翟中和第三版 細胞周期調控課件

細胞周期的調控王福寧細胞周期1、細胞周期概述2、細胞周期中不同時期主要事件細胞在分裂之前，必須進行各種必要的物質準備（蛋白質、遺傳物質、中心體等）。細胞分裂過程也是一個十分復雜而又必須精確的生命過程。從一次細胞分裂結束開始，經過物質準備過程，直到下一次細胞分裂結束為止，稱為一個細胞周期（cellcycle）。

1、細胞周期概述細胞周期是指連續(xù)分裂的細胞從一次分裂結束到下一次分裂結束所經歷的整個過程。在這一過程中，細胞遺傳物質復制，然后平均分配到兩個子細胞中。細胞周期中的幾種細胞周期中細胞（cyclingcells）：細胞持續(xù)分裂，細胞周期持續(xù)運轉。如小腸絨毛上皮組織的基底層細胞、干細胞等。G0期細胞：又稱靜止期細胞（quiescentcells）.暫時脫離細胞周期，停止細胞分裂，但在適當刺激下可重新進入細胞周期。如淋巴細胞、肝細胞等。終端分化細胞（terminallydifferentiatedcells）：是指那些不可逆地脫離細胞周期，喪失分裂能力，保持生理機能活動的細胞。分化程度很高，一旦生成，終生不再分裂。如神經細胞、肌肉細胞、紅細胞等。2、細胞周期各個不同時期及其主要事件真核生物DNA復制:多個復制起點成簇活化，向兩個方向以復制叉方式進行生長；半保留復制大多數與DNA合成有關的酶在G1／S交界或早S期升高。S期關鍵事件G2期關鍵事件：主要與細胞進入M期所需的多種結構與功能的準備有關。G2/M期檢驗點檢查DNA是否完成復制、細胞是否生長到合適大小，環(huán)境因素是否利于細胞分裂等。核糖體的存在與數目對于完成G2期和進入有絲分裂的進程也是起重要作用的。細胞周期調控分子活化，使細胞由G2期進入M期。細胞周期中的各個時相及其事件的運行和整個細胞周期的運轉，都是在CDK激酶的統(tǒng)一調控下進行的細胞周期的調控1、MPF的發(fā)現及其作用

2、p34cdc2激酶的發(fā)現及其與MPF的關系

3、周期蛋白

4、Cdk激酶

5、細胞周期運轉調控

6、其他內在和外在因素在細胞周期調控中的作用細胞周期的準確調控對生物的生存、繁殖、發(fā)育和遺傳均是十分重要的。簡單生物調控細胞周期主要是為了適應自然環(huán)境，以便根據環(huán)境狀況調節(jié)繁殖速度，以保證物種的繁衍。復雜生物的細胞則需面對來自自然環(huán)境和其他細胞、組織的信號，作出正確的應答，以保證組織、器官和個體的形成、生長以及創(chuàng)傷愈合等過程能正常進行，需要更為精細的細胞周期調控機制。

1、MPF的發(fā)現及其作用:MPF,即卵細胞促成熟因子(maturation-promotingfactor),或細胞促分裂因子(mitosis-promotingfactor),或M期促進因子(Mphase-promotingfactor).背景一:Rao和Johnson(1970、1972、1974)將Hela細胞同步于細胞周期不同階段，然后與M期細胞在滅活仙臺病毒介導下誘導細胞融合，發(fā)現與M期細胞融合的間期細胞產生了形態(tài)各異的染色體凝集,稱之為染色體超前凝集(prematurelycondensedchromosome，PCC)。如圖所示:G1期PCC為單線狀S期PCC為粉末狀G2期PCC為雙線染色體

PCC的形態(tài)變化可能和DNA的復制狀態(tài)有關

M期細胞可以誘導PCC，提示在M期細胞中可能存在一種誘導染色體凝集的因子，稱為細胞促成熟因子。背景二：1971年,Masui和Markert用非洲爪

蟾做實驗，明確提出了MPF這一概念。非洲爪蟾卵細胞發(fā)育過程分為六個階段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期。前四個時期為卵母細胞生成和生長階段。其中第Ⅳ期時細胞核較大，稱為生發(fā)泡(germinalvesicle,GV),此時細胞就停留在該時期，等待成熟。卵母細胞成熟需要雌性激素孕酮的刺激，在孕酮的作用下卵母細胞向Ⅴ和Ⅵ期轉化，生發(fā)泡破裂，染色質凝聚，開始進行減數分裂。分離第Ⅵ期卵母細胞，并用孕酮進行體外刺激，誘導卵母細胞成熟，然后進行細胞質移植實驗。發(fā)現，將孕酮誘導成熟的卵母細胞的細胞質注射到卵母細胞中，可以誘導后者成熟；再將后者的細胞質少量注射到一些新的卵母細胞中，這些新的卵母細胞仍然被誘導成熟；再講剛被誘導成熟的卵母細胞的細胞質少量注射到另一些新的卵母細胞中。仍然可以誘導卵母細胞成熟。分離純化出MPF：直到1988年，Maller實驗室的Lohka等人才以非洲爪蟾為材料，分離得到了微克級的純化的MPF。證明其含有p32和p45兩種蛋白。二者結合后表現出蛋白激酶活性，可以使多種蛋白質底物磷酸化。證明，MPF是一種蛋白激酶。蛋白激酶：催化蛋白質磷酸化反應的酶，能把ATP的磷酸轉移到蛋白質的氨基酸殘基上。2、p34cdc2激酶的發(fā)現及其與MPF的關系：另一批生物學家以酵母為材料,從另一個側面對細胞周期調控進行著深入研究.如:L.Hartwell以芽殖酵母為實驗材料,P.Nurse以裂殖酵母為實驗材料。他們的實驗原理都相同：均是在不同溫度下培養(yǎng)酵母,獲得不同的溫度敏感突變體,這些不同的突變體在限定溫度下，會滯留在細胞周期的某個階段以及表現出不同的形態(tài)結構。酵母中的這些與細胞分裂和周期調控有關的基因被稱為(celldivisioncycle)cdc基因，根據被發(fā)現的先后順序被命名。因為p34cdc2與p34cdc28

都對G2/M轉化過程中起調節(jié)作用。因此得出p34cdc2與p34cdc28是同源物。進一步研究發(fā)現：二者本身并不具有激酶活性，只有當其與有關蛋白結合后，其激酶活性才能夠表現出來。例如：p34cdc2必須與另一種蛋白p56cdc13結合后才具有激酶活性。很快Maller＋Nurse證明：MPF中的p32可以被p34cdc2特異抗體所識別，并且p34cdc2多肽片斷可以加速MPF活性，表明MPF和p34cdc2二者是同源物。在研究酵母的同時，以TimHunt為代表的

另一批科學家正在以海膽卵為材料，對細胞周期調控進行著深入研究。他們發(fā)現：有兩種蛋白質的含量隨細胞周期進程的變化而變化，一般在細胞間期內積累，在細胞分裂期內消失，在下一個周期中又重復這一消長現象。因此稱這兩種蛋白為細胞周期蛋白(cyclin)。并很快被分離和克隆出來，證明其廣泛存在于從酵母到人類等各種真核生物中，而且在功能上存在互補性。Maller＋Hunt合作證明：MPF中的另一種成分是周期蛋白B。序列分析證明，周期蛋白B與酵母的p56cdc13是同源物。由此MPF的生化成分得到確定：

MPF=

p34cdc2

+

cyclinB

（催化亞單位）（調節(jié)亞單位）3、周期蛋白：自1983年首次發(fā)現周期蛋白后，許多科學家紛紛

開展周期蛋白研究，短短10年就從各種生物中克隆分離了數十種周期蛋白，如酵母的Cln1、Cln2、Cln3、Clb1-Clb6，高等動物的周期蛋白A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等等。各種周期蛋白均含有100個左右的保守氨基酸序列，稱為周期蛋白框，它可介導周期蛋白與CDK結合。；M期周期蛋白(A2,B1)分子的N端含有破壞框，其主要參與由泛素介導的周期蛋白A和B的降解；G1期周期蛋白分子的C端含有一個PEST序列。PEST序列被認為與G1期周期蛋白的更新有關。不同周期蛋白的表達時期不同，與不同的CDK結合，調節(jié)不同CDK激酶的活性。部分哺乳動物和酵母細胞周期蛋白在細胞周期中的積累及其與CDK激酶活性的關系。p34cdc2等蛋白含有一段類似的激酶結構域，都可以與周期蛋白結合，并將周期蛋白作為其調節(jié)亞單位，進而表現出蛋白激酶活性，因而它們統(tǒng)稱為周期蛋白依賴性蛋白激酶（Cdk）。Cdk家族成員包括Cdk1(又稱p34cdc2，或Cdc2)、Cdk2、Cdk3、Cdk4、Cdk5、Cdk6、Cdk7、Cdk8等。每種Cdk結合不同類型的周期蛋白，在細胞周期中執(zhí)行的調節(jié)功能也不同。各種Cdk-cyclin復合物協(xié)調配合，調節(jié)細胞周期進程。4、Cdk激酶Cdk激酶抑制蛋白Cdk激酶抑制蛋白（Cdkinhibitor，CKI）對Cdk激酶活性起負性調控，分為CIP/KIP家族和INK4家族兩類。（1）Cip/Kip包括P21cip1、P27kip1、P57kip2等，能與多種cyclin-CDK復合物包括cyclinE–CDK2、cyclinD–CDK6、cyclinD–CDK4結合，抑制cyclin-CDK復合物的蛋白激酶活性，使一些細胞增殖所需要的蛋白質磷酸化受阻，細胞停留在G1期。

（2）Ink4家族如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，專一地與CDK4、CDK6結合，阻止CDK和cyclinD的結合。使細胞周期不能從G1期的調控點進入到下一個時相。5、細胞周期運轉調控（1）G2期/M期轉換與CDK1激酶的關鍵性調控作用（2）M期周期蛋白與分裂中期向后期轉換的調控（3）G1期/S期轉換與G1期周期蛋白依賴性CDK激酶（1）G2期/M期轉換與CDK1激酶的關鍵性調控作用

Cdk1在細胞周期中含量相對穩(wěn)定，而cyclinB含量呈周期性變化。Cdk1只有與cyclinB結合后才可能表現出激酶活性。cyclinB一般在G1晚期開始合成，通過S期，含量不斷增加，到達G2期，含量達到最高。隨著cyclinB含量達到一定程度，Cdk1激酶活性開始出現，到G2晚期，其活性達到最高并維持到M期的中期階段。然后，隨著cyclinB的降解，Cdk1活性喪失。Cdk1激酶活性的調控Cdk1與cyclinA/B形成復合體后，Wee1和CAK（Cdk1-activatingkinase）催化Cdk1上Thr14、Tyr15和Thr161的磷酸化。此時的Cdk1無激酶活性。然后，Cdk1在磷酸酶（phosphatase）Cdc25c的催化下，Thr14和Tyr15去磷酸化，才表現出激酶活性。（2）M期周期蛋白與分裂中期向后期轉

換的調控細胞周期運轉到中期后，cyclinA和B迅速降解，Cdk1激酶活性喪失，被Cdk1磷酸化的蛋白去磷酸化，細胞周期便從中期向后期轉化。cyclinA和B的降解是通過泛素化途徑來實現的。后期促進復合體（anaphase-promotingcomplex,APC）又稱cyclosome，是一個具有泛素連接酶E3活性的蛋白質復合體，調控M期的中期向后期的轉化。APC可以催化cyclinA和B的泛素化，使得它們降解，從而使Cdk1喪失活性。APC可以催化后期抑制因子securin（在裂殖酵母中為Cut2，在芽殖酵母中為Pds1）的泛素化，使得securin降解，解除其對姐妹染色單體分離的抑制。Cdc20為APC的正調控因子，通過與APC結合，使APC具有泛素連接酶活性，因此是姐妹染色單體分離所必需的蛋白。后期促進復合體（APC）（3）G1期/S期轉換與G1期周期蛋白依賴性CDK激酶G1/S期轉化主要受G1期周期蛋白依賴性CDK激酶控制。周期蛋白包括：D(D1,D2,D3表達有組織、細胞特異性)、E、及A，激酶包括CDK2CDK4,CDK6等。

其中D與CDK4,CDK6結合；

E，A與CDK2結合。復制起始點識別復合體識別DNA復制起點并與之結合，是DNA復制起始所必需的。Cdc6和Cdc45也是DNA復制所必需的調控因子。Cdc6在早G1期與染色質結合，到早S期游離下來。Cdc45在晚G1期才與染色質結合。細胞質內存在一種執(zhí)照因子，對細胞核染色質DNA復制發(fā)行執(zhí)照。在M期，核膜裂解，執(zhí)照因子與染色質結合，使后者DNA獲得執(zhí)照，通過G1期進入S期后進行復制。隨著復制進行，執(zhí)照信號不斷減弱直到消失。到G2期時，細胞核不再有執(zhí)照信號，DNA復制結束并不再起始。Mcm家族蛋白和Orc、cdc6、cdt1是DNA復制執(zhí)照因子的主要成分，共同結合在復制起點上，形成前DNA復制復合體。DNA復制起始的調控Orc：復制起始點識別復合體，其含有六個亞基Orc1--6.Orc能夠識別DNA復制起始位點，并與之結合。當Orc與DNA復制起始點結合后，Cdc6和Cdt1被募集到該起點上。Cdc6必須事先與ATP分子結合，一旦cdc6結合到Orc上，通過Cdc6的ATP酶活性，改變orc的構型，并與Cdt1一起，共同促進Mcm蛋白復合體結合到DNA復制起始位點上，形成前DNA復制復合體，DNA的復