實(shí)驗(yàn)三 紅曲色素的提取課件

實(shí)驗(yàn)三、紅曲發(fā)酵及紅曲色素的提取123紅曲霉菌紅曲背景簡(jiǎn)介：紅曲色素紅曲霉菌紅曲霉菌是一種對(duì)人類有益的真菌，紅曲霉菌能使大米發(fā)酵制成紅曲米。紅曲霉菌菌絲具有橫隔、多核、分枝較多且不規(guī)律。由紅曲霉接種于大米發(fā)酵得到的紅曲是我國(guó)古代的一大發(fā)明，稱為丹曲，至今已有1000多年的歷史，很早就應(yīng)用于食品著色、食品發(fā)酵以及中醫(yī)中藥。紅曲

紅曲又名丹曲、赤曲、紅曲米，是以秈米為原料，經(jīng)紅曲霉菌液體深層發(fā)酵精致而成，是一種純天然、安全性高、有益于人體健康的食品添加劑。而且本品色澤鮮艷、色調(diào)純正是天然綠色食品理想的著色劑。它應(yīng)用范圍廣泛，包括食品類（肉制品、果汁、色酒、果醬、飲料、糖果、糕點(diǎn)、醬油、保健醋等）；藥品類（藥品著色劑、功能性保健品）；化妝品類。

紅曲色素紅曲色素是一種由紅曲霉屬的絲狀真菌經(jīng)發(fā)酵而成的優(yōu)質(zhì)的天然食用色素，是紅曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

紅曲色素，紅曲色素分為黃色素、橙色素和紫紅色素。商品名叫紅曲紅，是以大米、大豆為主要原料，經(jīng)紅曲霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)、提取、濃縮、精制而成，或者是以紅曲米為原料，經(jīng)萃取、濃縮、精制而成的天然紅色色素。

紅曲色素

物理性質(zhì)：紅曲色素呈深紫紅色粉末，略帶異臭，熔點(diǎn)為165~192℃。化學(xué)性質(zhì)：紅曲色素中的脂溶性色素均能溶于乙醇等有機(jī)溶劑。常用的溶劑是乙醇和醋酸，紅曲色素含量低時(shí)其溶液呈鮮紅色，含量高時(shí)呈帶黑褐色并伴有熒光產(chǎn)生。對(duì)蛋白質(zhì)的著色性能極好，一旦染著，雖經(jīng)水洗，亦不掉色。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解紅曲菌液體菌種的制備方法,為紅曲發(fā)酵實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備液體種子。2、了解固體發(fā)酵的工藝過(guò)程,在實(shí)驗(yàn)室中小規(guī)模制備紅曲。3、熟悉從紅曲中分離代謝產(chǎn)物的方法，以及掌握紅曲色素色價(jià)的測(cè)定方法。紅曲液體菌種的制備

一、實(shí)驗(yàn)原理

紅曲霉菌是一種好氧性微生物,除了能進(jìn)行固體淺盤培養(yǎng)外,還可以用液體搖瓶培養(yǎng)的方法來(lái)獲得種子。液體菌種生產(chǎn)具有純度高、活力強(qiáng)、繁殖快的特點(diǎn)，接種到固體培養(yǎng)料內(nèi)有流動(dòng)性好、萌發(fā)點(diǎn)多，菌絲生長(zhǎng)迅速等特種點(diǎn)。液體菌種應(yīng)用于生產(chǎn)與固體菌種相比有以下優(yōu)點(diǎn)：菌種生產(chǎn)周期短；接種后，萌發(fā)點(diǎn)多；接種方便、成本低；適宜工廠化生產(chǎn)。液體菌種為固態(tài)發(fā)酵的集約化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)創(chuàng)造了更好的條件。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.配制玉米面液體培養(yǎng)基。500mL三角瓶中裝玉米面液體培養(yǎng)基150mL,包扎后0.lMPa滅菌20分鐘。2.玉米面液體培養(yǎng)基滅菌冷卻后，每瓶中接入1/4支紅曲斜面菌苔(注意無(wú)菌操作)。3.接種后置30℃恒溫?fù)u床中180rpm搖瓶培養(yǎng)3天。紅曲固體發(fā)酵紅曲固態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵的定義：微生物在幾乎沒(méi)有游離可流動(dòng)水的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)過(guò)程及生物反應(yīng)過(guò)程。影響紅曲發(fā)酵的因素（1）菌種：應(yīng)選擇生長(zhǎng)快、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)紅色素明顯的菌株；（2）原料：一般選用無(wú)黏性的梗米或秈米，其淀粉含量高、營(yíng)養(yǎng)豐富，且可吸收適量水分。米的含水量對(duì)發(fā)酵影響很大，起始水分含量低，紅曲色素易生成；水分含量高，會(huì)抑制色素合成。一般米中含水量以25%～30%為宜；（3）補(bǔ)水：紅曲霉在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中，需要補(bǔ)充適量水分，尤其在生長(zhǎng)旺盛期補(bǔ)水顯得更為重要；（4）濕度：空氣相對(duì)濕度關(guān)系到水分的蒸發(fā)，對(duì)發(fā)酵的影響也很大，一般RH控制在85%以上；（5）溫度：能在20～37℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)，通常冷卻至30℃左右即可接種，采用30℃發(fā)酵；（6）通氣：紅曲霉是一種好氧性微生物，因此培養(yǎng)過(guò)程中要注意保持良好的通氣。培養(yǎng)條件對(duì)菌體生長(zhǎng)及紅曲色素形成的影響2.溫度和pH

雖然不同的紅曲霉菌株其最適生長(zhǎng)溫度和最適生長(zhǎng)pH有所不同，但大多數(shù)菌株的適溫為30～35℃，25℃以下或40℃以上生長(zhǎng)緩慢。最適pH為3.0～5.0，pH3.0以下生長(zhǎng)緩慢，pH5.0以上則不適于產(chǎn)生色素。3.無(wú)機(jī)鹽類

高濃度的CoCl2（10－4）、CuCl2（10－6）和ZnCl2（10－3）對(duì)大多數(shù)紅曲霉株的生長(zhǎng)有抑制作用，低濃度的CoCl2（10－5）、CuCl2（10－7）和ZnCl2（10－5）可促進(jìn)色素生成。二、實(shí)驗(yàn)器材與試劑1、制曲原料:優(yōu)質(zhì)秈米。2、蒸鍋、三角瓶、玻璃棒、移液管（滅菌），超凈工作臺(tái)。三、實(shí)驗(yàn)步驟1．浸米:取1/3袋左右的大米，25℃以上浸米約20h,大米吸收水分約在28%～30%。2．蒸米:將浸好的米用清水淋去米漿水,瀝干,即可蒸米。上汽火力要強(qiáng),加水40%，121℃，蒸30分鐘，待全部圓氣以后，飯粒呈玉色,粒粒疏松,不結(jié)團(tuán)塊。3．?dāng)倹鼋臃N:將蒸熟的曲料倒在超凈工作臺(tái)上迅速打碎團(tuán)塊,攤平冷卻到30～32℃。每組準(zhǔn)備好500ml三角瓶裝5-10厘米左右米飯。然后在無(wú)菌操作臺(tái)上接種，接種量2%～10%，接種前用具消毒滅菌，在酒精燈火焰上方操作接種。充分翻拌混合均勻,操作要迅速,以減少雜菌污染。4．發(fā)酵培養(yǎng):

接好種的三角瓶在恒溫恒濕生長(zhǎng)培養(yǎng)箱中，30～35℃培養(yǎng)5～8d。

每天翻曲一次，觀察到曲粒表面略有干皮、少數(shù)曲粒略有微紅斑點(diǎn)等現(xiàn)象時(shí)即可“吃水”，使曲粒吸收一定水分,以利菌絲逐漸向內(nèi)生長(zhǎng)。

吃水方法:一邊拌曲，一邊向曲盤中噴灑無(wú)菌水,使曲粒表面潤(rùn)濕并微有發(fā)脹。培養(yǎng)3天后米粒逐漸成紅色。觀察記錄色素產(chǎn)生的過(guò)程。培養(yǎng)5-7天后，固態(tài)發(fā)酵結(jié)束的紅曲置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)50-60℃鼓風(fēng)干燥。5．成品質(zhì)量檢查

外觀檢查

:曲粒表層光滑紫紅,曲粒中心呈玉色,不得有空心和紅心。曲粒斷面菌絲均勻，具有紅曲特有的曲香,不得有酸氣等不正常氣味。

生物與理化項(xiàng)目檢查:水分12%以下,容量(l00mL)44.5～46.5g,淀粉含量５９％～６２%,無(wú)細(xì)菌和其他霉菌污染。一、實(shí)驗(yàn)原理

大米經(jīng)紅曲菌固體發(fā)酵后產(chǎn)生了一系列紅曲菌的代謝產(chǎn)物,但這些產(chǎn)物的量非常少,大米仍占固體發(fā)酵產(chǎn)物的絕大部分體積,為了降低運(yùn)輸成本,常常要對(duì)紅曲菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行提取和濃縮。紅曲的代謝產(chǎn)物中既有水溶性組分,也有脂溶性組分,因此可用80%的丙酮(丙酮:水=80：20)抽提。用HCl或NaOH處理可以將其中的酸溶性組分、堿溶性組分和中性組分分開。

紅曲色素的提取及紅曲色價(jià)測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)原理

選擇溶劑一般要注意以下四點(diǎn)：①溶劑對(duì)所需成分的溶解度要大，對(duì)雜質(zhì)溶解度要小，或反之。②溶劑不能與天然藥物成分產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，即使反應(yīng)亦屬于可逆性的。③溶劑要經(jīng)濟(jì)易得，并具有一定的安全性。④沸點(diǎn)宜適中，便于回收反復(fù)使用。紅色素能溶于80%的乙醇中，可通過(guò)萃取從米粒中提取出來(lái),紅曲色素在505nm處有最大的吸收峰,可用分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定。二、實(shí)驗(yàn)器材與試劑1、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,分液漏斗，分光光度計(jì),水浴鍋,量筒等。2、酸乙酯,丙酮，80%乙醇等

三.實(shí)驗(yàn)步驟12

紅曲色素的提取紅曲色價(jià)測(cè)定一般提取方法：萃取法組織培養(yǎng)法粉碎法壓榨法酶反應(yīng)法微生物發(fā)酵法人工合成法

紅曲色素的提取紅曲色素的提取具體步驟：1、取200g固體發(fā)酵之紅曲,在植物粉碎機(jī)中將其粉碎；2、將紅曲粉放于500mL三角瓶中,加入提取液(丙酮:水=80:20)200-300mL；

3、室溫下?lián)u動(dòng)10-15min左右，過(guò)濾；4、在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸去丙酮(尚有水分，60℃)；5、用lmol/LHCl調(diào)殘留液(約l00mL)的pH至3.0,加至分液漏斗中；加入150ml的醋酸乙酯（EtOAc)分次抽提。圖一：紅曲代謝產(chǎn)物分離工藝流程圖第一次第二次第三次第四次分工：一組：配制提取液（丙酮：水=80：20），2000ml；二組：配制1mol/LHCl，1000ml；三組：配制2mol/LNaOH,500ml;四組：配制Na2CO3(pH=9),500ml;具體方法：紅曲色價(jià)測(cè)定：1、稱取紅曲米樣品0.5g,放入帶有刻度的lOmL具塞試管中；2、加入80%的乙醇8mL,搖勻,60℃水浴保溫萃取0.5h；3、取出冷卻,用普通定性濾紙過(guò)濾入lOmL量筒中,用80%乙醇洗滌殘?jiān)?次,合并濾液,并用80%乙醇定容至10mL；4、以80%乙醇作對(duì)照,在505