2021年單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在胰腺癌領(lǐng)域應(yīng)用現(xiàn)狀和展望

2021年單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在胰腺癌領(lǐng)域應(yīng)用現(xiàn)狀和展望摘要胰腺癌是預(yù)后極差的惡性腫瘤，其特征是癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中存在復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)和極高的異質(zhì)性，導(dǎo)致缺乏早期診斷和有效治療的策略。新興的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)從單細(xì)胞層面進(jìn)行基因組、轉(zhuǎn)錄組或表觀遺傳學(xué)分析，揭示疾病內(nèi)在的分子機(jī)制，相比于傳統(tǒng)的研究方法，更有助于闡明腫瘤內(nèi)異質(zhì)性問(wèn)題。目前，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于胰腺癌領(lǐng)域的研究，并取得了顯著成果，加深了對(duì)胰腺癌特征的理解，促進(jìn)了診療技術(shù)的發(fā)展。胰腺癌是侵襲性的惡性腫瘤，95%為導(dǎo)管腺癌。近年來(lái)，隨著生活方式的改變，以及人口老齡化、預(yù)期壽命增加等因素，其發(fā)病率和死亡率平均每年升高0.3%［1］。胰腺癌已成為第三大癌癥相關(guān)死亡原因［2］,預(yù)計(jì)2030年將成為第二大癌癥相關(guān)死亡原因［3］。由于缺乏特異性癥狀及生物學(xué)標(biāo)記物，早期診斷非常困難；胰腺癌進(jìn)展迅速，多數(shù)病人確診時(shí)已無(wú)法手術(shù)［4］;同時(shí)，該腫瘤對(duì)大多數(shù)治療方法不敏感［5］,因此預(yù)后極差，總體5年生存率＜10%［6］?？偟膩?lái)說(shuō)，胰腺癌已成為嚴(yán)重威脅人類健康的惡性疾病，受到了越來(lái)越多的關(guān)注和重視。一些研究結(jié)果表明，胰腺癌細(xì)胞及其微環(huán)境中獨(dú)特的相互作用網(wǎng)絡(luò)及高度異質(zhì)性可能在腫瘤的起源、進(jìn)展及耐藥方面發(fā)揮重要作用［7-8］,闡明其內(nèi)在的復(fù)雜機(jī)制已完成該領(lǐng)域?qū)W者的共同目標(biāo)。盡管開展了大量工作，但效果并不理想，與其他腫瘤相比，近年來(lái)胰腺癌病人5年生存率的改善最低［9］,其中一個(gè)重要原因在于傳統(tǒng)研究方法在探索腫瘤異質(zhì)性上的局限性。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)為突破這一困境帶來(lái)了希望，它能夠深層次地分析細(xì)胞不同亞群的分布、狀態(tài)及相互作用等，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的一些不足，提供了新的研究手段。目前，一些基于單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的研究已取得顯著成果，對(duì)胰腺癌的發(fā)生進(jìn)展有了新的認(rèn)識(shí)，為早期診斷和有效治療提供了可能的靶點(diǎn)，促進(jìn)了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)在胰腺癌領(lǐng)域的發(fā)展。1單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)概述單細(xì)胞測(cè)序是指對(duì)單個(gè)細(xì)胞的遺傳信息進(jìn)行測(cè)序，分析其基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀遺傳學(xué)等生物信息的技術(shù)。主要有以下幾個(gè)步驟：從新鮮組織樣本分離單細(xì)胞、細(xì)胞溶解、核酸獲取、擴(kuò)增序列、測(cè)序及分析［10］。目前各個(gè)步驟的技術(shù)已趨于成熟，單細(xì)胞測(cè)序已廣泛應(yīng)用于科研及臨床的各個(gè)領(lǐng)域。在腫瘤研究領(lǐng)域，測(cè)序技術(shù)可用于研究腫瘤遺傳變異、代謝活動(dòng)、進(jìn)展過(guò)程等，從而闡明腫瘤內(nèi)在的分子機(jī)制，為臨床診療提供理論支持。傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)針對(duì)組織樣本中所有細(xì)胞，得到全部遺傳信息，但只能反映這群細(xì)胞的平均變異水平，不能得到單個(gè)細(xì)胞的遺傳信息［11］。隨著對(duì)于腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的重視不斷加深，傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)已不能滿足研究需求。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其可以揭示每個(gè)細(xì)胞獨(dú)特的遺傳信息，并發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型，同時(shí)其分析更高效，還能解決一些樣本量較少的問(wèn)題。這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用正幫助人們更好地了解腫瘤的本質(zhì)特征。2單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在胰腺癌領(lǐng)域的應(yīng)用胰腺癌的早期診斷胰腺位于上腹部深處，周圍有血管包繞，影像學(xué)檢查難以發(fā)現(xiàn)早期腫瘤。胰腺癌缺乏特異性癥狀及生物學(xué)標(biāo)記物，病人從出現(xiàn)癥狀到確診往往延誤2個(gè)月以上［12］。偶然發(fā)現(xiàn)的早期胰腺癌病人和晚期確診的病人5年生存率相差極大［1］,說(shuō)明胰腺癌的早期診斷對(duì)改善預(yù)后意義重大。目前，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)已應(yīng)用于胰腺癌的癌前病變及起源相關(guān)的研究，為早期診斷提供了一些新的見解。胰腺囊性腫瘤被認(rèn)為是胰腺癌的前體病變，其中最常見的是導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性瘤(IPMN)。大部分IPMN是低級(jí)別異性增生，但一些IPMN具有侵襲性成分并發(fā)展為胰腺癌，這部分病人預(yù)后明顯變差［13］,目前沒有可靠的標(biāo)記物區(qū)分惰性和侵襲性IPMN。Bernard等［14］對(duì)2例低級(jí)別IPMN(LGD)、2例高級(jí)別IPMN(HGD)和2例胰腺癌標(biāo)本的5403個(gè)細(xì)胞做了單細(xì)胞RNA測(cè)序，分析了從LGD向胰腺癌發(fā)展的過(guò)程中，上皮細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的異質(zhì)性變化。該研究結(jié)果顯示LGD中有促癌基因轉(zhuǎn)錄組表達(dá)，但同時(shí)有抑癌通路激活，而HGD中這些抑癌通路消失，出現(xiàn)和胰腺癌類似的信號(hào)通路。在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)了特異性表達(dá)C-X-C趨化因子配體12(CXCL12)的炎癥性成纖維細(xì)胞，CXCL12在胰腺癌進(jìn)展中起重要作用［15］,上述成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)伴隨著免疫逃逸微環(huán)境的形成。此外，在IPMN微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了樹突狀細(xì)胞，表明癌前病變期間存在炎癥階段，而在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中逐漸消失。上述研究探究了囊性病變向胰腺癌發(fā)展的過(guò)程中微環(huán)境內(nèi)發(fā)生的改變，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)幫助識(shí)別了各種細(xì)胞的變化過(guò)程，并在LGD中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄表型類似HGD和胰腺癌的細(xì)胞群。另一項(xiàng)關(guān)于IPMN的研究利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)分析了新鮮IPMN組織中單個(gè)腫瘤細(xì)胞的體細(xì)胞突變，識(shí)別了IPMN中存在的遺傳異質(zhì)性［16］。該研究結(jié)果證明了IPMN中KRAS突變存在的多克隆性，發(fā)現(xiàn)了新的頻繁突變的抑癌基因ARID1A，并鑒別了不同細(xì)胞發(fā)生的不同基因突變。腺泡細(xì)胞化生是胰腺癌起始過(guò)程的早期事件，但對(duì)相關(guān)的分子機(jī)制了解很少。Schlesinger等［17］應(yīng)用胰腺癌小鼠模型，對(duì)處于疾病不同階段的腫瘤組織進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)腺泡化生細(xì)胞具有不同的亞群，在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中不斷變化，并和其他細(xì)胞相互作用，鑒定了在化生過(guò)程中參與調(diào)控KRAS下游通路基因的轉(zhuǎn)錄因子ONECUT2,該轉(zhuǎn)錄因子與預(yù)后相關(guān)，可能作為胰腺癌早期進(jìn)展的新的驅(qū)動(dòng)因子。此外，該研究根據(jù)不同階段的基因表達(dá)差異，指出了幾個(gè)可能預(yù)示惡性進(jìn)展的標(biāo)記物，如MMP7、IGFBP7等。這些結(jié)果為闡明胰腺癌的起源機(jī)制提供了基礎(chǔ)，有助于發(fā)現(xiàn)可用于早期診斷的標(biāo)記物。該研究結(jié)果部分解釋了化生過(guò)程中的異質(zhì)性，但并未確定哪些腺泡化生細(xì)胞會(huì)發(fā)展為癌癥，基于這些結(jié)果的進(jìn)一步分析可能帶來(lái)更深刻的理解。這些針對(duì)胰腺癌癌前病變的研究充分發(fā)揮了單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，為理解胰腺癌的起源過(guò)程補(bǔ)充了新的理論，同時(shí)也留下很大空間等待更進(jìn)一步的探索。胰腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移胰腺癌的惡性特征之一在于進(jìn)展迅速，基因組和轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)揭示了一些腫瘤起始相關(guān)的基因突變，但關(guān)于胰腺癌進(jìn)展的機(jī)制仍不清楚，因此臨床上缺乏有效干預(yù)手段。主要原因是不同胰腺癌之間的異質(zhì)性、以及胰腺癌內(nèi)部微環(huán)境的異質(zhì)性給研究人員帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為探索腫瘤遺傳和功能的異質(zhì)性、檢測(cè)不同細(xì)胞亞群提供了有力的工具，這為闡明腫瘤進(jìn)展的機(jī)制帶來(lái)了希望。Peng等［18］利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究了胰腺癌內(nèi)部的異質(zhì)性和調(diào)控胰腺癌進(jìn)展的相關(guān)因素，發(fā)現(xiàn)2種有不同惡性基因表達(dá)譜的導(dǎo)管細(xì)胞亞群，其中具有獨(dú)特增殖特征的導(dǎo)管細(xì)胞亞群與腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞的失活狀態(tài)有關(guān)，此外，該研究證明了胰腺癌中Wnt、Notch等異常通路的作用，并發(fā)現(xiàn)了如EGLN3、MMP9等參與癌變的新基因，以及FOS、KLF5等轉(zhuǎn)錄因子。這項(xiàng)研究結(jié)果提供了新的預(yù)后標(biāo)記物，并為闡明胰腺癌的異質(zhì)性和腫瘤進(jìn)展機(jī)制打下了基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)移惡化是胰腺癌導(dǎo)致死亡的主要原因之一，發(fā)生轉(zhuǎn)移的病人只能接受姑息治療，預(yù)后極差。即使早期診斷并接受手術(shù)，大部分病人也會(huì)在4年內(nèi)復(fù)發(fā)［1］,提示胰腺癌可能存在早期微轉(zhuǎn)移。因此，了解轉(zhuǎn)移過(guò)程的機(jī)制、尋求預(yù)防和治療轉(zhuǎn)移性疾病的方法對(duì)改善胰腺癌病人的預(yù)后非常重要。Lin等［19］對(duì)原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移組織進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，識(shí)別了多種不同的細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶中幾乎沒有成纖維細(xì)胞，并根據(jù)基因表達(dá)將腫瘤細(xì)胞分為2個(gè)亞群，其中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化型預(yù)示著更差的預(yù)后。這項(xiàng)研究確定了原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移性病變之間的異質(zhì)性，提供了胰腺癌微環(huán)境的相關(guān)信息，可能為病人的治療提供一些參考。循環(huán)腫瘤細(xì)胞也是研究腫瘤轉(zhuǎn)移的對(duì)象之一。之前已有觀點(diǎn)認(rèn)為循環(huán)中腫瘤細(xì)胞具有在遠(yuǎn)處器官啟動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)的能力［20-21］,但血液中的癌細(xì)胞極其罕見，阻礙了傳統(tǒng)的研究方法進(jìn)行更深入的探索，而單細(xì)胞測(cè)序可以彌補(bǔ)這種樣本量少的問(wèn)題，目前Yu等［22］開發(fā)了新的測(cè)序方法以更準(zhǔn)確地鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞，這將有效推動(dòng)相關(guān)研究，以探索新的治療靶點(diǎn)或預(yù)后標(biāo)記物。最近，一項(xiàng)研究構(gòu)建了高轉(zhuǎn)移性胰腺癌病人來(lái)源的異種移植小鼠模型，并分選了循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，從而發(fā)現(xiàn)了腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中高度上調(diào)的關(guān)鍵基因BIRC5，這是有絲分裂和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，研究結(jié)果顯示敲除或用YM155抑制BIRC5會(huì)使癌細(xì)胞死亡，表明BIRC5促進(jìn)了循環(huán)中癌細(xì)胞的存活；且單用YM155或聯(lián)合化療可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［23］。這些結(jié)果拓展了對(duì)胰腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的理解，并提供了預(yù)防轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)。胰腺癌的治療大部分胰腺癌病人沒有手術(shù)機(jī)會(huì)，化療仍是主要的治療手段［24］,而傳統(tǒng)的細(xì)胞毒類藥物對(duì)胰腺癌病人生存期的改善微乎其微［25］。免疫治療是新興的治療方法，已在其他腫瘤治療中取得了較好的效果，但胰腺癌特殊的微環(huán)境使其對(duì)大部分免疫治療沒有反應(yīng)。成纖維細(xì)胞是構(gòu)成胰腺癌微環(huán)境的主要細(xì)胞。研究結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞通過(guò)向癌細(xì)胞提供代謝需要的物質(zhì)維持腫瘤生長(zhǎng)［26］,但抑制成纖維細(xì)胞的治療方法得出了相互矛盾的結(jié)果，提示成纖維細(xì)胞中各個(gè)亞群存在不同的甚至相反的功能。為了更好地了解腫瘤微環(huán)境，Dominguez等［27］通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在動(dòng)物模型中繪制了胰腺癌進(jìn)展過(guò)程中成纖維細(xì)胞圖譜。重要的是，該研究識(shí)別了一類轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B調(diào)控的表達(dá)LRRC15蛋白的成纖維細(xì)胞，并在人胰腺癌中證明了其存在，這一特殊亞群只出現(xiàn)在腫瘤組織且與抗程序性死亡配體（PD）-L1治療不敏感有關(guān)。這一結(jié)果為針對(duì)腫瘤成纖維細(xì)胞的治療提供了可能的靶點(diǎn)，有望改善胰腺癌的治療效果。除成纖維細(xì)胞外，免疫細(xì)胞也在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮了巨大作用。之前有研究結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的CD47抑制了巨噬細(xì)胞的吞噬功能［28］,抗CD47抗體可改善細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［29］,阻斷CD47-SIRPa通路可以起到抑制腫瘤的作用［30］。但CD47在胰腺癌中的表達(dá)和作用機(jī)制尚不清楚，因此，Pan等［31］研究了靶向CD47治療在胰腺癌小鼠中的作用，并利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)分析其機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)抗CD47治療導(dǎo)致了腫瘤微環(huán)境的改變，如促炎巨噬細(xì)胞增多，免疫抑制相關(guān)的巨噬細(xì)胞減少。在2種小鼠模型中進(jìn)行抗CD47與抗PD-L1聯(lián)合治療，測(cè)序結(jié)果表明對(duì)關(guān)鍵基因的影響并不一致，這種差異的原因還有待研究。這一研究結(jié)果可能為調(diào)控胰腺癌病人的免疫微環(huán)境帶來(lái)新的理解。事實(shí)上，一些結(jié)果顯示調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞與免疫治療結(jié)合的方法能夠改善預(yù)后［32-34］,多種治療方法的協(xié)調(diào)，如聯(lián)合靶向癌細(xì)胞和間質(zhì)，逆轉(zhuǎn)抑制性免疫反應(yīng)和增強(qiáng)抗腫瘤免疫活性，可能是治療胰腺癌最有希望的方向［35］。而單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能幫助探索胰腺癌及微環(huán)境中各個(gè)細(xì)胞亞群的功能，有助于闡明內(nèi)在的具體機(jī)制，從而為聯(lián)合治療提供有效的靶點(diǎn)，并有望基于個(gè)體差異實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。3單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的局限性及未來(lái)方向單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用為胰腺癌研究帶來(lái)了新的希望，破解腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的能力使其成為胰腺癌領(lǐng)域的利器。但不可否認(rèn)，該技術(shù)也存在一定的局限性，如耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)樣本質(zhì)量要求高、花費(fèi)大、可能存在誤差等，這些缺點(diǎn)可能會(huì)隨著技術(shù)的完善被逐步解決。目前很多單細(xì)胞測(cè)序研究的樣本量均較小，這可能導(dǎo)致研究結(jié)果不適用于所有的胰腺癌病人，同時(shí)一些研究結(jié)果也引出了更多值得關(guān)注和探索的問(wèn)題，例如鑒定出的不同細(xì)胞亞群在腫瘤中怎樣發(fā)揮作用、這些細(xì)胞在疾病不同階段或不同位置有哪些變化等，未來(lái)應(yīng)繼續(xù)將單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)的研究方法結(jié)合，擴(kuò)大樣本量，在已有