腫瘤細(xì)胞外囊泡代謝組學(xué)研究進(jìn)展

腫瘤細(xì)胞外囊泡代謝組學(xué)研究進(jìn)展細(xì)胞外囊泡（extracellularvesicles，EV）是一種具有雙層磷脂膜結(jié)構(gòu)的囊泡小體，EV從其大小及分離方式上可以分為小細(xì)胞外囊泡（smallextracellularvesicles，sEV）和大細(xì)胞外囊泡（largeextracellularvesicles，lEV），而從其產(chǎn)生方式上又可以分為外泌體、微囊泡、凋亡小體等［1］。EV能夠特異地將來(lái)源細(xì)胞的蛋白質(zhì)、核酸和代謝物等物質(zhì)包裹在內(nèi)，它們作為EV攜帶的“貨物”，一方面能夠作為標(biāo)志物反映來(lái)源細(xì)胞的狀態(tài)，另一方面也能夠在細(xì)胞間傳遞信息，誘導(dǎo)靶細(xì)胞的生命活動(dòng)發(fā)生改變［2］。此外本團(tuán)隊(duì)的前期研究也證實(shí)EV在腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮著重要作用［3］。細(xì)胞代謝的改變是腫瘤的重要特征，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)這些改變來(lái)滿足自身快速生長(zhǎng)的需求。小分子代謝物是與細(xì)胞表型和狀態(tài)最直接相關(guān)的分子，隨著研究的深入，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到了代謝組學(xué)在腫瘤中的重要價(jià)值［4］。然而目前腫瘤EV的相關(guān)報(bào)道大都集中于RNA和蛋白，EV代謝組學(xué)研究還相對(duì)欠缺。一、腫瘤來(lái)源EV的代謝組學(xué)特征首先，與來(lái)源細(xì)胞相比，EV含有更多的脂質(zhì)（每毫克蛋白所含脂質(zhì)約為細(xì)胞的8.4倍）［5］，且普遍存在膽固醇、鞘糖脂、鞘磷脂等脂質(zhì)的富集［6］，這一點(diǎn)在前列腺癌［5，7］、結(jié)直腸癌［8］和乳腺癌［9］細(xì)胞來(lái)源的EV中都得到了證實(shí)。此外EV還會(huì)特異性富集一些脂質(zhì)，例如有研究發(fā)現(xiàn)，溶血磷脂酰膽堿會(huì)在前列腺癌LnCap細(xì)胞來(lái)源的EV中富集，但其在LnCap細(xì)胞中的豐度卻很低。此外不同EV亞類攜帶的代謝物組成也是不同的，有研究者認(rèn)為糖脂和游離脂肪酸的富集是sEV的特征，而神經(jīng)酰胺和鞘磷脂的富集則是lEV的特征［10］，另外Yang等［11］的研究也發(fā)現(xiàn)尿液來(lái)源的sEV與lEV的脂質(zhì)組成存在差異性，如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸等在sEV中比lEV中更豐富，造成上述差異的原因可能是不同EV亞類的發(fā)生方式不同。與正常細(xì)胞來(lái)源的EV相比，腫瘤細(xì)胞來(lái)源EV攜帶的代謝物也存在著差異，其中研究最多的是脂質(zhì)。溶血磷脂能夠通過(guò)多種不同的機(jī)制參與腫瘤進(jìn)展［12,

13］。目前有研究證明卵巢癌SKOV-3細(xì)胞來(lái)源的EV存在溶血磷脂酰膽堿的富集［14］，且高濃度的EV溶血磷脂酰膽堿還與乳腺癌較短的總生存期相關(guān)［15］。但也有研究發(fā)現(xiàn)一些溶血磷脂如溶血磷脂酰乙醇胺在腎細(xì)胞癌患者尿液來(lái)源的EV中豐度更低［16］。另有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺和鞘磷脂也會(huì)在某些來(lái)自腫瘤細(xì)胞的EV中富集［10］，且這一現(xiàn)象在黑色素瘤和肺癌細(xì)胞來(lái)源的EV中也得到了證實(shí)［17,

18］。此外，膽固醇酯、酵母固醇和27-羥基膽固醇等脂質(zhì)的富集也曾在腫瘤來(lái)源的EV中被報(bào)道［14，19］。相對(duì)而言，腫瘤來(lái)源EV攜帶的其他小分子代謝物的研究還相對(duì)較少。有研究發(fā)現(xiàn)與非腫瘤細(xì)胞相比，來(lái)自腫瘤細(xì)胞系的EV含有更多的氨基酸及其衍生物，其中脯氨酸和琥珀酸上調(diào)最為顯著，另外該研究還發(fā)現(xiàn)在前列腺癌細(xì)胞和T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞來(lái)源的EV中能夠檢測(cè)到更多的葉酸和肌酐［20］。此外還有研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自頭頸鱗癌細(xì)胞系UMSCC47培養(yǎng)上清液的EV富含腺苷等嘌呤代謝產(chǎn)物［21］，這一現(xiàn)象在胰腺癌中也有報(bào)道［22］。這些腫瘤EV攜帶代謝物的特異性改變（圖1）為其作為腫瘤診斷標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。圖1

EV攜帶的代謝物影響腫瘤及基質(zhì)細(xì)胞功能不同腫瘤細(xì)胞來(lái)源EV的代謝物組成也發(fā)生著變化。例如，肝癌細(xì)胞系Huh7和間充質(zhì)干細(xì)胞MSC來(lái)源的EV存在心磷脂的特異性富集，而腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87來(lái)源的EV則被發(fā)現(xiàn)存在鞘磷脂的富集［10］。另外一項(xiàng)乳腺癌相關(guān)的研究也表明，與低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞相比，高轉(zhuǎn)移性乳腺癌EV中不飽和二?；视痛嬖诟患|(zhì)被選擇性地裝載到乳腺癌EV中［9］。此外，不同耐藥表型［23］、不同腫瘤亞型［24,

25］以及不同分化程度［26］腫瘤細(xì)胞來(lái)源EV所攜帶的代謝物也存在差異，這提示EV攜帶的代謝物還可能在腫瘤鑒別診斷中發(fā)揮作用，且特異性的EV攜帶的代謝物也許能夠用于判斷EV的來(lái)源。以上研究主要探索了細(xì)胞培養(yǎng)液中腫瘤來(lái)源EV的代謝組學(xué)特征，值得注意的是，雖然細(xì)胞培養(yǎng)液來(lái)源EV相對(duì)臨床樣本來(lái)源EV應(yīng)有更好的一致性，但是有研究發(fā)現(xiàn)同種細(xì)胞不同氧濃度［22］、不同pH［17］、不同培養(yǎng)系統(tǒng)［6］等條件也會(huì)引起EV代謝組學(xué)的變化，可見EV代謝組學(xué)是一個(gè)非常靈敏的指標(biāo)，所以在比較不同細(xì)胞系EV攜帶的代謝物的過(guò)程中，也需要考慮不同培養(yǎng)條件對(duì)其產(chǎn)生的影響。綜上，腫瘤來(lái)源EV的代謝組學(xué)表現(xiàn)出獨(dú)有的特征，且能非常靈敏地反映細(xì)胞狀態(tài)，有可能在腫瘤診療中發(fā)揮一定作用。二、EV攜帶的代謝物作為腫瘤診斷標(biāo)志物的價(jià)值（一）采用EV樣本進(jìn)行代謝組學(xué)標(biāo)志物研究的優(yōu)缺點(diǎn)與細(xì)胞培養(yǎng)液相比，血液及尿液等臨床樣本具有更大的異質(zhì)性，但要想評(píng)價(jià)代謝物作為診斷標(biāo)志物的價(jià)值，使用臨床樣本開展研究是非常必要的。體液樣本和體液來(lái)源EV樣本所富集的代謝物存在差異性［27］，目前代謝組學(xué)診斷標(biāo)志物研究大多是直接采用體液樣本進(jìn)行分析，分離EV后再進(jìn)行代謝組學(xué)研究的還相對(duì)較少。這2種研究方案各自有其優(yōu)缺點(diǎn)。從臨床應(yīng)用的難易程度上講，直接采用體液樣本更加快速便捷，而提取EV進(jìn)行分析，增加了前處理過(guò)程，提高了成本，因此臨床應(yīng)用難度較大。從診斷效能的優(yōu)劣上來(lái)看，由于體液代謝物含量受飲食及化合物穩(wěn)定性等多種因素的影響［28］，所以有囊泡膜保護(hù)的EV攜帶的代謝物可能是標(biāo)志物研究的更好選擇。EV是活細(xì)胞“主動(dòng)分泌”的，其代謝物成分具有選擇性，可能包含更豐富和特異的信息。此外，EV表面的許多特異性蛋白還能夠用于分離腫瘤特異性的EV［29］。因此EV樣本可能會(huì)提供更為同質(zhì)化的代謝物來(lái)源，有利于富集腫瘤細(xì)胞的異常代謝改變，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)更加敏感和特異的代謝標(biāo)志物。目前已有一些研究團(tuán)隊(duì)對(duì)體液代謝組學(xué)和體液來(lái)源EV代謝組學(xué)的診斷效能進(jìn)行了比較［18，27，30］，例如Puhka等［30］發(fā)現(xiàn)，與尿液相比尿液EV樣本中存在特異性富集的代謝物，且尿液EV攜帶的代謝物的腫瘤相關(guān)改變更加明顯。但由于相關(guān)報(bào)道有限，且大多納入的樣本數(shù)量較少，因此直接使用體液樣本和使用體液來(lái)源的EV樣本究竟孰優(yōu)孰劣還有待進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。（二）EV攜帶的代謝物在各系統(tǒng)腫瘤中的研究1.泌尿系統(tǒng)腫瘤：泌尿系統(tǒng)腫瘤的相關(guān)研究大多采用尿液樣本，其中研究最多的是前列腺癌（prostatecancer，PCa）。脂質(zhì)代謝物研究方面，一項(xiàng)研究分析了15例PCa患者和13名健康對(duì)照者尿液EV攜帶的代謝物，發(fā)現(xiàn)9種脂類的水平存在差異，其中磷脂酰絲氨酸18∶1/18∶1和乳糖神經(jīng)酰胺d18∶1/16∶0的顯著性最高，將這2種脂質(zhì)與磷脂酰絲氨酸18∶0/18∶2進(jìn)行組合，可達(dá)到93%的敏感度和100%的特異度［31］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)PCa患者尿液EV中磷脂酰甘油22∶6/22∶6明顯較高，而甘油二酯16∶0/16∶0和16∶1/18∶1以及許多甘油三酯卻明顯較低［11］。而在其他小分子代謝物方面，有研究發(fā)現(xiàn)尿液來(lái)源EV攜帶的多種脂質(zhì)和氨基酸在PCa和前列腺增生之間表現(xiàn)出明顯豐度差異，且PCa患者尿液EV中硫酸脫氫表雄酮水平明顯較高，這與PCa患者雄激素合成的潛在升高相一致［32］。此外還有一項(xiàng)研究同時(shí)對(duì)尿液EV和血小板EV的代謝組學(xué)特征進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，前列腺切除術(shù)前患者尿液EV樣本中的葡萄糖醛酸、5-磷酸核糖和異丁基-1-肉堿水平明顯較低。此外該研究還發(fā)現(xiàn)了在尿液EV樣本中特異性富集的代謝物γ谷?；腚装彼幔谘“錏V和尿液樣本中均未富集，這一發(fā)現(xiàn)可能有助于推測(cè)EV的來(lái)源［30］。除前列腺癌外，也有研究者對(duì)腎癌中EV代謝組學(xué)的診斷價(jià)值作了探究，研究發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞癌患者尿EV攜帶的溶血磷脂酰乙醇胺豐度明顯低于正常對(duì)照［16］。2.呼吸系統(tǒng)腫瘤：EV攜帶的代謝物在呼吸系統(tǒng)腫瘤中的相關(guān)研究主要圍繞肺癌展開，2項(xiàng)研究分別使用了血漿和胸腔積液樣本。第一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，血漿EV所攜帶的包含7種脂質(zhì)在內(nèi)的特定組合能夠?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌和健康對(duì)照進(jìn)行區(qū)分，ROC曲線下面積（areaunderthecurve，AUC）可達(dá)0.80以上［33］；隨后另一項(xiàng)研究對(duì)胸腔積液中的EV進(jìn)行了代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)lEV比sEV更能區(qū)分惡性胸腔積液，于是研究團(tuán)隊(duì)繼續(xù)探究了胸腔積液lEV中一組代謝物（苯丙氨酸、亮氨酸、磷脂酰膽堿35∶0和鞘磷脂44∶3）對(duì)肺癌的診斷價(jià)值，其AUC可達(dá)0.95［34］。3.消化系統(tǒng)腫瘤：消化系統(tǒng)腫瘤研究主要采用的是血液樣本。Zhu等［35］的研究證明了一組由3′-尿苷酸、棕櫚油酸、棕櫚醛和癸酸異丁酯組成的EV攜帶的代謝物可預(yù)測(cè)食管癌復(fù)發(fā)，其AUC可達(dá)0.98。另一項(xiàng)在胰腺癌中開展的研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者與健康對(duì)照者血清EV中有多種脂質(zhì)存在明顯差異，進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)溶血磷脂酰膽堿22∶0、磷脂酰膽堿14∶0/22∶2和磷脂酰乙醇胺16∶0/18∶1與腫瘤分期、CA19-9、CA242和腫瘤直徑有關(guān)，且磷脂酰乙醇胺16∶0/18∶1還與患者的總生存期呈負(fù)相關(guān)［36］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)高豐度的EV鞘氨酸、心磷脂、溶血磷脂酰絲氨酸和1-羥基脂肪酸以及較少的硫酸鹽和酰基葡萄糖谷甾醇酯與肝癌密切相關(guān)［37］。4.婦科腫瘤：一項(xiàng)乳腺癌相關(guān)研究收集了78例乳腺癌患者和30名健康對(duì)照者的lEV，利用靶向和非靶向質(zhì)譜對(duì)其代謝組進(jìn)行了表征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8種代謝物存的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其聯(lián)合診斷的AUC可達(dá)0.78。此外該研究還發(fā)現(xiàn)高濃度的溶血磷脂酰膽堿aC26∶0和磷脂酰膽堿aaC38∶5與乳腺癌較短的總生存期相關(guān)［15］。另外一項(xiàng)研究則是對(duì)完整的活細(xì)胞和組織中的EV直接進(jìn)行了可視化和表征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織內(nèi)、組織邊界和血管周圍有大量的富集還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）的EV，且其百分比與人類乳腺癌的診斷相關(guān)［38］。此外還有研究探索了血漿EV代謝組學(xué)在子宮內(nèi)膜癌中的診斷價(jià)值，結(jié)果也提示患者與健康對(duì)照者的EV攜帶的代謝物水平存在差異［39］。5.其他腫瘤：有研究發(fā)現(xiàn)與健康人群來(lái)源的EV相比，從頭頸鱗狀細(xì)胞癌患者血漿分離的EV中富含嘌呤代謝產(chǎn)物，并攜帶較高水平的腺苷。該研究還發(fā)現(xiàn)早期疾病和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的EV中腺苷和5′鳥苷酸水平較高，而在晚期和淋巴結(jié)受累的患者中嘌呤代謝產(chǎn)物水平較低［21］，這一發(fā)現(xiàn)提示轉(zhuǎn)移活性較強(qiáng)的患者腫瘤細(xì)胞代謝活動(dòng)可能發(fā)生了改變，具有重要意義。此外，黑色素瘤患者的血清源EV代謝組學(xué)與健康對(duì)照組相比具有顯著差異，其中磷脂酰膽堿16∶0/0∶0在黑色素瘤患者血清和黑色素瘤干細(xì)胞來(lái)源的EV中含量較低［26］。綜上，EV代謝組學(xué)能夠靈敏和特異的反映腫瘤狀態(tài)，在腫瘤診斷方面具有重要意義。三、EV攜帶的代謝物調(diào)控腫瘤進(jìn)展的功能1.促進(jìn)囊泡攝?。篍V可以通過(guò)多種不同的途徑與靶細(xì)胞相互作用，代謝物尤其是脂質(zhì)在這個(gè)過(guò)程中也發(fā)揮著非常重要的作用。一方面EV可以借助膜上的生物活性脂質(zhì)與靶細(xì)胞表面的受體相互作用直接影響其生命活動(dòng)［40,

41］。另一方面EV還能通過(guò)被受體細(xì)胞攝取進(jìn)而發(fā)揮作用［42］，目前有研究發(fā)現(xiàn)某些腫瘤來(lái)源的EV表面存在著如PS［43,

44］、溶血磷脂酰膽堿［45,

46］等標(biāo)記，并且富含脂筏相關(guān)的脂質(zhì)，能夠促進(jìn)EV被靶細(xì)胞攝取。2.提供代謝原料：有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，EV攜帶的代謝物能夠作為原料被靶細(xì)胞攝取，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生命活動(dòng)。例如一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)纖維母細(xì)胞來(lái)源EV能夠以類似于巨胞飲的方式被營(yíng)養(yǎng)匱乏的腫瘤細(xì)胞攝取，向其提供氨基酸等代謝物，抑制細(xì)胞氧化磷酸化并增強(qiáng)糖酵解和谷氨酰胺代謝，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的增殖［47］。與之類似，人間充質(zhì)干細(xì)胞EV中也發(fā)現(xiàn)了谷氨酸和乳酸的富集［48］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞來(lái)源的EV能夠通過(guò)轉(zhuǎn)移脂肪酸促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的脂肪酸氧化，且這種變化可能還會(huì)誘導(dǎo)線粒體重新分配到細(xì)胞末端，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移［49］。3.參與細(xì)胞通訊：除了提供腫瘤細(xì)胞所需的代謝原料，EV所攜帶的代謝物也可能作為活性物質(zhì)發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞來(lái)源的EV能夠通過(guò)遞送脂質(zhì)抑制Notch-1通路進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［50］。Yin等［51］的研究則發(fā)現(xiàn)腫瘤源性EV攜帶的脂肪酸能夠通過(guò)激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體，誘導(dǎo)代謝向氧化磷酸化方向轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致樹突細(xì)胞免疫功能障礙。Xiang等［52］的研究也發(fā)現(xiàn)小鼠乳腺癌細(xì)胞來(lái)源EV攜帶的生物活性脂質(zhì)如白三烯和前列腺素，可促進(jìn)癌癥骨髓細(xì)胞向髓系抑制細(xì)胞方向分化，進(jìn)而誘導(dǎo)免疫抑制。另有研究者發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移性乳腺癌的EV與低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞相比，存在不飽和二酰基甘油的富集，富含這種脂質(zhì)的EV能夠激活內(nèi)皮細(xì)胞蛋白激酶D信號(hào)通路，刺激血管生成［9］。此外，Sagar等［53］還發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞來(lái)源的EV能夠通過(guò)傳遞腎上腺髓質(zhì)素促進(jìn)脂肪分解，從而引起副腫瘤效應(yīng)。綜上，EV攜帶的代謝物可以通過(guò)促進(jìn)囊泡的攝取及作為底物或活性物質(zhì)的方式調(diào)控腫瘤細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞的功能，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。四、討論與展望組學(xué)研究是當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，其中基因組能夠預(yù)測(cè)未來(lái)會(huì)發(fā)生什么，轉(zhuǎn)錄組和蛋白組能夠告訴我們可能發(fā)生什么，而代謝組能夠讓我們知道正在或已經(jīng)發(fā)生了什么。上游組學(xué)能夠引起代謝組學(xué)的改變，反過(guò)來(lái)小分子代謝物也會(huì)對(duì)上游產(chǎn)生一定影響。相比之下，代謝組學(xué)能夠更加直接和敏感地反映機(jī)體和細(xì)胞的狀態(tài)，它作為EV組學(xué)研究中的重要組成部分，目前卻研究甚少。但隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)小分子代謝產(chǎn)物也可以通過(guò)EV轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境的基質(zhì)細(xì)胞中，影響受體細(xì)胞的生命活動(dòng)［47，49，51,

52,

53］（圖1），此外特異性富集的EV代謝貨物還可能用于判斷EV的來(lái)源［30］并作為腫瘤診斷標(biāo)志物［15，31，33,

34,

35］。然而，這一新興領(lǐng)域面臨著諸多挑戰(zhàn)，未來(lái)還有大量工作有待開展。1.在標(biāo)志物研究方面：（1）代謝組學(xué)標(biāo)志物研究既可以直接使用體液樣本，也可以使用體液來(lái)源的EV樣本，但是哪種方法的診斷效能更高，還缺乏相關(guān)研究的驗(yàn)證；（2）由于許多分析前因素都會(huì)對(duì)EV代謝組學(xué)研究產(chǎn)生影響，所以EV代謝組學(xué)相比其他組學(xué)研究應(yīng)對(duì)EV純度有更高的要求，尤其是容易含有脂蛋白污染的血液樣本［54,

55］。目前