臨床微生物學和微生物學檢驗

抗菌藥物敏感性試驗

南華大學預防醫(yī)學與放射衛(wèi)生實驗教學中心教學對象：高等醫(yī)學院校衛(wèi)生檢驗專業(yè)學生實驗課時：4學時課程類型：專業(yè)實驗課課程要求：必修每組人數：2人實驗目的和要求掌握紙片擴散法（K－B法）的原理、操作方法等、結果判斷、意義及質量控制；熟悉肉湯稀釋法抗生素敏感性試驗的原理、操作方法、結果判斷及意義等；了解稀釋法的質量控制。實驗內容常用抗菌藥物敏感性試驗與耐藥檢測方法介紹。紙片擴散法。肉湯稀釋法。

一、常用抗菌藥物敏感性試驗與耐藥檢測方法介紹紙片擴散法（Kirby-Bauertest）稀釋法（dilutiontest）E試驗法（Etest）聯合藥物敏感試驗特殊耐藥菌及耐藥酶的表型檢測耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的檢測β-內酰胺酶、超廣譜β-內酰胺酶檢測等二、紙片擴散法（K-B法）

原理：含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷向紙片周圍區(qū)域擴散，形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內的細菌生長被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑制濃度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）呈負相關，即抑菌圈愈大，MIC愈小。抑菌圈

含藥紙片

方法：菌液制備：挑取孵育16-24h的血平板上數個菌落置于生理鹽水管中，校正濃度至0.5麥氏標準；涂布接種：無菌棉拭蘸取菌液，在試管壁旋轉擠去多余菌液后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉平板60o，最后沿平板內緣涂抹1周；貼含藥紙片：平板在室溫下干燥3-5min，用無菌鑷子將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心相距應大于24mm，紙片距平板內緣應大于15mm；孵育：35oC16-18h，量取抑菌圈直徑。結果判讀：用刻度尺量取抑菌圈直徑，根據CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）標準判讀結果；報告：細菌對該抗生素是敏感（susceptible，S）；耐藥（resistant，R）；還是中介（intermediate，I）。表1金金黃黃色色葡葡萄萄球球菌菌抗抗菌菌藥藥物物敏敏感感性性試試驗驗評評價價結結果果抗菌藥物紙片含藥量抑菌圈直徑(mm)相應MIC值(μg/ml)耐藥中介敏感耐藥敏感青霉素10U≤28—≥29β-內酰胺酶≤0.12苯唑西林1μg≤1011～12≥13≥4≤2萬古霉素30μg——≥15—≤4慶大霉素10μg≤1213～14≥15≥8≤4紅霉素15μg≤1314～22≥23≥8≤0.5克林霉素2μg≤1415～20≥21≥4≤0.5磺胺藥1.25/23.75μg≤1011～15≥16≥8/152≤2/38三、、肉肉湯湯稀稀釋釋法法原理理：：以水水解解酪酪蛋蛋白白（（MH））液液體體培培養(yǎng)養(yǎng)基基將將抗抗生生素素做做不不同同濃濃度度的的稀稀釋釋，，然然后后種種入入待待檢檢細細菌菌，，定定量量測測定定抗抗菌菌藥藥物物對對被被測測菌菌的的最最低低抑抑菌菌濃濃度度（（MIC））或或最最低低殺殺菌菌濃濃度度（（MBC））。。方法法：：試管管編編號號：取取26只只試試管管排排成成兩兩排排（（測測試試菌菌排排，，質質控控菌菌排排））每每排排13支支編編號號。。另另取取3支支試試管管，，分分別別標標記記上上““肉肉湯湯對對照照””、、““測測試試菌菌生生長長對對照照””和和““質質控控菌菌生生長長對對照照””等等對對照照。?？咕幩幬镂锵∠♂屷專河糜肕H肉肉湯湯倍倍比比稀稀釋釋抗抗菌菌藥藥物物至至13管管，，稀稀釋釋后后使使每每管管含含抗抗菌菌藥藥物物稀稀釋釋液液2ml。。肉湯對對照、、測試試菌生生長對對照、、質控控菌生生長對對照管管：分分別加加入MH肉肉湯2ml。方法：：菌液制制備：生理理鹽水水校正正測試試菌和和質控控菌至至0.5麥麥氏比比濁標標準，，再用用MH肉湯湯稀釋釋到107CFU/ml；；加菌液液：用微微量加加樣器器取0.1ml稀釋釋菌液液由低低到高高加于于各排排試管管中，，其最最終的的接種種量為為5××105CFU/ml。。測試試菌排排、測測試菌菌生長長對照照管加加測試試菌液液；質質控菌菌排、、質控控菌生生長對對照管管加質質控菌菌液。。孵育：35ooC24h觀觀察結結果。。結果：：測試菌菌（或或質控控菌））不出出現肉肉眼可可見生生長的的最低低藥物物濃度度為該該藥對對測試試菌（（質控控菌））的MIC。注意事事項：：培養(yǎng)基基、接接種細細菌的的菌量量、抗抗菌藥藥物紙紙片的的質量量、孵孵育溫溫度和和觀察察時間間、操操作是是否規(guī)規(guī)范等等均能能影響響本試試驗的的結果果。為保證證結果果的可可靠性性，需需同時時采用用相應應標準準菌株株同時時進行行藥敏敏試驗驗作為為質量量控制制的方方式。。