MCF-7乳腺癌細(xì)胞腫瘤干特性細(xì)胞亞群的分離鑒定及其相關(guān)特

[通訊作者]劉曉渝，E-mail：xiaoyuliu1219@163.comcolonyformationassayinvivoandinvitro,respectively).Finally,weterminatedourexperimentbycomparisonchemo-radioresistanceandmatrigelinvasionassayandtheexpressionofcancerinvasion-relatedgenematrixmetalloproteinase2(MMP2),Epidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)inCD44+CD24-cellsandnon-CD44+CD24-cells.ResultsIngeneral,CD44+CD24-stem-likecellstendedtorespondmorepoorlytochemoradiationthantheirnonstemcounterparts.FurtherstudiesrevealedthatCD44+CD24-cellswhichscoredpositiveinthemigrationandinvasionassaygotahigherexpressionofcancerinvasionrelatedgenes.ConclusionCD44+CD24-breastcancercellswithstemnesspropertiesarechemoradioresistanceandmoreinvasive.[Keywords]breastcancerstemcells；MCF-7；chemoradioresistance；cancerinvasion；nudemiceCorrespondingAuthor：LiuXiaoyuE-mail：xiaoyuliu1219@163.com目前乳腺癌在全世界女性癌癥患病率中高居第一，據(jù)國(guó)外統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每八個(gè)女性當(dāng)中就會(huì)有一個(gè)在一生某個(gè)階段患此疾病[1]。目前乳腺癌最主要的治療手段包括手術(shù)、藥物（內(nèi)分泌治療及化療）放射及靶向治療。然而，在這些治療方法中效益比高的只有手術(shù)。過(guò)去人們把癌細(xì)胞看成是同質(zhì)性的個(gè)體，因此，藥物的殺傷作用理所應(yīng)當(dāng)對(duì)所有腫瘤細(xì)胞等同。但事實(shí)上癌細(xì)胞不僅在形態(tài)學(xué)上具有異質(zhì)性，而且還體現(xiàn)在功能上：如表面標(biāo)記蛋白的表達(dá)，分化能力及成瘤能力等?；谀壳霸絹?lái)越多的證據(jù)表明腫瘤干細(xì)胞的存在，美國(guó)癌癥研究協(xié)會(huì)（AACR）在2006年對(duì)腫瘤干細(xì)胞的定義達(dá)成了共識(shí)“腫瘤內(nèi)擁有自我更新能力且可以異質(zhì)性分化形成腫瘤的一類細(xì)胞”[2]。實(shí)體腫瘤干細(xì)胞的研究起步較晚，2003年美國(guó)研究人員首次對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的相關(guān)表面標(biāo)記物進(jìn)行了篩選，提出了潛在的乳腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物[3]。然而，乳腺癌干細(xì)胞對(duì)放化療的反應(yīng)，尤其是在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移中所扮演的作用仍無(wú)從得知。1材料與方法1.1一般資料DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco)公司。生長(zhǎng)因子BFGF和EGF來(lái)自Invitrogen公司。CD44-PE單抗，CD24-FITC單抗，MMP2單抗和EGFR單抗均從EBiosciences公司購(gòu)買。5-Fu來(lái)自Sigma公司?；|(zhì)膠Matrigel來(lái)自BD公司，Transwell小室來(lái)自millpore公司。醫(yī)用直線加速器VarianiX美國(guó)瓦里安公司。流式細(xì)胞分選儀BectonDickinson公司。1.2細(xì)胞與動(dòng)物人低分化乳腺癌細(xì)胞MCF-7來(lái)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。30只4周齡雌性裸鼠購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，5只/盒，飼養(yǎng)在SPF級(jí)環(huán)境中。1.3FACS流式細(xì)胞分選MCF-7細(xì)胞種于100mm培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿80%后收集5×105個(gè)細(xì)胞，加入稀釋10倍的CD44-PE和CD24-FITC室溫避光孵育30分鐘。然后上流式細(xì)胞儀分選（儀器需提前滅菌處理）。1.4細(xì)胞球克隆形成實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)分選的CD44+CD24-細(xì)胞和nonCD44+CD24-細(xì)胞（對(duì)照）重新接種于48孔超低黏附板，每孔10個(gè)細(xì)胞。300μlDMEM培養(yǎng)基中另加40ng/ml的BFGF和20ng/ml的EGF。4周后，檢查形成細(xì)胞球的培養(yǎng)板孔數(shù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。1.5體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)PBS混懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取0.2mL實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（CD44+CD24-5×104）和對(duì)照組細(xì)胞（nonCD44+CD24-5×105）分別注射在裸鼠的后腿背根部。每組老鼠共注射15只。每天對(duì)老鼠進(jìn)行觀察，連續(xù)6周測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)情況。1.6體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)鋪100μl稀釋好的基質(zhì)膠（5mg/ml）在Transwell小室中（內(nèi)鋪有8μm直徑的帶孔薄膜）。收集細(xì)胞后計(jì)數(shù)，用0.1%FBS重懸細(xì)胞，調(diào)整密度為2×103/mL。吸取100μl細(xì)胞懸液加入上室基質(zhì)膠中。下室僅添加600μl含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液。24小時(shí)后，棄掉培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定，然后用棉簽小心抹去上室細(xì)胞，用1%結(jié)晶紫染色20分鐘，倒置顯微鏡鏡觀并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。1.7MTT實(shí)驗(yàn)兩組細(xì)胞經(jīng)5-FU（10～100μmol）處理48小時(shí)，加入0.5mg/ml的MTT37°C培養(yǎng)4小時(shí)。小心吸掉上清，每孔加入100μl二甲基亞砜，置搖床上低速震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值。然后繪制細(xì)胞存活曲線。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。1.8彗星實(shí)驗(yàn)兩組細(xì)胞都經(jīng)X射線加速器以3Gy/min的劑量率，總劑量為0.2，4Gy進(jìn)行照射。照射后2小時(shí)立即收集細(xì)胞進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟基于參考文獻(xiàn)[4]。步驟完成后，每塊玻片取30個(gè)代表性的細(xì)胞用彗星實(shí)驗(yàn)專用分析軟件CASP進(jìn)行自動(dòng)分析。OliveTailMoment(OTM:平均DNA遷移長(zhǎng)度×彗星尾部相對(duì)DNA量)用于定量DNA損傷分析。1.9Real-timePCR引物由上海生物工程技術(shù)公司合成：EGFR上游引物5-CCTAAGATCCCGTCCATCGC-3’，下游引物5’-GGAGCCCAGCACTTTGATCT-3’。MMP2上游引物5’-GTCTGTGTTGTCCAGAGGCA-3’,下游引物5-CTAGGCCAGCTGGTTGGTTC-3’。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照Fermentas公司提供的SYBRGreen/ROXqPCRMasterMix(2X)擴(kuò)增試劑盒操作步驟進(jìn)行。1.10Westernblot按照試劑盒說(shuō)明操作，首先裂解細(xì)胞獲取總蛋白。測(cè)定蛋白濃度后，等量上樣。10%PAGE分離，轉(zhuǎn)PVDF膜，加入一抗，二抗。以ECL化學(xué)發(fā)光試劑在X線膠片上曝光顯隱。β-actin為內(nèi)參。1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。兩組間比較均用SPSS16.0進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。p≤0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1CD44+CD44-MCF-7細(xì)胞“癌干”特性的確認(rèn)在細(xì)胞球克隆形成實(shí)驗(yàn)中，CD44+CD24-細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組比nonCD44+CD24-細(xì)胞對(duì)照組有明顯更多的培養(yǎng)孔板形成了細(xì)胞（圖1,p<0.01）。細(xì)胞球直徑可以達(dá)到100μm左右，含大約有1000個(gè)細(xì)胞（數(shù)據(jù)未出示）。在動(dòng)物體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)注射1×104CD44+CD24-細(xì)胞可以導(dǎo)致80%（12/15）的裸鼠腫瘤形成，并且成瘤時(shí)間小于1周。相比較，對(duì)照組雖注射1×105nonCD44+CD24-細(xì)胞卻只能造成20%(3/15)的裸鼠成瘤（圖2）。而且腫瘤生長(zhǎng)非常緩慢。我們對(duì)此結(jié)果解釋為實(shí)驗(yàn)組CD44+CD24-細(xì)胞的確有內(nèi)在成瘤特性。這一特性正是美國(guó)癌癥研究協(xié)會(huì)關(guān)于癌癥干細(xì)胞的定義最重要一點(diǎn)（參見正文引言）。2.2CD44+CD24-MCF-7細(xì)胞具有放化療抵抗性在MTT實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)比兩組細(xì)胞存活曲線得出兩組細(xì)胞在同等藥物劑量下敏感性具有很大的差異，總的來(lái)說(shuō)CD44+CD24-細(xì)胞比nonCD44+CD24-細(xì)胞對(duì)5-FU具有更高的抵抗性（圖3）。在腫瘤干細(xì)胞領(lǐng)域，單個(gè)細(xì)胞層面的研究必不可少。因此，我們開展彗星實(shí)驗(yàn)更直觀的了解X射線照射單個(gè)細(xì)胞后DNA的變化。在此實(shí)驗(yàn)中，受照射的細(xì)胞DNA會(huì)發(fā)生斷裂，經(jīng)電泳后會(huì)在DNA頭部周圍形成一條拖尾，鏡觀如“彗星”。其DNA受損程度和拖尾長(zhǎng)度及OTM值成正比。兩組細(xì)胞OTM值在低劑量2Gy時(shí)差異不明顯，這可能和乳腺癌細(xì)胞的放射不敏感相關(guān)。但當(dāng)劑量增加到4Gy時(shí)，差異就相對(duì)明顯(p<0.05)。CD44+CD24-細(xì)胞不論在鏡下觀察其拖尾長(zhǎng)度和OTM值的測(cè)量都比CD44+CD24-細(xì)胞要短，值更?。▓D4）。2.3CD44+CD24-MCF-7細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)在體外基質(zhì)膠侵襲試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組CD44+CD24-細(xì)胞更容易穿過(guò)基質(zhì)膠，遷移到Transwell下室。在下室可以觀察到明顯多于對(duì)照組的癌細(xì)胞（圖5,p<0.01）。CD44+CD24-細(xì)胞對(duì)基質(zhì)膠有較強(qiáng)的穿透力意味著它可以合成更多的基質(zhì)金屬酶（MMPs）。最近研究人員在多種人類腫瘤包括乳腺癌都發(fā)現(xiàn)存在和腫瘤侵襲相關(guān)的一些基因，如MMPs,EGFR，環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase2,COX-2)等。這些基因可以調(diào)控腫瘤血管的形成，加速腫瘤細(xì)胞遷移進(jìn)入血液循環(huán)及轉(zhuǎn)移癌的形成[5]。因此我們選取兩個(gè)代表性的基因EGFR和MMP2，對(duì)比其在兩組細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果證實(shí)EGFR和MMP2在實(shí)驗(yàn)組CD44+CD24-細(xì)胞中mRNA水平和蛋白水平都明顯表達(dá)上調(diào)（圖6,p<0.01）。3討論CD44+CD24-在乳腺癌MCF-7細(xì)胞的表達(dá)會(huì)增強(qiáng)其成瘤能力，這一發(fā)現(xiàn)和在其它研究報(bào)道一致[6-7]。本研究揭示了CD44+CD24-MCF-7細(xì)胞在體外都具有增強(qiáng)的侵襲性。腫瘤侵襲性相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)暗示著其有可能在腫瘤的轉(zhuǎn)移中扮演著非常重要的作用。但由于本研究并沒有直接在動(dòng)物身上發(fā)現(xiàn)肺，肝等轉(zhuǎn)移灶的存在，因此無(wú)法驗(yàn)證?？赡苡捎趯?shí)驗(yàn)周期短（<6周）的原因。我們猜測(cè)只有微小部分具有成瘤能力的細(xì)胞即腫瘤干細(xì)胞才是腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的罪魁禍?zhǔn)?。通過(guò)檢測(cè)乳腺癌患者原發(fā)灶中CD44+CD24-細(xì)胞的表達(dá)，獲許就可對(duì)癌癥是否會(huì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移做出預(yù)知。也可能會(huì)加速病人對(duì)新輔助放化療敏感性的篩選，以此來(lái)降低患者術(shù)后復(fù)發(fā)率。最重要的是，若能選擇性的根除CD44+CD24-腫瘤干特性細(xì)胞，將有可能給患有侵襲性強(qiáng)和無(wú)法手術(shù)的乳腺癌患者帶來(lái)曙光。綜上所述,乳腺癌干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)、對(duì)放化療的抵抗性及在乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移中的重要作用值得我們繼續(xù)深入研究其生物學(xué)特點(diǎn)，找到乳腺癌干細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)及調(diào)控分化機(jī)制，在基因或者蛋白水平上捕捉到關(guān)系到乳腺癌干細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，為建立以干細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療體系奠定基礎(chǔ)，從而提高乳腺癌患者的生存率及生活質(zhì)量。參考文獻(xiàn):[1]SantisC,MaJ,BryanL,etal.Breastcancerstatistics,2013[J].CACancerJClin.2014,64(1):52-62.[2]ClarkeMF,DickJE,DirksPB,etal.Cancerstemcells--perspectivesoncurrentstatusandfuturedirections:AACRWorkshoponcancerstemcells[J].CancerRes,2006,66(19):9339-9344.[3]Al-HajjM,WichaMS,Benito-HernandezA,etal.Prospectiveidentificationoftumorigenicbreastcancercells[J].ProcNatlAcadSci,2003,100(7):3983-3988.[4]OlivePL,BanathJP,DurandRE.Heterogeneityinradiation-inducedDNAdamageandrepairintumorandnormalcellsmeasuredusingthe"comet"assay[J].RadiatRes,2012,178(2):AV35-42.[5]GuptaGP,NguyenDX,ChiangAC,etal.Mediatorsofvascularremodellingco-optedforsequentialstepsinlungmetastasis[J].Nature,2007,446(7137):765-770.[6]IdowuMO,KmieciakM,DumurC,etal.CD44(+)/CD24(-/low)cancerstem/progenitorcellsaremoreabundantintriple-negativeinvasivebreastcarcinomaphenotypeandareassociatedwithpooroutcome[J].HumPathol.2012,43(3):364-73.[7]LingLJ,WangS,LiuXA,etal.Anovelmousemodelofhumanbreastcancerstem-likecellswithhighCD44+CD24-/lowerphenotyp