ELISA試劑的選用和質檢

ELISA試劑的選用和質檢

衛(wèi)生部臨床檢驗中心王露楠影響試劑盒質量的因素試劑盒的選用試劑盒的質檢方法目前試劑盒存在的問題影響試劑盒質量的因素1．原材料(1)固相材料商品ELISA試劑盒中基本上都使用聚苯烯塑料微孔板，其對ELISA試劑盒的影響在于孔間的顯色差異。(2)抗原--自然抗原、合成抗原和基因重組抗原。純度：純度不高可致試劑盒的特異性不強。立體結構：合成抗原一般都是多肽抗原，缺乏完整抗原所具有的立體結構決定簇，用于相應的抗HCV和抗HIV抗體的檢測有可能導致結合上述決定簇的抗體漏檢。影響試劑盒質量的因素(3)抗體多克隆抗體(多抗)：制備簡單，含針對抗原的多種決定簇，但抗體的親和力和特異性相對要低于單抗，且每次制備的抗體在其親和力和特異性上均有區(qū)別。單克隆抗體(單抗)：可無限大量的得到針對單一決定簇的抗體，缺點是結合的單一性。當建立雙抗夾心ELISA測定方法時，如包被和指示抗體使用同一單抗，則由于結合位點的缺乏，很容易造成假陰性結果，尤其是在使用一步法時“鉤狀”效應(Hookeffect)的出現。因此，在使用單抗建立雙抗夾心ELISA方法時，包被和指示抗體常使用針對抗原的不同決定簇的單抗，包被抗體可為混合單抗，從而使得固相抗體在免疫測定中能更為完全地結合待測物中的特異抗原。影響試劑盒質量的因素(4)酶結合物ELISA試劑盒的核心部分，通常ELISA試劑盒的有效使用期限即是根據酶結合物的穩(wěn)定性而定的。辣根過氧化物酶(HRP)：易于提取，價格相對低廉；性質穩(wěn)定，耐熱及有機溶劑的作用，與抗原或抗體偶聯(lián)后，活性很少受損失。堿性磷酸酶(ALP)：堿性磷酸酶用于ELISA必須注意的是含磷酸鹽的緩沖液對其酶活性的抑制作用F半乳糖甘酶影響試劑盒質量的因素(5)色原底物：HRP最常用的色原底物有鄰苯二胺(OPD)和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。鄰苯二胺(OPD)：OPD被認為是HRP最為敏感的色原底物之一，當pH值降為1.0時，最大吸收波長為492nm，顯色加深，因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應。OPD的缺點是其對機體具有致突變作用。四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：氧化產物聯(lián)苯醌在波長450nm處有最大消光系數。試劑盒中常為已配好的A、B兩種液態(tài)試劑，即一定濃度雙氧水溶液和TMB。它們在溶液中相對不穩(wěn)定，因此在使用ELISA試劑盒時，如底物A·或／和B出現顏色，或各取一滴混合后顯色，說明該試劑盒的底物溶液已變質或已受污染，必須廢棄?！び绊懺噭┖匈|量的因素2．試劑盒的方法學設計雙抗原夾心法測抗體(抗HIV、Tp)

洗板待測抗體底物溫育顯色酶標抗原EE洗板YYYYYY固相抗原EYYYEEEYYYEEE影響試劑盒質量的因素間接法測抗體（抗HCV、Tp)

洗板待測抗體底物溫育顯色EY酶標抗體EYEY洗板YYYYYYYYYEYEYEYYYYEYEYEY固相抗原影響試劑盒質量的因素雙抗體夾心法測抗原-兩步法固相抗體溫育待測抗原底物溫育顯色YYYEY酶標抗體EYEYYYYYYYEYEYEYYYYEYEYEY影響試劑盒質量的因素雙抗體夾心法測抗原-一步法待測抗原底物溫育顯色固相抗體YYYEY酶標抗體EYEYYYYEYEYEY洗板YYYEYEYEYEYYYYEYEYEY影響試劑劑盒質量量的因素素3．試劑劑盒的運運輸和貯貯存ELISA試劑劑盒的效效期一般般為6個個月，這這是指在在貯存溫溫度為2～8oC的情況況下，但但一個試試劑盒從從出廠至至用戶手手中，均均要經歷歷運輸(如送檢檢、檢定定、發(fā)貨貨等)及及運輸中中的貯存存，某一一環(huán)節(jié)的的不當，，均會影影響試劑劑盒的臨臨床使用用質量。。試劑盒的的選用1．根據據可能影影響試劑劑盒質量量的因素素，從以以下幾個個方面來來判斷該該試劑盒盒是否符符合我們們的要求求效期固相材料料的來源源包被抗體體或抗原原的性質質(單抗抗、多抗抗或合成成多肽或或重組多多肽)顯色底物物(是TMB還還是OPD)測定模式式(一步步法或二二步法)試劑盒的的選用2．同行行對有關關試劑盒盒的使用用效果個別的使使用效果果在實際工工作中，，其它實實驗室對對某種試試劑盒的的實際使使用效果果，往往往具有很很強的說說服力。。綜合的使使用評價價對一種試試劑盒的的綜合使使用評價價，是指指多個實實驗室對對這種試試盒實際際應用效效果的綜綜合分析析。ELISA試劑劑盒的質質檢1.包裝裝、儲存存狀態(tài)內外包裝裝、效期期、試劑劑瓶是否否漏液，，真空包包裝是否否破損，，試劑是是否齊全全等等2.采用用血清盤盤(panel)質檢檢血清盤由由一定數數量的陰陰、陽性性樣本組組成，可可用來判判斷試劑劑盒的靈靈敏度、、特異性性和符合合率，如如HBsAg、、抗HCV和抗抗HIV等血清清盤。ELISA試劑劑盒的質質檢ELISA試劑劑盒的質質檢-HBsAgELISA試劑劑盒的質質檢-抗HCVELISA試劑劑盒的質質檢-TPELISA試劑劑盒的的質檢檢3.采采用弱弱陽性性定值值質控控血清清進行行質檢檢對不同同廠家家或同同一廠廠家不不同批批號試試劑盒盒采用用同一一弱陽陽性定定值質質控血血清檢檢測，，可比比較出出不同同廠家家或不不同批批號試試劑盒盒的檢檢測靈靈敏度度(測測定下下限)的差差異，，對判判斷試試劑盒盒的質質量及及其穩(wěn)穩(wěn)定性性具有有重要要的參參考價價值。。檢驗結結果的的正確確與否否，是是試劑劑盒質質量、、人員員素質質、儀儀器設設備狀狀態(tài)和和室內內質控控措施施等的的綜合合反應應，任任何一一個環(huán)環(huán)節(jié)出出現問問題，，都會會導致致檢測測的失失敗。。目前試試劑盒盒存在在的問問題--抗HCV目前試試劑盒盒存在在的問問題--抗HCV試劑的的不足足之處處1.主要是是在低危人人群中仍發(fā)發(fā)現大量的的不確定和和假陽性結結果，再則則仍有較長長的“窗口口期”。2.核心區(qū)抗原原的減少程程度把握不不好的話，，有可能會會導致漏檢檢的發(fā)生。。3.由于這些試試劑所使用用HCV抗抗原只是病病毒的部份份重組多蛋蛋白或合成成肽抗原，，加之，固固相對這些些蛋白或多多肽的吸附附能力的局局限性，使使得固相上上能捕獲抗抗體的抗原原決定基的的數量有限限，從而影影響測定的的敏感性。。目前試劑盒盒存在的問問題

--抗HCV兩家試劑檢檢測結果不不一致1.不同試試劑廠家的的ELISA試劑盒所用用包被抗原原的差異：：目前抗HCV檢測ELISA試劑盒均均采用HCV的基因因工程或合合成多肽抗抗原（核心心區(qū)、NS3、NS4和NS5等）包包被固相，，以間接法法進行測定定，由于上上述HCV抗原的組組合、來源源及用量等等方面的差差異。2.所用包包被抗原成成份相互之之間抗原決決定簇的覆覆蓋，這種種覆蓋將嚴嚴重影響ELISA測定的敏敏感性。目前試劑盒盒存在的問問題

--抗HCV對策----通常的的做法是：：初檢陰性性的血袋再再用與不同同廠家的國國產試劑復復檢，如仍仍為陰性，，血即為合合格?；虺醭鯔z使用國國產ELISA試劑劑，復檢采采用進口試試劑。對策----應采取取的辦法：：在血站篩篩檢獻血員員血時，初初檢陰性尤尤其是S/CO值較較高的血液液，最好使使用不同ELISA試劑盒復復檢，這樣樣才能最大大程度的減減少經輸血血HCV感感染的發(fā)生生。目前試劑盒盒存在的問問題

--抗HCV抗HCVELISA出現假假陽性的主主要原因有有：1.類風濕濕因子（RF）的干干擾2.高免疫疫球蛋白血血癥3.標本中中超氧化物物歧化酶（（SOD））的干擾4.用于固固相包被的的HCV基基因工程抗抗原不純目前試劑盒盒存在的問問題

--抗HIV采用雙抗原原夾心一步步法檢測抗抗HIV----“鉤狀效效應”所致致的假陰性性問題。1.原因：：HIV感感染者中有有些抗體滴滴度很高，，采用可出出現雙抗原原夾心一步步法檢測，，可出現類類似雙抗體體夾心一步步法檢測抗抗原的“鉤鉤狀效應””現象。2.措施：：在血站篩篩檢獻血員員時，應使使用二步法法試劑盒進進行檢測，，或是對標標本進行雙雙份同時檢檢測，一份份原標本，，一份1:10或1:100稀釋標本本，從而避避免漏檢。。目前試劑盒盒存在的問問題

--抗HIVELISA測定結果果的解釋1.一般來來說，一個個感染HIV的患者者，使用商商品ELISA試劑劑盒測定，，結果應為為陽性，因因為在這些些試劑盒中中所用的包包被抗原主主要為gag編碼蛋蛋白和病毒毒包膜蛋白白，針對這這些蛋白的的抗體在HIV感染染的機體免免疫應答中中出現最早早，而ELISA的的測定敏感感性足以將將其早期測測出，因此此如果懷疑疑有可能的的HIV感感染，但ELISA測定結果果為陰性，，則HIV感染的可可能性很小小。2.實驗操操作或試劑劑有問題或或不能確定定可能出現現感染的確確切日期，，如果HIV抗體ELISA測定為陰陰性，就不不必立即重重復檢測。。3.對于處處于陽性判判斷值（Cut-off）邊邊緣即稍低低于Cut-off的樣本，，難于判斷斷是否為感感染早期，，或實際為為非感染者者的樣本，，此時,可可以再次取取血測定和和/或用另另一種ELISA試試劑盒檢測測，從而明明確測定結結果。這種種情況下，，如果測定定結果仍處處于Cut-off邊緣，則則建議數月月后再次測測定,如仍仍無改變,則說明無無HIV感感染.其它它如免疫印印跡,PCR測定HIVRNA也為為此種情況況下的HIV感染驗驗證實驗.目前試劑盒盒存在的問問題

--梅毒螺旋體體抗體檢測方法1.檢測非非特異性抗抗體----使用類脂質質抗原的血血清學試驗驗：RPR、TRUST2.檢測特特異性抗體體----使用密螺旋旋體抗原的的血清學試試驗：FTA-ABS、TPHA、TPPA、、ELISA、、WB目前試劑盒盒存在的問問題

--HBsAg檢測靈敏度度據文獻報道道，到目前前為止在獻獻血員中所所發(fā)現的HBsAg攜帶者者最低含量量為0.2n