薄層鑒別(8.3)課件

薄層色譜天津市藥品檢驗(yàn)所周軍廣泛適用性

薄層色譜最常用的是以硅膠板為基礎(chǔ)固定相的正相色譜，最適合中等極性成分的展開；有多種組合的有機(jī)溶劑展開系統(tǒng)可供選擇；甲苯系統(tǒng)；氯仿系統(tǒng)、己烷系統(tǒng)、乙酸乙酯類系統(tǒng)、正丁醇系統(tǒng)等。酸性、堿性、中性。高極性、中等極性、低極性應(yīng)用領(lǐng)域藥品生產(chǎn)、檢驗(yàn)臨床醫(yī)學(xué)環(huán)境監(jiān)測食品生產(chǎn)、檢測化學(xué)、化工課程內(nèi)容薄層色譜基礎(chǔ)知識中藥薄層色譜鑒別中供試品溶液制備的注意事項(xiàng)及方法第一節(jié)薄層色譜基礎(chǔ)知識薄層鑒別的特點(diǎn)：（1）操作方法簡便、快速。（2）在采用隨行對照品及對照藥材的情況下，結(jié)果容易判定。一、薄層色譜的分類（一）根據(jù)薄層色譜所用的吸附劑性質(zhì)和分離樣品的機(jī)理分類1.吸附薄層色譜2.分配薄層色譜3.離子交換薄層色譜4.排阻薄層色譜二.薄層色譜的技術(shù)參數(shù)（一）比移值比移值（Rf）系指溶質(zhì)移動距離與流動相移動距離的比值。

從基線至展開斑點(diǎn)中心的距離

Rf=——————————————

從基線至展開劑前沿的距離（三）理論塔板數(shù)（N）理論塔板數(shù)（N）是反映組分在流動相和固定相中動力學(xué)特性的技術(shù)參數(shù)，是代表分離效能的指標(biāo)。D2N=16〔————〕WD為原點(diǎn)到組分斑點(diǎn)中心的距離（cm），W為組分斑點(diǎn)寬度（cm）。在斑點(diǎn)移動距離相等的情況下，斑點(diǎn)越集中，即W寬度越小，理論塔板數(shù)就越大。三、常規(guī)薄層色譜法（一）薄層板（二）點(diǎn)樣（三）展開（四）顯色與檢視（一）薄層板1、市售薄層板市售薄層板分普通薄層板和高效薄層板。臨用前一般應(yīng)在110℃活化30分鐘。聚酰胺薄膜不需活化。鋁基薄層板可根據(jù)需要剪裁，但須注意剪裁后的薄層板底邊的硅膠層不得有破損。優(yōu)點(diǎn)－使用方便；分離效果較好。缺點(diǎn)－價(jià)格較貴；不同廠家生產(chǎn)的薄層板，對某些成分有選擇性。不同廠家生產(chǎn)的薄層板分離效果不同

青島板煙臺板

2、自制薄層板一般將1份固定相和3份水（或加有黏合劑的酸、堿、鹽水溶液）在研缽中按同一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板涂布，取下涂好薄層的玻板，室溫下晾干后，在105～110℃烘箱中加熱活化1～2小時(shí)，取出，保存于干燥器中備用。優(yōu)點(diǎn)－價(jià)格便宜，使用方便，展開速度快，使用于一般薄層鑒別試驗(yàn)。缺點(diǎn)－因硅膠粒度較粗，分離效果不如預(yù)制板；手工點(diǎn)樣時(shí)，尤其點(diǎn)樣量教大時(shí)，會損壞點(diǎn)樣部位的薄層表面；使用羧甲基纖維素鈉為黏合劑，當(dāng)以硫酸乙醇為顯色劑，加熱時(shí)間稍長，薄層板會變黑，無法檢視。（二）點(diǎn)樣薄層點(diǎn)樣分為手工點(diǎn)樣和點(diǎn)樣器自動點(diǎn)樣。手工點(diǎn)樣簡單、快捷，但展開效果與實(shí)驗(yàn)者的熟練程度有較大的關(guān)系；自動點(diǎn)樣斑點(diǎn)均勻、大小一致、展開后效果較好，但儀器價(jià)格昂貴。一般為圓點(diǎn)狀或窄細(xì)的條帶狀，點(diǎn)樣基線距底邊10~15mm，直徑一般不大于3mm，條帶狀寬度一般為5~10mm。點(diǎn)樣量一般應(yīng)控制在6ul以下，否則樣品斑點(diǎn)擴(kuò)散，影響分離；樣品量較低時(shí)，點(diǎn)樣量可最大增加至20ul。當(dāng)使用高沸點(diǎn)溶劑如正丁醇時(shí)，點(diǎn)樣后應(yīng)將溶劑充分晾干，必要時(shí)可用電吹風(fēng)吹干。點(diǎn)樣量不同對分離的影響4μl6μl8μl0.1μl0.2μl0.3μl1μl鹽酸小檗堿氨蒸氣飽和（四）.顯色與檢視1、顯色裝置噴霧顯色應(yīng)使用玻璃噴霧瓶或?qū)Ｓ脟婌F器，要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻細(xì)霧狀噴出，浸漬顯色可用專用玻璃器械或用適宜的展開缸代用。2、常用顯色劑5%三氯化鋁乙醇、10％硫酸乙醇、5％三氯化鐵乙醇、10％磷鉬酸乙醇、稀碘化鉍鉀試液，蒸氣熏蒸等。3、檢視裝置為裝有可見光、254nm及365nm紫外光光源及相應(yīng)的濾光片的暗箱。四.薄層色譜在藥物分析中的應(yīng)用（一）.鑒別

（二）.限度檢查（三）.含量測定（一）.鑒別取適宜濃度的對照溶液與供試品溶液，在同一薄層板上點(diǎn)樣、展開與檢視，供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色（或熒光）和位置應(yīng)與對照溶液的斑點(diǎn)一致。（二）.限度檢查1、采用定量配制的對照品或稀釋對照品進(jìn)行對照。供試品溶液色譜中待檢查的斑點(diǎn)應(yīng)與相應(yīng)的對照品溶液或系列對照品溶液的相應(yīng)斑點(diǎn)比較，顏色（或熒光）不得更深。2、檢測靈敏度用于限量檢查時(shí)，采用供試品溶液和對照品溶液與稀釋若干倍的對照品溶液在規(guī)定的色譜條件下，于同一薄層板上點(diǎn)樣、展開、檢視，后者應(yīng)顯清晰的斑點(diǎn)。

五、薄層色譜耐用性實(shí)驗(yàn)1、三種不同廠家生產(chǎn)的薄層板的影響2、溫度和濕度的影響（1）常溫、常濕條件下進(jìn)行試驗(yàn)（2）低溫條件下進(jìn)行試驗(yàn)（3）高濕條件下進(jìn)行試驗(yàn)溫度對層析行為的最明顯的影響是分離度和Rf值。經(jīng)常遇到的一種情況是同樣的試驗(yàn)需要在夏天做，又須在冬天做，或者在南方和北方的試驗(yàn)室重復(fù)試驗(yàn)，這就遇到溫度不同造成的影響，而使結(jié)果不易重現(xiàn)。最基本的要求是在薄層色譜記錄中同時(shí)記錄試驗(yàn)時(shí)的溫度和相對濕度。第二節(jié)中藥薄層色譜鑒別中供試品溶液制備的注意事項(xiàng)及方法在檢驗(yàn)中藥真?zhèn)畏矫嫱ǔ２捎玫臋z測手段有形態(tài)鑒別、理化鑒別和光譜色譜分析等。而薄層色譜由于其獨(dú)具的長處而被廣泛應(yīng)用于中藥分析。1個(gè)薄層鑒別----110個(gè)品種4個(gè)薄層鑒別----49個(gè)品種5個(gè)薄層鑒別----7個(gè)品種6個(gè)薄層鑒別----5個(gè)品種3個(gè)薄層鑒別----134個(gè)品種2個(gè)薄層鑒別----182個(gè)品種《中國藥典》2005年版一部中的鑒別方法主要為薄層鑒別，其中：一、影響薄層色譜展開效果的主要因素供試品溶液制備點(diǎn)樣薄層板展開劑溫度濕度顯色二、對供試品溶液制備進(jìn)行分析和討論由于中藥成分的復(fù)雜，未知成分多，供試品溶液中含有的物質(zhì)較多，其中有被測定成分，同時(shí)也有其他“雜質(zhì)”成分，因此常常由于相互干擾或背景污染而難以得到滿意的分離效果，有時(shí)甚至難以辨認(rèn)，對復(fù)方制劑尤其如此。所以為了充分發(fā)揮薄層色譜技術(shù)在中藥分析方面的優(yōu)勢，提高色譜的分離度和重現(xiàn)性，供試品溶液的制備（凈化），是一個(gè)非常重要甚至是關(guān)鍵的步驟。三、常用的供試品凈化方法我們常常希望樣品中的成分盡可能多的被提取出來，所以最常用的試劑是甲醇或乙醇，導(dǎo)致被測成分和許多其他“雜質(zhì)”成分均被提取出來，因此供試品的凈化就更為必要。凈化方法單一溶劑提取法

不同極性的溶劑分步提取法

柱色譜法

升華法

酸性、堿性有機(jī)溶劑提取。如利用生物堿類成分在堿性條件呈游離狀態(tài)，用三氯甲烷或乙醚將其有選擇的提取出來而舍棄其他成分，使供試品溶液凈化?？梢砸来斡貌煌瑯O性的溶劑，如石油醚→乙醚→三氯甲烷→乙酸乙酯→正丁醇進(jìn)行提取，對供試品進(jìn)行分離、純化。常用的吸附劑有大孔樹脂、氧化鋁、硅膠、聚酰胺等，根據(jù)供試品的特點(diǎn)選擇不同的吸附劑。對含有揮發(fā)性成分的供試品，可采用華法。

對成分復(fù)雜的供試品，有時(shí)可同時(shí)采用2～3種凈化方法對供試品進(jìn)行處理。四、復(fù)雜成分供試品凈化的注意事項(xiàng)1.采用沒有毒性或毒性較小的試劑作為提取溶劑和展開劑，減少對試驗(yàn)人員和環(huán)境的污染。2.專屬、科學(xué)、經(jīng)濟(jì)的原則。3.利用各種被測成分的理化性質(zhì)不同，采用不同的提取方法。4.對多個(gè)中藥材逐一進(jìn)行薄層鑒別時(shí)，某個(gè)薄層的供試品溶液中除含有被測定成分，同時(shí)也有大量其他“雜質(zhì)”成分。但這些“雜質(zhì)”成分常常同時(shí)又是其他薄層中的被測定成分。5.制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)對列為薄層鑒別目標(biāo)的各味藥材進(jìn)行整體分析，根據(jù)各個(gè)藥材中的特征性成分的理化性質(zhì)、含量高低，決定提取的方法、步驟。五、處方中藥材所含成分檢索

與提取方案設(shè)計(jì)

1、試驗(yàn)方法應(yīng)首選《中國藥典》的方法；其次應(yīng)參考文獻(xiàn)資料，確定預(yù)試方案；如沒有文獻(xiàn)報(bào)道．應(yīng)查詢組方藥材所含化學(xué)成分，根據(jù)其特點(diǎn)，決定提取步驟。

2、應(yīng)同時(shí)采用對照品和對照藥材為對照物。

3、選用對照藥材是經(jīng)濟(jì)與合理的選擇。4、應(yīng)結(jié)合提取工藝制定相應(yīng)的提取方法。丹參化學(xué)成分成分檢索與方案設(shè)計(jì)按組方所含藥材成分，查詢文獻(xiàn)或根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，擬定初試方法。

按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，觀察、記錄，并初步判定薄層鑒別方法的可行性。在復(fù)方制劑研究預(yù)試驗(yàn)中，在同一種展開系統(tǒng)中應(yīng)將對照品、對照藥材都點(diǎn)在同一塊薄層板上。觀察試驗(yàn)結(jié)果，為進(jìn)一步試驗(yàn)提供更多的薄層色譜信息。方案設(shè)計(jì)

試驗(yàn)預(yù)試

六、實(shí)例-1艾附暖宮丸

白芍—芍藥苷黃芪—黃芪甲苷

（4）取本品9g，剪碎，加水5ml浸潤，加水飽和的正丁醇30ml，搖勻，超聲處理10分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?ml使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品-------六、實(shí)例-1艾附暖宮丸

（5）取本品9g，剪碎，加水5ml浸潤，加水飽和的正丁醇30ml，搖勻，超聲處理10分鐘，濾過，濾液用氨試液洗滌2次，每次30ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品------六、實(shí)例-2白帶丸白芍—芍藥苷黃柏—鹽酸小檗堿六、實(shí)例-2白帶丸

（2）取本品5g，研細(xì)，加乙醇10ml,冷浸1小時(shí)，時(shí)時(shí)振搖，濾過，濾液濃縮至干，殘?jiān)右掖?.5ml使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品-----六、實(shí)例-2白帶丸

（3）取本品粉末2g，研細(xì)，加甲醇5ml,超聲處理10分鐘，濾過，濾液加甲醇至5ml，作為供試品溶液。另取黃柏對照藥材0.1g，同法制成對照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿對照品-------六、實(shí)例-3青果丸綠原酸芍藥苷黃芩苷六、實(shí)例-3青果丸

（2）取本品水蜜丸60丸，研碎；或取大蜜丸1丸,煎碎。加甲醇40ml，超聲處理40分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0ml使溶解，通過D<[101]>型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑2cm,柱長15cm），用水50ml洗脫，棄去水洗液，再用20％乙醇50ml、40％乙醇40ml依次洗脫，分別收集洗脫液，將20％乙醇洗脫液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取綠原酸對照品-------六、實(shí)例-3青果丸（3）取[鑒別](2)項(xiàng)下的40％乙醇洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液------六、實(shí)例-3青果丸

（4）取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取對照品溶液及[鑒別](3)項(xiàng)下的供試品溶液--------。六、實(shí)例-4周氏回生丸

（1）取本品適量，研細(xì)，取10g，加50％甲醇60ml，超聲處理30分鐘，離心，取上清液，加石油醚（60～90℃）提取2次，每次20ml,合并石油醚液，揮干，殘?jiān)右宜嵋阴?ml溶解，加入二硝基苯肼乙醇試驗(yàn)1ml，40℃溫浸30分鐘，放冷，作為供試品溶液。另取麝香酮對照品，加乙酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液，取1ml乙酸乙酯液，加入二硝基苯肼乙醇試驗(yàn)1ml，同法制成對照品溶液。六、實(shí)例-4周氏回生丸

（2）取木香對照藥材0.25g，加乙醚20ml，超聲處理10分鐘，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴?ml使溶解，作為對照藥材溶液。取〔鑒別〕2項(xiàng)下的供試品溶液4～10μl及上述對照藥材2～4μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上六、實(shí)例-4周氏回生丸

（3）取〔鑒別〕2項(xiàng)下石油醚提取后的50％甲醇溶液，蒸干，殘?jiān)铀?5ml溶解，用乙酸乙酯提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?ml溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材0.5g，加50％甲醇溶液25ml，超聲處理30分鐘，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5ml溶解，同法制成對照藥材溶液。濟(jì)坤丸薄層鑒別木香→牡丹皮→厚樸→丹參→延胡索→白芍→龍膽六、實(shí)例-5濟(jì)坤丸

1、木香的鑒別：分別取本品2丸及陰性樣品，加硅藻土6g，研勻，各加石油醚（30～60℃）50ml，超聲處理30min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴?ml使溶解，作為供試品溶液及陰性溶液。另取木香對照藥材0.5g，同法制成對照藥材溶液。

六、實(shí)例-5濟(jì)坤丸從左至右樣品（批號：05001）樣品（批號：05002）樣品（批號：05003）對照藥材（中檢所）陰性樣品溶液圖（1）木香薄層色譜圖

六、實(shí)例-5濟(jì)坤丸

2、牡丹皮及厚樸的鑒別：取〔鑒別〕1項(xiàng)下的供試品溶液，作為供試品溶液。另取丹皮酚對照品適量，加乙酸乙酯制成2mg/ml的對照品溶液；再取厚樸酚及和厚樸酚對照品適量，加乙酸乙酯制成每1ml中各含0.5mg的對照品溶液。結(jié)果見圖（2）及圖（3）。

六、實(shí)例-5濟(jì)坤丸圖（2）厚樸酚及和厚樸酚色譜圖圖（3）牡丹皮薄層色譜圖從左至右從左至右樣品（批號：01）樣品（批號：01）樣品（批號：02）樣品（批號：02）樣品（批號：03）樣品（批號：03）厚樸酚及和厚樸酚對照藥材（中檢所）丹皮酚對照藥材（中檢所）陰性樣品溶液陰性樣品溶液六、實(shí)例-5濟(jì)坤丸

3、丹參的鑒別：取〔鑒別〕1項(xiàng)下的藥渣及陰性樣品，加乙醇50ml，超聲處理30min，濾過，濾液置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)?％醋酸25ml使溶解，加乙醚提取兩次（先用乙醚溶解蒸發(fā)皿中的水不溶物），每次15ml，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?ml使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對照藥材0.5g，加乙醇20ml，同法制成對照藥材溶液。結(jié)果見圖（4）。六、實(shí)例-5濟(jì)坤丸從左至右樣品（批號：05001）樣品（批號：05002）樣品（批號：05003）丹參對照藥材（中檢所）陰性樣品溶液圖（4）丹參薄層色譜圖

六、實(shí)例-5濟(jì)坤丸

4、延胡索的鑒別：取〔鑒別〕3項(xiàng)下的水溶液及陰性樣品，用氨水調(diào)pH值至9～10，加乙醚提取兩次，每次15ml，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)右掖?ml使溶解，作為供試品溶液。另取延胡索乙素對照品適量，加乙醇制成0.4mg/ml的對照品溶液。結(jié)果見圖（5）。六