高效液相色譜的基礎知識

關于高效液相色譜的基礎知識第1頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜法的特點

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術，隨著不斷改進與發(fā)展，目前已成為應用極為廣泛的化學分離分析的重要手段。它是在經典液相色譜基礎上，引入了氣相色譜的理論，在技術上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進行比較：第2頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜法的特點

1．高效液相色譜法與經典液相色譜法高效液相色譜法比起經典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經典液相色譜法快數百倍。由于經典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設備，流速最高可達103cm·min-1.例如對氨基酸分離，用經典色譜法，需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內即可完成。第3頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜法的特點2．高效液相色譜法與氣相色譜法（l）氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數的20％。對于占有機物總數近80％的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質量大的物質，目前主要采用高效液相色譜法進行分離和分析。

(2)氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用，相當于增加了一個控制和改進分離條件的參數，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。

(3)氣相色譜一般都在較高溫度下進行的，而高效液相色譜法則經常可在室溫條件下工作。第4頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜法的特點分析速度快——通常分析一個樣品在15~30min，有些樣品甚至在5min內即可完成。選擇性高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，可分析同類型的有機化合物及其同分異構體，還可以分析在性質上極為相似的旋光異構體。靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。柱子可反復使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收——樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。第5頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜法的特點

超高效液相色譜(UPLC)—是區(qū)別于HPLC的液相色譜新領域—基于小顆粒填料和LC原理的一種創(chuàng)新技術—實現(xiàn)超高分離度、靈敏度、分析速度第6頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六1高效液相色譜法的特點2高效液相色譜法儀器工作原理3高效液相色譜儀的維護4高效液相色譜法儀的注意事項5高效液相色譜的分析應用第7頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理

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高壓輸液系統(tǒng)?

進樣系統(tǒng)?

分離系統(tǒng)?

檢測系統(tǒng)第8頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理

其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。第9頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理1．高壓輸液系統(tǒng)由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。對于一個好的高壓輸液泵應符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視性差，它們各有優(yōu)缺點。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機械泵，它又分機械注射泵和機械往復泵兩種，應用最多的是機械往復泵。第10頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理2．進樣裝置

第11頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理3分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內徑為4～5mm，凝膠色譜柱內徑3～12mm，制備往內徑較大，可達25mm以上。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內，經沖洗后，即可備用。第12頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理4．檢測系統(tǒng)目前有兩種基本類型的檢測器:

一類是溶質性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學特性有響應，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學性質有響應，屬于這類檢測器的有示差折光，蒸發(fā)光散射，電導檢測器等。第13頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器

工作原理：基于Lambert-Beer定律，即被測組分對紫外光或可見光具有吸收，且吸收強度與組分濃度成正比。通用型檢測器約有80％的分析樣品具有紫外吸收,可以使用這種檢測器檢測。第14頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器

優(yōu)點:a:靈敏度高b:線性范圍廣C:對溫度和流速不敏感，適于進行梯度洗脫限制:a:沒有紫外吸收的物質不能檢測b:應盡可能選擇在檢測波長下沒有背景吸收的流動相(限制了一些截止波長在200~300nm之間的良好溶劑的使用)

第15頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器

原理:

物質的分子或原子經光照射后，有些電子被激發(fā)至較高的能級，這些電子從高能級躍至低能級時，物質會發(fā)出比入射光波長較長的光，這種光稱為熒光。熒光檢測器就是在樣品的激發(fā)波長處檢測發(fā)射光的強弱.熒光檢測器是一種選擇性檢測器不到20%的物質使用這種檢測手段,許多藥物采用這種檢測方法.

第16頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器優(yōu)點:a:靈敏度非常高(靈敏度在目前常用的HPLC檢測器中最高)，比紫外檢測器高2—3個數量級，適合于痕量分析

b:可以用于梯度洗脫

c:對儀器的穩(wěn)定性（如溫度和壓力的穩(wěn)定性）依賴較小

d:選擇性好，優(yōu)于紫外缺點:a:適用范圍有一定的局限性–只適用于有熒光基團＆衍生化之后有熒光基團的化合物

b:定量分析時線性范圍較窄它適合于稠環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素、蛋白質等熒光物質的測定第17頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器（3）二極管陣列檢測器原理:

光電二極管陣列（或CCD陣列，硅靶攝像管等）作為檢測元件的UV-VIS檢測器。它可構成多通道并行工作，同時檢測由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長的信號，然后，對二極管陣列快速掃描采集數據，得到的是時間、光強度和波長的三維譜圖。

第18頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器（3）二極管陣列檢測器

第19頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器（3）二極管陣列檢測器與普通UV-VIS檢測器不同之處:a:普通UV-VIS檢測器是先用單色器分光，只讓特定波長的光進入流動池。而二極管陣列UV-VIS檢測器是先讓所有波長的光都通過流動池，然后通過一系列分光技術，使所有波長的光在接受器上被檢測.b:普通UV-VIS檢測器只能得到二維的譜圖,而DAD可以得到三維圖譜.

第20頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器（3）二極管陣列檢測器應用a:色譜峰純度檢查b:色譜峰鑒定三維色譜能提供更多全面的信息。

第21頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器（3）二極管陣列檢測器（4）示差折光率檢測器是一種通用型檢測器，只要被測組分與洗脫液的折光指數有差別就可使用。生命科學中常遇到各類糖類化合物，沒有紫外吸收，一般常用示差折光檢測器。它的通用性比UVD廣，但靈敏度要低，對溫度變化敏感，并與梯度洗脫不相容，因而限制了它的使用。

第22頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測器（2）熒光檢測器（3）二極管陣列檢測器（4）示差折光率檢測器（5）電導檢測器

電化學檢測器（ECD）ECD是根據物質的電還原性和電氧化性來進行檢測的，應用于對紫外光沒有吸收或不能發(fā)出熒光，但具有電活性的物質測定。若結合衍生技術，也可應用于非電活性物質的檢測。安培檢測器和電導檢測器在生化、醫(yī)學、食品和環(huán)境分析中獲得廣泛的應用。

第23頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六1高效液相色譜法的特點2高效液相色譜法儀器工作原理3高效液相色譜儀的維護4高效液相色譜法儀的注意事項5高效液相色譜的分析應用第24頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀的維護

泵的使用和維護防止任何固體微粒進入泵體，因為塵?；蚱渌魏坞s質微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2μm或0.45μm）等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應經常清洗或更換。流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在泵內，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產生漏液。輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產生漏液。流動相應該先脫氣，以免在泵內產生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作第25頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀的注意事項柱的使用和維護1、使用前仔細閱讀色譜柱附帶的說明書，注意適用范圍，如pH值范圍、不得注射強酸強堿的樣品，特別是堿性樣品。2、使用符合要求的流動相；3、使用保護柱；4、如所用流動相為含鹽流動相，反相色譜柱使用后，先用水或低濃度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇沖洗。5、長時間不用儀器，應該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應該用有機相(如甲醇等)，因為純水易長霉。6、不要高壓沖洗柱子；7、不要在高溫下長時間使用硅膠鍵合相色譜柱；使用過程中注意輕拿輕放。第26頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀的維護

流動相的脫氣

HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動）。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。第27頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀的維護

紫外燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時，打開檢測器；在分析完成后，馬上關閉檢測器。第28頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六1高效液相色譜法的特點2高效液相色譜法儀器工作原理3高效液相色譜儀的維護4高效液相色譜法儀的注意事項5高效液相色譜的分析應用第29頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀的注意事項一、流動相1、流動相應選用色譜純試劑、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液需經過濾后使用，過濾時注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍；2、水相流動相需經常更換（一般不超過2天），防止長菌變質.第30頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀的注意事項二、樣品1、采用過濾或離心方法處理樣品，確保樣品中不含固體顆粒；2、用流動相或比流動相弱（若為反相柱，則極性比流動相大；若為正相柱，則極性比流動相?。┑娜軇┲苽錁悠啡芤海M量用流動相制備樣品液第31頁，共38頁，2022年，5月20日，18點6分，星期六高效液相色譜儀的注意事項三、操作過程1、先以所用流動相沖洗系統(tǒng)一定時間（如所用流動相為含鹽流動相，必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動相），正式進樣分析前30min左右開啟D燈或W燈，以延長燈的使用壽命；2、溶劑瓶中的沙芯過濾頭容易破碎，在更換流動相時注意保護，當發(fā)現(xiàn)過濾頭變臟或長菌時，不可用超聲洗滌，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌；3、實驗結束后，一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個管路30分鐘以上，再用甲醇沖洗。沖洗過程中關閉D燈、W燈；第32頁