(xì)胞和神纟幸元人尿上皮樣細(xì)胞OCT4、￡0X2、KLF4.SV40LT.miR30^-S67神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元小鼠成纖維細(xì)胞ERG,GATA2、LMO2.RUN%IsSCL.p勺+造血干細(xì)胞小鼠B細(xì)胞CEBPa巨嚨細(xì)胞小鼠成纖維細(xì)胞Oct4.Sox2.K114.c-Myc濮島P細(xì)胞小鼠成纖維細(xì)咆MfkuNfib^Sox9星形膠質(zhì)細(xì)胞小鼠成纖維細(xì)咆FoxoltEr71TKl￡2hTull*Lmo2內(nèi)皮細(xì)胞四?誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPSBs)2006年，日本東京大學(xué)的Takahashi和Yamanaka[5]首次過表達(dá)4因子Oct3/4,Sox2,Klf4,c-Myc和運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染技術(shù),成功地將小鼠成纖維細(xì)胞重編程為胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞，并命名為誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs)。由于多潛能干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞高度相似，具多向分化潛能，并且不受細(xì)胞來源、免疫排斥、倫理、宗教和法律等諸多方面的限制，故在干細(xì)胞治療領(lǐng)域中有著巨大的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。轉(zhuǎn)錄因子是誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的關(guān)鍵因素，故也被稱為重編程因子(reprogrammingfactors),其包括OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、NANOG、LIN28(OSKMNL)等。最基本的重編程因子主要有兩類： Yamanaka因子(OSKM)[5]和Thomson因子(OSNL)⑹。它們通過激活全能性基因的表達(dá)，同時(shí)抑制體細(xì)胞中組織特異性基因的表達(dá)，使體細(xì)胞重新獲得干細(xì)胞的特性。1.誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的主要技術(shù)：目前，誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為iPSCs的方法主要包括以下幾種：(1)經(jīng)典DNA法：這種方法由Takahashi在2006年首創(chuàng)，而后經(jīng)由許多科研組不斷地發(fā)展創(chuàng)新。這包括了用逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、轉(zhuǎn)座子、腺病毒、質(zhì)粒等載體將OSKM等重編程因子轉(zhuǎn)染待編程細(xì)胞而成功獲得iPSCs。該法雖然誘導(dǎo)效率較高，但同時(shí)其引起插入突變和致瘤性風(fēng)險(xiǎn)也很高。蛋白質(zhì)法：將重編程因子在原核或真核表達(dá)載體中表達(dá)為重組蛋白后導(dǎo)入體細(xì)胞實(shí)現(xiàn)重編程。這種技術(shù)避免了插入突變，提高了重編程的安全性，但誘導(dǎo)效率相當(dāng)?shù)停夹g(shù)難度高，需要大量純化蛋白，成本昂貴。化學(xué)方法(小分子化合物法)：篩選適當(dāng)?shù)男》肿踊衔锶〈鼐幊桃蜃?，通過影響細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)和關(guān)鍵信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的重編程。2013年,鄧宏魁研究組開辟了一條全新的iPSCs誘導(dǎo)途徑一一僅使用6種小分子化合物實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞誘導(dǎo)重編程，這種誘導(dǎo)出來的iPSCs被命名為“CiPSCs”⑺。小分子化合物誘導(dǎo)法完全避免了外源基因的插入,大大降低了iPSCs誘導(dǎo)造成基因突變的風(fēng)險(xiǎn)?；瘜W(xué)方法另一個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)在于可以微調(diào)小分子的濃度、持續(xù)時(shí)間、結(jié)構(gòu)和組合，更為精細(xì)地分階段操控CiPSCs的生成。RNA法：該法具有誘導(dǎo)速度快、效率較高、無基因組整合和插入風(fēng)險(xiǎn)等特點(diǎn)，故而成為如今誘導(dǎo)iPSCs的熱點(diǎn)。迄今用于iPSCs誘導(dǎo)的RNAs主要有mRNAs和非編碼RNAs(ncRNAs)兩大類。2.iPSCs的來源：自成功建立小鼠iPSCs以來，與iPSCs有關(guān)的研究取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展?？茖W(xué)家們已經(jīng)探索出了許多的方法用以獲得iPSCs，包括基因?qū)爰夹g(shù)重編程，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染技術(shù)重編程，以及加入一些化學(xué)物質(zhì)提高重編程的效率⑻。經(jīng)過許多科學(xué)家的努力，迄今為止，許多iPSCs的細(xì)胞系均已建立，如人、大鼠、豬、猴和兔⑼。而細(xì)胞的來源也多種多樣，用于細(xì)胞治療的研究工作的細(xì)胞可以來源于人肝細(xì)胞，胃上皮細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞，胰細(xì)胞，皮膚成纖維細(xì)胞，還有一些通過無創(chuàng)方法得到的外周血細(xì)胞，尿液中的腎小管內(nèi)皮細(xì)胞等[10][11]。由于細(xì)胞來源的廣泛以及取材的便利，iPSCs的研究發(fā)展迅速，應(yīng)用前景十分可觀。3.疾病特異性iPSCs細(xì)胞系的建立：科學(xué)家們?cè)趯?duì)某些疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方案的研究中，往往需要建立特定的疾病背景，例如利用動(dòng)物模型對(duì)發(fā)病機(jī)制進(jìn)行排查以及藥物篩選。但是由于很多疾病并沒有相應(yīng)的動(dòng)物模型,特別是某些人類遺傳病。因此，科學(xué)家們更為關(guān)注的是對(duì)于人類疾病特異性iPSCs的研究。由于疾病特異性iPSCs帶有與疾病有關(guān)的遺傳信息，可以用于建立疾病模型以研究疾病發(fā)生機(jī)制，進(jìn)而用于藥物篩選和個(gè)性化細(xì)胞及基因治療。到目前為止,成功建立的人的疾病特異性iPSCs細(xì)胞系主要包括糖尿病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、雷特氏綜合征、杜氏肌營養(yǎng)不良癥、帕金森病、精神分裂癥、威爾森氏癥、范氏貧血癥、地中海貧血癥、豹斑綜合征、肝臟疾病、長Q-T間期綜合征、脊髓性肌萎縮、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)、普瑞德-威利綜合征、蒂莫西綜合征、阿爾茨海默病、骨性關(guān)節(jié)炎、先天性角化不良以及白內(nèi)障等[8]。這些人類疾病特異性iPSCs的獲得,為疾病體外模型的建立奠定了基礎(chǔ)。由此可見，利用iPSCs建立的的疾病的模型及相關(guān)疾病的機(jī)理研究已取得了系列進(jìn)展，但iPSCs定向分化成復(fù)雜疾病相關(guān)細(xì)胞和研究多重細(xì)胞表型疾病機(jī)制仍是挑戰(zhàn)，這也是目前全世界科學(xué)家們的研究熱點(diǎn)。重編程過程是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)化的協(xié)作過程,盡管目前仍然有大量的問題等待探索，但其對(duì)于科研和臨床的巨大益處是大家有目共睹的！我們應(yīng)該對(duì)這種技術(shù)的未來充滿信心！參考文獻(xiàn)：[1]李鑫,王加強(qiáng),周琪.體細(xì)胞重編程研究進(jìn)展[J].中國科學(xué):生命科學(xué),2016(1).[2]BriggsR,KingTJ.Transplantationoflivingnucleifromblastulacellsintoenucleatedfrogs'eggs.ProcNatlAcadSciUSA,1952,38:455-463GrigoryevS.A.,BednarJ.,andWoodcockC.L.,1999,MENT,aheterochromatinproteinthatmediateshigherorderchromatinfolding,isanewserpinfamilymember,J.Biol.Chem.,274(9):5626-5636付艷賓,龍媛,謝欣.全化學(xué)誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程和轉(zhuǎn)分化[J].生命科學(xué),2016(8):941-948.TakahashiK,YamanakaS.Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors[J].Cell,2006,126:663-76CoxJL,RizzinoA.2010.Inducedpluripotentstemcells:Whatliesbeyondtheparadigmshift.ExperimentalBiologyandMedicine,235(2):