8細胞凋亡與疾病4課件

細胞凋亡與疾病

ApoptosisandDisease細胞凋亡與疾病Apoptosis1第一節(jié)概述第二節(jié)細胞凋亡過程與調(diào)控第三節(jié)細胞凋亡的發(fā)生機制第四節(jié)細胞凋亡與疾病第五節(jié)細胞凋亡在疾病防治中的意義第六節(jié)細胞凋亡的檢測

第一節(jié)概述2第一節(jié)概述

一、發(fā)展研究史1972年病理學家Kerr等首先提出細胞凋亡(apoptosis)的概念，引起人們對這一生物學現(xiàn)象的興趣。尤其是wyllie等1980年揭示了細胞凋亡獨特的生物學特征，即180-200bP單體或寡聚核小體DNA片段，電泳譜為典型的“梯形帶”(ladderpattern)，使其倍受世人關(guān)注。第一節(jié)概述一、發(fā)展研究史3

近二十年來，特別是90年代初細胞凋亡已成為生物學和生物醫(yī)學的研究熱點，其研究論文在世界各種學術(shù)雜志上發(fā)表數(shù)量呈指數(shù)級增長。1994年美國著名《科學》雜志主編Cubtta和Koshland將細胞凋亡評為當年世界生命科學中僅次于DNA修復酶的第二個研究熱點。經(jīng)過無數(shù)研究證明細胞凋亡是一種具有特征形態(tài)和生化改變的過程，是一系列基因活動引起的級聯(lián)反應的結(jié)果。有利它性，使周圍的細胞生長得更好，或是發(fā)育過程或是免疫功能的需要。

4細胞凋亡學說的建立是20世紀生物醫(yī)學科學發(fā)展史上的里程碑。目前已經(jīng)能夠從分子水平了解調(diào)控細胞凋亡的分子和其形態(tài)變化的一些分子基礎(chǔ)。當細胞的聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)、Lamin—1、核DNA和拓撲異構(gòu)酶、-fodrin和-肌動蛋白等分子被降解，使不同類型細胞的凋亡產(chǎn)生相似的形態(tài)特征。如Lamin、拓撲異構(gòu)酶的降解使染色質(zhì)失去核內(nèi)的附著，變?yōu)闈饪s；核酸內(nèi)切酶的被激活而切斷DNA，使核小體之間發(fā)生斷裂，在電泳下呈現(xiàn)階梯狀特點，-fodrin、-actin被降解，使細胞膜和細胞骨架受到影響；凋亡的細胞形成多個凋亡小體。說明細胞死亡也像細胞的生存一樣是受分子調(diào)控的，在進化中也是保守的。細胞凋亡學說的建立是20世紀生物醫(yī)學科學發(fā)展5

現(xiàn)在認為，細胞凋亡在有機體的正常發(fā)生、組織重建、老化和應答不可恢復的損害中具有重要意義；細胞凋亡的失控，可能成為腫瘤、神經(jīng)退化性疾病及免疫缺陷等多種疾病的病因。細胞凋亡研究中的重要事件l972年Kerr、Wyllie、Currie首次提出細胞凋亡這一劃時代的生物學概念。1980年Wyllie發(fā)現(xiàn)核酸內(nèi)切酶激活引起凋亡細胞DNA特異性梯形帶的形成，提醒世人細胞凋亡的重要性，并重新點燃和激起世界范圍內(nèi)對細胞凋亡研究的熱潮?，F(xiàn)在認為，細胞凋亡在有機體的正常發(fā)生、組織重建、老化61993年底發(fā)現(xiàn)ICE家族在細胞凋亡發(fā)生中的作用。caspases蛋白酶在細胞凋亡中的作用（1996）Bcl-2家族及其作用。Fas(Apo-l，CD95)死亡受體家族的發(fā)現(xiàn)。細胞凋亡信號傳導系統(tǒng)的基本框架及組成。許多疾病與細胞凋亡的基本關(guān)系。（1995）近年來，逐漸認識到細胞凋亡有其特殊的生物學意義，引起了發(fā)育生物學、細胞生物學、免疫學、神經(jīng)生物學、分子生物學、腫瘤學和研究工作者的廣泛興趣，形成了一個新的研究熱點。1993年底發(fā)現(xiàn)ICE家族在細胞凋亡發(fā)生中的作用。7

二、與細胞凋亡有關(guān)的基本概念細胞凋亡在臨床疾病的發(fā)生與發(fā)展中的作用，愈來愈受到人們所關(guān)注。近代概念認為：

由體內(nèi)外因素觸發(fā)細胞內(nèi)預存的死亡程序而導致的細胞死亡過程稱為細胞凋亡(apoptosis)

。

生理條件下，細胞死亡是機體對衰老或畸變或其他任何一種不需要的細胞(如炎性細胞、過度增殖的細胞等)的清除方式；但在某些病理生理條件下發(fā)生的細胞凋亡，則可能引起器官或組織的損傷，即引起臨床疾病。二、與細胞凋亡有關(guān)的基本概念8

（一）細胞凋亡與程序性細胞死亡細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下,遵循自身的程序，自己結(jié)束生命的過程，最后細胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，被其他細胞吞噬.?，F(xiàn)在很多情況下，細胞凋亡亦稱為程序性細胞死亡(programmedcelldeath,PCD)。PCD這一概念已為科學家廣泛接受。但不同的人對PCD概念的解釋有所不同。一般而言，細胞凋亡是一個形態(tài)學的概念，是對細胞凋亡時所見到的固定形式的形態(tài)學描述，而PCD是功能上的概念。PCD是發(fā)生于生長發(fā)育過程中的生理性細胞死亡，而細胞凋亡則是PCD的最常見、研究最多的方式。（一）細胞凋亡與程序性細胞死亡9

(二)細胞凋亡與有絲分裂(mitosis)

與有絲分裂的細胞增殖活動相比，細胞發(fā)生凋亡時，像秋天的樹葉或花的自然凋落(fallingoff)一樣，這種生物學現(xiàn)象，借用希臘詞“apoptosis”來表示，意思是秋天的樹葉或花的自然凋落，譯為“細胞凋落”.

有絲分裂:細胞的分裂與分化，其與機體的生長發(fā)育密切相關(guān)。

細胞凋亡:由細胞內(nèi)某些特定基因所決定，具有特殊的生物學意義，是一種細胞的主動死亡過程。

二者雖互為對立，正常情況下，在機體內(nèi)處于動態(tài)平衡，以維持機體細胞數(shù)量的平衡和自身的穩(wěn)定(如蝌蚪青蛙尾巴消失現(xiàn)象)。(二)細胞凋亡與有絲分裂(mitosis)10

（三）細胞凋亡與細胞壞死(necrosis)

是多細胞生物細胞死亡的兩種不同形式，在形態(tài)學、生化代謝、分子機制、結(jié)局和意義等方面都有本質(zhì)的區(qū)別：

細胞凋亡與壞死的比較

壞死凋亡1.性質(zhì)病理性，非特異性生理性或病理性，特異性2.誘導因素強烈刺激，隨機發(fā)生較弱刺激，非隨機發(fā)生3.生化特點被動過程，無新蛋白主動過程，有新蛋白合成，合成，不耗能耗能4.形態(tài)變化細胞結(jié)構(gòu)全面溶解、胞膜及細胞器相對完整破壞細胞腫脹細胞皺縮，核固縮5.DNA電泳彌散性降解，電泳呈DNA片段化(180—200bp)，均一DNA片狀電泳呈“梯”狀條帶6.炎癥反應溶酶體破裂，溶酶體相對完整，局部炎癥反應局部無炎癥反應7.凋亡小體無有8.基因調(diào)控無有（三）細胞凋亡與細胞壞死(necrosis)118細胞凋亡與疾病4課件12三、細胞凋亡的生理和病理意義凋亡作為生理過程，有以下三項作用：

1.確保正常發(fā)育生長機體的發(fā)育、生長過程并不僅僅與細胞的增殖與分化有關(guān)，凋亡在器官組織的形成、成熟過程中也發(fā)揮了重要作用。它可以清除多余的、失去功能價值的細胞。例如：人胚胎肢芽發(fā)育過程中指(趾)間組織，通過細胞凋亡機制而被逐漸消除，形成指(趾)間隙。2.維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定受損、突變或衰老的細胞如果存留體內(nèi)就可能干擾機體功能，甚至演變?yōu)槎喾N疾病(如腫瘤)。維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，機體必須及時將這些細胞清除，清除的主要方式就是凋亡。三、細胞凋亡的生理和病理意義13例如機體通過細胞凋亡：清除針對自身抗原的T淋巴細胞，維持免疫穩(wěn)定。皮膚、粘膜上皮不斷更新：新的C增殖和衰老C凋亡子宮內(nèi)膜的周期性變化：增生激素凋亡、脫落；受損不能修復的細胞、癌前病變細胞的清除。通過細胞凋亡被機體清除的細胞數(shù)量是相當可觀的，每秒鐘可達數(shù)百萬個。3.發(fā)揮積極的防御功能參與了機體的防御反應，例如當機體受到病毒感染時，受感染的細胞發(fā)生凋亡，使DNA發(fā)生降解，整合于其中的病毒DNA也隨之被破壞，因而阻止了病毒的復制。例如機體通過細胞凋亡：14第二節(jié)細胞凋亡過程與調(diào)控

一、細胞凋亡的過程從細胞受到凋亡誘導因素的作用到細胞凋亡大致可分成四個階段：1.凋亡信號轉(zhuǎn)導細胞內(nèi)外的凋亡誘導因素通過各種受體作用于細胞后，細胞產(chǎn)生一系列復雜的生化反應，形成與細胞凋亡有關(guān)的第二信使物質(zhì),如Ca2+,cAMP，神經(jīng)酰胺等，然后通過胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導途徑激活后續(xù)凋亡程序。第二節(jié)細胞凋亡過程與調(diào)控一、細胞凋亡的過程15

2.凋亡基因激活調(diào)控凋亡的基因接收由信號轉(zhuǎn)導途徑傳來的死亡信號后按預定程序啟動，并合成為執(zhí)行凋亡所需的各種酶類及相關(guān)物質(zhì)。3.細胞凋亡的執(zhí)行

主要的執(zhí)行者：核酸內(nèi)切酶(endogenousnuclease，DNase)：徹底破壞細胞生命活動所必須的全部指令

凋亡蛋白酶（Caspases）：導致細胞結(jié)構(gòu)的全面解體2.凋亡基因激活164.凋亡細胞的清除已經(jīng)凋亡的細胞可被鄰近的吞噬細胞或其他細胞所吞噬，分解。上述全過程需時約數(shù)分鐘至數(shù)小時不等。從凋亡信號轉(zhuǎn)導到凋亡執(zhí)行的各個階段都有負調(diào)控因子存在，以形成完整的反饋環(huán)路，使凋亡過程受到精確、嚴密的調(diào)控。凋亡誘導因素+受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺死亡信號凋亡相關(guān)基因激活DNase激活Caspases激活巨噬細胞吞噬分解凋亡細胞細胞凋亡過程4.凋亡細胞的清除凋亡誘導因素+受體17

二、凋亡時細胞的主要變化

1.細胞凋亡的形態(tài)學改變凋亡細胞表面的微絨毛消失，并逐步脫離與周圍細胞的接觸?？梢姷?①空泡化(blebbing)：胞漿脫水，胞膜迅速發(fā)生空泡化。②固縮(condensation)：細胞體積逐漸縮小引起。

二、凋亡時細胞的主要變化18③出芽(buding)：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不斷擴張并與胞膜融合，形成膜表面的芽狀突起。

④染色質(zhì)邊集(margination)：晚期核質(zhì)高度濃縮融合成團，染色質(zhì)集中分布在核膜的邊緣，呈新月形或馬蹄形分布。線粒體和溶酶體的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化不大。⑤凋亡小體(apoptosisbody)：胞膜皺縮內(nèi)陷，分割包裹胞漿，形成泡狀小體，這是凋亡細胞特征性的形態(tài)學改變。（電鏡下見透亮空泡和濃密核碎片）③出芽(buding)：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不斷擴張并與胞19

2.細胞凋亡的生化改變

細胞凋亡過程中DNA的片段化斷裂及蛋白質(zhì)的降解尤為重要。

1)．DNA的片段化

典型的細胞凋亡以細胞核固縮、染色質(zhì)DNA的特征性片段化為主要特征。細胞凋亡發(fā)生時DNA雙鏈的斷裂發(fā)生在核小體連接部，是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活所致。

20DNA鏈上每隔200個核苷酸有1個核小體，當內(nèi)切酶在核小體連接區(qū)切開DNA時，即可形成180—200bp或其整倍數(shù)的片段。這些片段在瓊脂糖凝膠電泳中呈特征性的“梯”狀(ladderpattern)條帶，是判斷凋亡發(fā)生的客觀指標之一。

DNA片段化斷裂是細胞凋亡的關(guān)鍵性結(jié)局。DNA鏈上每隔200個核苷酸有1個核小體，當21

2)．內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用

執(zhí)行染色質(zhì)DNA切割任務的是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶。盡管已有多種核酸內(nèi)切酶存在于細胞核內(nèi)，但細胞內(nèi)外的凋亡誘導因素并不能直接激活該酶，它需要經(jīng)過一系列胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導環(huán)節(jié)方能被激活。

3).凋亡蛋白酶(caspases)的激活及其作用

caspases是一組對底物天冬氨酸部位有特異水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶(caspase是cysteine—containingaspartate—specificprotease的縮寫)。目前已發(fā)現(xiàn)該蛋白酶家族至少有13個成員(caspase1-13)。2)．內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用22

caspase在凋亡中所起的主要作用是：滅活細胞凋亡的抑制物(如Bcl-2)；水解細胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導致細胞解體，形成凋亡小體；在凋亡級聯(lián)反應(cascade)中水解相關(guān)活性蛋白，使該蛋白獲得或喪失某種生物學功能（如caspase-9可使caspase-3酶原水解形成具有分解蛋白質(zhì)活性的caspase-3）?！铩?38細胞凋亡與疾病4課件24

三、細胞凋亡的調(diào)控

(一)細胞凋亡相關(guān)因素誘導性因素和抑制性因素兩大類：

1．誘導性因素

細胞凋亡是一個程序化的過程，這個程序雖已預設于活細胞之中，正常情況下它并不“隨意”啟動，只有當細胞受到來自細胞內(nèi)外的凋亡誘導因素作用的時候，才啟動，使細胞一步步走向死亡，因此凋亡誘導因素是凋亡程序的啟動者。常見誘導因素有：三、細胞凋亡的調(diào)控25

(1)激素和生長因子失衡例如強烈應激引起的淋巴細胞數(shù)量減少，主要由于大量GC分泌，誘導淋巴細胞凋亡所致。

(2)理化因素射線、高溫、強酸、強堿、乙醇、抗癌藥物等，均可導致細胞凋亡。例如：電離輻射可產(chǎn)生大量氧自由基，使細胞處于氧化應激狀態(tài)，DNA受損，引起細胞凋亡。

(3)免疫性因素免疫細胞在生長、分化及執(zhí)行防御、自穩(wěn)、監(jiān)視功能中其免疫分子參與了免疫細胞或靶細胞的凋亡過程，例如：細胞毒T淋巴細胞(CTL)可分泌粒酶，引起靶細胞發(fā)生凋亡。(1)激素和生長因子失衡26

(4)微生物學因素細菌、病毒等致病微生物及其毒素可誘導細胞凋亡。如HIV感染時，可致大量CD+4、淋巴細胞凋亡，這時AIDS病人相關(guān)免疫功能低下，腫瘤及機會性感染增加(主要原因)。

2．抑制性因素

(1)一些細胞因子(IL-2，神經(jīng)生長因子等)有抑制凋亡的作用。當從細胞培養(yǎng)基中去除后，依賴它們的細胞發(fā)生凋亡；反之，在培養(yǎng)體系中加入所需要的細胞因子后，由于促進了細胞內(nèi)存活基因的表達，凋亡受抑制。(4)微生物學因素27

(2)某些激素(ACTH、睪丸酮、雌激素等)對于防止靶細胞凋亡，維持其正常存活是必需的。例如：當腺垂體被摘除或功能低下時，腎上腺皮質(zhì)細胞失去ACTH刺激，發(fā)生細胞凋亡，引起腎上腺皮質(zhì)萎縮。此時，只要給予生理維持量的ACTH即可抑制腎上腺皮質(zhì)細胞的凋亡，防止腎上腺皮質(zhì)的萎縮。

(3)其它:某些二價金屬陽離子如Zn2+，藥物如：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制劑，病毒如：EB病毒，牛痘病毒CrmA等及中性氨基酸也具有抑制細胞凋亡的作用。(2)某些激素(ACTH、睪丸酮、雌激素等)28

(二)細胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導(transduction)多數(shù)情況下來自于細胞外的細胞凋亡誘導因素作用于細胞后可轉(zhuǎn)化為細胞凋亡信號，并通過胞內(nèi)不同的信號轉(zhuǎn)導途徑，激活細胞死亡程序，導致細胞凋亡。因此，凋亡信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)是連接凋亡誘導因素與核DNA片段化斷裂及細胞結(jié)構(gòu)蛋白降解的中間環(huán)節(jié)。這個系統(tǒng)的特點是：

①多樣性：不同種類細胞有不同的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)。

②偶聯(lián)性：即死亡信號的轉(zhuǎn)導系統(tǒng)與細胞增殖、分化過程中的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)在某些環(huán)節(jié)上有交叉、偶聯(lián)；因此同一個信號，在不同條件下既可引起凋亡，也可刺激增殖。(二)細胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導(transductio29

③同一性：不同的凋亡誘因可以通過同一信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)觸發(fā)細胞凋亡。例如：TNF-、電離輻射及Fas抗原等多種凋亡誘導因素均可通過神經(jīng)酰胺信號途徑觸發(fā)細胞凋亡。切斷某一信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)、可能影響多種凋亡誘導因素引起的細胞凋亡。

④多途性：同一凋亡誘導因素可經(jīng)過多條信號轉(zhuǎn)導途徑觸發(fā)凋亡。例如：糖皮質(zhì)激素引起淋巴細胞凋亡可通過神經(jīng)酰胺系統(tǒng)、胞內(nèi)Ca2+信號系統(tǒng)及cAMP／蛋白激酶A(PKA)信號系統(tǒng)轉(zhuǎn)導凋亡信號。這就意味著要完全阻抑某一凋亡誘導因素的作用，就必須同時切斷多條相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導途徑。③同一性：不同的凋亡誘因可以通過同一信號轉(zhuǎn)30

(三)凋亡相關(guān)基因

目前，細胞凋亡相關(guān)基因多達數(shù)十種，根據(jù)功能的不同可將其分為三類：抑制凋亡基因：EIB、IAP、Bcl—2等，其中 對Bcl—2的研究最為詳細而系統(tǒng)促凋亡基因：如：Fas、Bax、ICE、P53等。雙向調(diào)控基因：例如c-myc、Bcl-x。

(三)凋亡相關(guān)基因31

1．Bcl-2（抑制凋亡基因）Bcl-2是B 細胞淋巴瘤／白血病-2(Bcelllymphoma／leukemia-2，Bcl-2)基因的縮寫形式，是第一個被確認有抑制凋亡作用的基因。人的Bcl-2蛋白由229個氨基酸組成，小鼠為236。

目前認為：Bcl-2抗凋亡的主要機制是：★①直接抗氧化；②抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì)，如：細胞色素C，凋亡誘導因子(AIF)；③抑制促凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bax、Bak細胞毒作用④抑制caspases的激活；⑤維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)。1．Bcl-2（抑制凋亡基因）32

2．Fas（促進凋亡基因）Fas是一種細胞表面受體，是一種跨膜蛋白。伸向胞漿的部分有一段與TNF受體相似，與TNF受體和NGF(神經(jīng)生長因子)受體高度同源，在多種組織細胞中存在。目前的研究表明，天然表達或轉(zhuǎn)染表達的Fas基因?qū)毎蛲鲇写龠M作用。啟動細胞凋亡的死亡信號途徑是通過兩種死亡因子，即FasL和TNF與細胞膜表面的相應受體Fas和TNFR結(jié)合后所發(fā)生的凋亡反應。2．Fas（促進凋亡基因）33TNF天然配基GF（生長因子）FasFasL（配體）信號轉(zhuǎn)導ACPKACa2+PKCApoptosis細胞膜FasL、TNF介導的細胞凋亡信號途徑腺苷酸環(huán)化酶TNF天然GFFasFasL信號ACPKACa2+PKCA34

3．P53

（促進凋亡基因）

野生型P53基因具有誘導細胞凋亡的功能，發(fā)生突變后反而可抑制細胞凋亡。

野生型P53基因編碼的P53蛋白是一種DNA結(jié)合蛋白，該蛋白在細胞周期的G1期發(fā)揮檢查點(checkpoint)的功能，檢查染色體DNA是否有損傷，一旦發(fā)現(xiàn)有缺陷的DNA，它就刺激CIP(CdK—interactingprotein-1，cdk是cyclindependentkinase的縮寫)的表達，阻止細胞進入細胞周期，啟動DNA修復機制。

35如修復失敗，P53啟動細胞凋亡機制。哪些遺傳信息出錯，有可能演變?yōu)閻盒阅[瘤的細胞，常常通過這種機制被消滅在萌芽之中。因此，P53有“分子警察”(molecularpoliceman)的美譽。

4．c-myc，Bcl-x（雙向調(diào)控基因）c-myc是一種癌基因，能誘導細胞增殖，也能誘導細胞凋亡，有雙向調(diào)節(jié)作用。c-myc蛋白作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子:激活介導細胞增殖的基因.激活介導細胞凋亡的基因.細胞何去何從，取決于細胞接受何種信號以及細胞所處的生長環(huán)境。如修復失敗，P53啟動細胞凋亡機制。哪些遺傳36例如：在c-myc基因表達后，如果沒有足夠的生長因子持續(xù)作用細胞就發(fā)生凋亡；反之，細胞處于增殖狀態(tài)。Bcl-x基因可翻譯出兩種蛋白:

Bcl-XL:抑制細胞凋亡Bcl—Xs:促進細胞凋亡Bcl-x激活后是否產(chǎn)生細胞凋亡則與這兩種蛋白合成以誰為主有關(guān)。例如：在c-myc基因表達后，如果沒有足夠的生37第三節(jié)細胞凋亡的發(fā)生機制機制尚未充分闡明，有以下可能:：

一、氧化損傷在細胞凋亡中的作用

氧自由基造成生物大分子(核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì))的氧化損傷(氧化應激,oxidativestress)狀態(tài)，后果之一是誘導細胞凋亡。第三節(jié)細胞凋亡的發(fā)生機制機制尚未充分闡明38

缺血--再灌注細胞內(nèi)活性氧

Oˉ·2、H2O2、OH·、NO

內(nèi)、外源抗氧化劑(-)

bcl—2基因等→

→

脂質(zhì)過氧化轉(zhuǎn)錄因子

Ca2+

DNA內(nèi)切酶死亡基因凋亡

39氧化應激引起細胞凋亡的可能機制是:1.氧自由基引起的DNA損傷可激活P53基因2.氧自由基引起的DNA損傷可活化聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶，引起NAD快速耗竭，ATP大量消耗。3.氧自由基攻擊細胞膜上不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化直接造成細胞膜的損傷可誘導細胞凋亡；此外細胞膜上不飽和脂肪酸(如花生四烯酸)的氧化產(chǎn)物過氧羥基24碳四烯酸有很強的誘發(fā)細胞凋亡的作用。氧化應激引起細胞凋亡的可能機制是:404.激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶，產(chǎn)生膜的發(fā)泡現(xiàn)象。5.引起細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，可改變細胞膜的通透性,使Ca2+內(nèi)流增加，誘導細胞凋亡。自由基對線粒體膜的損害導致其通透性和膜電位的變化也可誘導細胞凋亡。6.氧化應激可活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-B和AP-1(活化蛋白-1)，加速細胞凋亡相關(guān)的一些基因的表達，誘發(fā)細胞凋亡。但也有實驗證明，在活性氧顯著減少的低氧環(huán)境下某些類型的細胞凋亡仍可發(fā)生，這表明氧化應激不是細胞凋亡的唯一機制。4.激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶，產(chǎn)生膜41

二、鈣穩(wěn)態(tài)失衡在細胞凋亡中的作用

例如：各種凋亡刺激，如TNF抗CD+3抗體TCDD引起細胞凋亡是鈣依賴過程。

凋亡發(fā)生時胞漿Ca2+濃度顯著上升，并在隨后發(fā)生的一系列改變中起關(guān)鍵性作用。

諸多的凋亡變化如：Ca2+／Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶的激活、需鈣蛋白酶、磷脂酶、等激活，凋亡細胞膜的空泡化等均與鈣穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)。二、鈣穩(wěn)態(tài)失衡在細胞凋亡中的作用42

鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起細胞凋亡的可能機制：★

1.激活Ca2+／Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶，降解DNA鏈；2.激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化細胞內(nèi)肽鏈間的?；D(zhuǎn)移，在肽鏈間形成共價鍵，使細胞骨架蛋白分子間發(fā)生廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體形成；3.激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速細胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；4.Ca2+在ATP的配合下使DNA鏈舒展，暴露出

核小體之間的連接區(qū)內(nèi)的酶切位點，有利DNA內(nèi)切酶切割DNA。鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起細胞凋亡的可能機制：★43

三、線粒體損傷在細胞凋亡中的作用

細胞凋亡期間線粒體超微結(jié)構(gòu)基本正常，但功能發(fā)生顯著改變:膜通透性增大，跨膜電位(m)下降，能量合成顯著等。目前證據(jù)顯示：線粒體功能改變在細胞凋亡的發(fā)生中起關(guān)鍵性作用。因為：抑制線粒體的TAC或呼吸鏈功能可引起細胞凋亡在細胞核出現(xiàn)凋亡改變前，常先有線粒體膜電位阻止線粒體的通透性改變可防止細胞凋亡，如Bcl-2可阻止細胞凋亡(升高線粒體的跨膜電位和阻止線粒體通透性改變)。三、線粒體損傷在細胞凋亡中的作用44

Ca2+NO缺血缺氧活性氧線粒體mPTP開放Apaf+Cyt.CBcl-2__Caspase-9酶原Caspase-9+Caspase-3酶原Caspase-3+AIF+蛋白水解酶細胞凋亡DNA斷裂核酸內(nèi)切酶激活無活性核酸內(nèi)切酶激活+Caspase抑制劑線粒體m與細胞凋亡

458細胞凋亡與疾病4課件46

細胞凋亡是機體維持細胞群體數(shù)量穩(wěn)態(tài)的重要手段，細胞凋亡失調(diào)(凋亡不足或／和凋亡過度)可成為某些疾病的重要發(fā)病機制。

一、細胞凋亡不足這類疾病無論細胞增殖的狀態(tài)如何，其共同點是細胞凋亡相對不足，細胞生死相抵后是生大于死，導致細胞群體的穩(wěn)態(tài)被破壞，病變細胞異常增多或病變組織體積增大，器官功能異常。第四節(jié)細胞凋亡與疾病

細胞凋亡是機體維持細胞群體數(shù)47

1．腫瘤

多年來，人們一直以為細胞增殖和分化的異常是腫瘤發(fā)病的主要癥結(jié)所在，然而隨著細胞凋亡的概念的引入，使人們有機會從另一個角度——細胞死亡來審視腫瘤的發(fā)生。目前認為細胞增殖過度是腫瘤發(fā)病的一個途徑，凋亡受抑、細胞死亡不足是腫瘤發(fā)病的另一途徑，結(jié)果導致病變組織內(nèi)腫瘤細胞存活延長，使細胞群體內(nèi)存活與死亡的平衡被破壞，存活大于死亡，腫瘤細胞數(shù)目的凈增長增多。研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤組織(如前列腺癌、結(jié)腸癌等)Bcl-2基因的表達顯著高于周圍正常組織，提示這些腫瘤與細胞凋亡減弱有關(guān)。1．腫瘤48

野生型P53基因是目前最受關(guān)注的抑癌基因，它主要通過誘導腫瘤細胞凋亡而發(fā)揮抑癌作用。當P53基因突變或缺失時，細胞凋亡減弱，機體腫瘤的發(fā)生率明顯增加。例如：研究發(fā)現(xiàn)在非小細胞肺癌P53基因的突變率為50％以上，在小細胞肺癌甚至高達80％。正如前述，機體通過細胞凋亡清除那些對機體內(nèi)環(huán)境可能構(gòu)成威脅的細胞.發(fā)病學角度來看，細胞凋亡實際上是機體天然的抗癌機制之一。

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2．自身免疫病

自身免疫病主要的特征是自身抗原受到自身抗體或致敏T淋巴細胞的攻擊，造成器官組織損傷。正常情況，免疫系統(tǒng)在發(fā)育過程中已將針對自身抗原的免疫細胞有效清除(其主要方式就是細胞凋亡)。T細胞的發(fā)育、分化在胸腺內(nèi)進行，胸腺具有選擇性保留或去除T細胞中不同克隆的功能，即正選擇（positiveselection）和負選擇(negativeselection)。通過正選擇具有與非己抗原-MHC抗原結(jié)合的TcR的單陽性細胞可以存活下來，并進入外周T細胞庫。確保通過正選擇的T細胞不會針對自身抗原而僅對非己抗原產(chǎn)生免疫反應。2．自身免疫病50具有與自身抗原-MHC抗原有高度親和力的TcR的雙陽性細胞將接受負選擇，即在自身抗原與胸腺上皮細胞膜的MHC分子共同作用下，通過細胞凋亡而被清除，即針對自身抗原的T細胞在胸腺的發(fā)育過程中即被清除。如胸腺功能異常，負選擇機制失調(diào)，針對自身抗原的T細胞，就可存活，并增殖，進而攻擊自身組織，產(chǎn)生自身免疫病，如多發(fā)性硬化癥、胰島素依賴型糖尿病、慢性甲狀腺炎等。

從細胞凋亡角度看自身免疫病的發(fā)病是由于細胞凋亡不足，未能有效清除自身免疫性T細胞所致。到目前為止，糖皮質(zhì)激素仍是治療自身免疫性疾病的有效藥物之一，其主要機制就是誘導那些異常存活的自身免疫性T細胞凋亡★。具有與自身抗原-MHC抗原有高度親和力的Tc51

二、細胞凋亡過度

1．心血管疾病

近年來，對細胞凋亡在心血管疾病發(fā)病中作用的研究已更新了人們對許多心血管疾病的認識。

(1)心肌缺血與缺血-再灌注損傷：認為心肌缺血或缺血-再灌注損傷造成的心肌細胞死亡形式是壞死。目前研究表明，該種心肌細胞損傷不但有壞死，也有凋亡。壞死，目前人們尚無辦法干預，但凋亡是受一系列程序控制的過程，可能通過干預死亡程序加以挽救。研究細胞凋亡，給心肌缺血或缺血-再灌注損傷的防治開辟了一條新的途徑。二、細胞凋亡過度52

心肌缺血與缺血-再灌注損傷的細胞凋亡有如下特點：★缺血早期以細胞凋亡為主，晚期以壞死為主；在梗死灶的中央通常以細胞壞死為主，周邊部分以細胞凋亡為主；輕度缺血以細胞凋亡為主，重度通常發(fā)生壞死；在一定時間范圍內(nèi)，缺血-再灌注損傷時發(fā)生的細胞凋亡比同時間的單純?nèi)毖鼑乐?；急性、嚴重的心肌缺?如心肌梗死)以心肌壞死為主，而慢性、輕度的心肌缺血則發(fā)生細胞凋亡。心肌缺血與缺血-再灌注損傷53心肌缺血或缺血-再灌注損傷引起細胞凋亡的機制目前尚不清楚，可能與下列因素有關(guān):①體內(nèi)實驗證明，應用SOD可顯著減少缺血-再灌注引起的心肌細胞凋亡，提示與氧化應激有關(guān)。②缺血或缺氧可引起心肌細胞死亡受體Fas顯著上調(diào)，使心肌細胞有可能通過與FasL(Fas配體)反應而導致細胞凋亡；③實驗證明，缺氧可增加P53基因的轉(zhuǎn)錄，因此心肌缺血所引起的細胞凋亡可能與P53基因的激活有關(guān)。心肌缺血或缺血-再灌注損傷引起細胞凋亡的機制目54

(2)心力衰竭：

既往人們對其發(fā)病機制的研究投放到心肌細胞功能異常上，而對心肌細胞數(shù)量的變化及其對心衰的影響則關(guān)注不多。近年來有關(guān)細胞凋亡與心力衰竭關(guān)系的研究已表明，心肌細胞凋亡造成心肌細胞數(shù)量減少可能是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的原因之一。在心力衰竭發(fā)生、發(fā)展過程中出現(xiàn)的許多病理因素如：氧化應激、壓力或容量負荷過重、神經(jīng)-內(nèi)分泌失調(diào)(細胞凋亡水平升高)、細胞因子(如TNF)、缺血、缺氧等都可誘導心肌細胞凋亡。(2)心力衰竭：55例如:壓力負荷過重引起的心衰動物觀察到左心肥大的同時，心肌細胞數(shù)量減少(細胞凋亡造成的)。從心衰病人心肌標本證實，心肌凋亡指數(shù)(apoptoticindex，發(fā)生凋亡的細胞核數(shù)／100個細胞核)高達35.5％，而對照水平僅0.2％-0.4％。這一現(xiàn)象給心衰發(fā)病機制賦予了新的內(nèi)容，即心力衰竭發(fā)生時不但有心肌細胞功能的異常，而且還有心肌細胞數(shù)量的減少。心力衰竭心臟存在心肌細胞凋亡這一事實，提示阻斷誘導心肌細胞凋亡的信號和(或)阻斷將這些信號與死亡程序連接起來的通道將有助于阻遏凋亡，防止心肌細胞數(shù)量的減少，維持或改善心功能狀態(tài)。這將是今后一段時間內(nèi)心力衰竭防治的新途徑。例如:壓力負荷過重引起的心衰動物觀察到左心肥562．神經(jīng)元退行性疾病

在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有一類以特定神經(jīng)元進行性喪失為其病理特征的疾病，如阿爾茨海默病(Alzheimerdisease，AD)，帕金森病(Parkinsondisease)，多發(fā)性硬化癥等。其中對AD的研究最為廣泛，積累了較多資料?，F(xiàn)有研究表明：AD造成神經(jīng)元喪失的主要機制是細胞凋亡。

2．神經(jīng)元退行性疾病57近年研究提示，有多種因素可引起神經(jīng)元凋亡，包括—淀粉樣蛋白、鈣超載、氧化應激及神經(jīng)生長因子分泌不足等。

可能機制是：有關(guān)致病因素(如氧自由基)作用于神經(jīng)元，引起Ca2+內(nèi)流增加，然后激活與-淀粉樣蛋白合成有關(guān)的基因，神經(jīng)元內(nèi)-淀粉樣蛋白含量增加，從而導致神經(jīng)元凋亡。因此，若能阻抑胞內(nèi)游離Ca+2的上升或清除氧自由基，有可能阻斷細胞凋亡。近年研究提示，有多種因素可引起神經(jīng)元凋亡，包58

3．病毒感染

由人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的AIDS具有傳播速度快，無特效療法和死亡率高(5年內(nèi)100％)等特點，其關(guān)鍵的發(fā)病機制是CD4+淋巴細胞被選擇性破壞，細胞數(shù)顯著減少，相關(guān)免疫功能缺陷。

研究表明，細胞凋亡在AIDSCD4+淋巴細胞減少中扮演了非常重要的角色。根據(jù)目前研究，HIV感染導致CD4+淋巴細胞發(fā)生凋亡與下列因素有關(guān)：3．病毒感染59糖蛋白120(gP120)：感染HIV的宿主細胞膜上可表達一種名為gp120的糖蛋白，CD4+淋巴細胞的表面存有這種蛋白的受體，當gP120與CD4+受體分子結(jié)合后即可觸發(fā)CD4+淋巴細胞發(fā)生凋亡。(2)合胞體形成：受HIV感染的大部分CD4+，淋巴細胞(約80％-90％)逐步融合形成合胞體或多核巨細胞，合胞體在形成過程中或形成后即可發(fā)生凋亡而解體。

(3)Fas基因表達上調(diào)：HIV感染使CD4+淋巴細胞的Fas基因表達上調(diào)，使CD4+淋巴細胞對Fas介導的凋亡敏感性提高。糖蛋白120(gP120)：60(4)T細胞激活：HIV感染可引起CD4+／淋巴細胞處于被激活狀態(tài)。正常情況下被激活的細胞會迅速發(fā)生增殖反應，但在HIV感染時被激活的CD4+／淋巴細胞不但不發(fā)生增殖，反而發(fā)生凋亡。這種發(fā)生在細胞激活以后的T淋巴細胞死亡又稱為激活誘導的細胞死亡(activation-inducedcelldeath，AICD)。(5)細胞因子：受HIV感染的巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子(TNF)增多，TNF可通過與TNF受體-1(死亡受體)結(jié)合而啟動死亡程序，也可刺激CD4+淋巴細胞大量產(chǎn)生氧自由基，通過氧化應激而觸發(fā)細胞凋亡。(4)T細胞激活：61(6)

tat蛋白：★受HIV感染的細胞可產(chǎn)生tat蛋白，這種蛋白可自由透過細胞膜。tat蛋白進入CD4+淋巴細胞后，可誘導細胞產(chǎn)生氧自由基，增強Fas抗原表達而提高對細胞凋亡的易感性。(7)在HIV慢性感染階段，受感染的CD4+淋巴細胞可作為效應細胞(effectcell)，未受HIV感染的CD4+淋巴細胞作為其靶細胞而被誘導產(chǎn)生凋亡。這是慢性HIV感染時CD4+淋巴細胞數(shù)量減少的主要原因。(6)tat蛋白：★62從上述可知，HIV感染可通過多因素、多途徑誘導CD4+T淋巴細胞發(fā)生細胞凋亡，導致CD4+T淋巴細胞大量減少。此外，HIV也可誘導其他免疫細胞如B細胞、CD8+淋巴細胞、巨噬細胞發(fā)生凋亡。

在AIDS發(fā)病過程中，細胞凋亡具有一定的保護意義。可使宿主細胞的DNA發(fā)生降解，整合于其中的病毒DNA也隨之被破壞，因此可終止病毒的復制和表達，從而阻止其進一步向周圍擴散。但是細胞凋亡在HIV感染中的有限的保護作用不足以補償它對整個免疫系統(tǒng)的致命性打擊。因此，在積極抗病毒治療的同時，如何阻止免疫細胞的凋亡是AIDS病人免疫重建的關(guān)鍵所在。從上述可知，HIV感染可通過多因素、多途徑誘63

三、細胞凋亡不足與過度并存

人類組織器官通常由不同種類的C構(gòu)成，例如心臟主要是心肌C和心肌間質(zhì)C，血管則以內(nèi)皮C和平滑肌C為主。由于C類型的差異，各種C在致病因素的作用下，有些C可表現(xiàn)為凋亡不足，而另一些C則可表現(xiàn)為凋亡過度，因此在同一疾病或病理過程中兩種情況也可同時并存。

動脈粥樣硬化即屬于這種情況，對內(nèi)皮細胞而言是凋亡過度，對平滑肌C來說則是凋亡不足。

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正常情況下血管平滑肌C也有低水平(約0.06％)凋亡存在，在AS過程中血管平滑肌C的凋亡大幅度升高。有人定量地測定冠狀動脈粥樣硬化病灶內(nèi)凋亡的平滑肌C可達29％。

一個有趣的問題是既然血管平滑肌C凋亡在AS過程中比正常有大幅度上升，但為何AS的血管壁仍然會變厚、變硬。研究表明，當血管平滑肌增殖活性升高時，伴隨的C凋亡活動也增強，試圖維持平滑肌C數(shù)的動態(tài)平衡。顯然，平滑肌C的凋亡是為了抗衡平滑肌增殖活動的增強，是一種防止血管壁增厚的保護性反應。

正常情況下血管平滑肌C也有低水平(約0.65

然而，從總體上看AS發(fā)病過程中，平滑肌細胞的增殖始終占主導地位。有學者在實驗性PTCA后再狹窄模型中發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮損傷后第9天，平滑肌細胞增殖與凋亡均達到峰值，但細胞凋亡數(shù)僅為增殖數(shù)的75％。

因此，增殖與凋亡相抵后平滑肌C數(shù)的凈增值仍然增加；這可以解釋上述AS血管為何逐漸增厚的現(xiàn)象。最近有學者提出促進平滑肌細胞凋亡防止其過度增殖是抗AS的新思路。

然而，從總體上看AS發(fā)病過程中，平滑肌細胞的66第五節(jié)細胞凋亡在疾病防治中的意義

一、合理利用凋亡相關(guān)因素凋亡誘導因素是凋亡的始動環(huán)節(jié)，人們正嘗試將這類因素直接用于治療一些因細胞凋亡不足而引起的疾病。例如，放射線照射、TNF具有誘導凋亡的作用，可使用外源性TNF來誘導腫瘤細胞凋亡。第五節(jié)細胞凋亡在疾病防治中的意義

一、合理利67高熱或高溫是細胞凋亡的誘導因素，在腫瘤局部加熱至43°C30分鐘，引起大量腫瘤發(fā)生凋亡。某些生長因子或激素是細胞生長所必需的，一旦撤除，細胞即可發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子是神經(jīng)元存活的必要條件，一旦缺乏即會引起神經(jīng)細胞的凋亡，因此已將神經(jīng)生長因子試用于老年性癡呆，以防止神經(jīng)細胞的凋亡。前列腺癌細胞的生長需要雄激素，研究證明，撤除雄激素可引起癌細胞凋亡，這個效應在臨床上用去勢(切除睪丸)治療前列腺癌已得到證實。因此，用雄激素受體阻斷劑或雄激素的拮抗劑可能會產(chǎn)生更好的治療前景。高熱或高溫是細胞凋亡的誘導因素，在腫瘤局部加68

二、干預凋亡信號轉(zhuǎn)導

Fas／FasL信號系統(tǒng)是重要的凋亡信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)之一，因此可利用阿霉素刺激腫瘤細胞在其細胞膜上表達Fas／FasL，導致腫瘤細胞間相互作用、交聯(lián)，引起凋亡。SPP是神經(jīng)酰胺信號系統(tǒng)的代謝產(chǎn)物，具有轉(zhuǎn)導增殖信號拮抗凋亡的作用。因此，有可能用來治療AIDS，防止CD4+淋巴細胞的凋亡，也有可能用于治療老年性癡呆，防止神經(jīng)元的凋亡。

69

三、調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因如果能運用分子生物學手段人為地控制凋亡相關(guān)基因的表達便有可能控制凋亡過程，無疑將會使許多疾病的防治大為改觀.研究發(fā)現(xiàn)，當野生型P53基因發(fā)生突變后其誘導腫瘤細胞凋亡的效應減弱，有利于腫瘤細胞的增殖。目前，人們正在探討用各種載體(如：腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒或脂質(zhì)體)將野生型P53基因?qū)隤53基因發(fā)生突變的腫瘤細胞內(nèi)，重新恢復“分子警察”的職責，誘導腫瘤細胞凋亡。三、調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因70

四、控制凋亡相關(guān)的酶學機制

在凋亡執(zhí)行階段核酸內(nèi)切酶和caspases在摧毀細胞結(jié)構(gòu)方面起著關(guān)鍵性作用：因此若能抑制它們的活性，細胞凋亡過程必然受阻；反之，則加速。如前所述，核酸內(nèi)切酶的激活需Ca2+和Mg2+，降低細胞內(nèi)、外的Ca2+濃度，細胞凋亡過程即受到阻遏或延遲；相反，利用Ca2+載體(A23187)提升細胞內(nèi)Ca2+水平則加速細胞凋亡的發(fā)生。因此，在防治缺血-再灌注損傷中使用鈣阻滯劑可在一定程度上減輕細胞凋亡的發(fā)生。四、控制凋亡相關(guān)的酶學機制71

五、防止線粒體跨膜電位的下降維持線粒體跨膜電位m防止細胞凋亡已日益受到關(guān)注。

目前已發(fā)現(xiàn)環(huán)胞霉素A(cyclosporinA，免疫抑制劑)具有阻抑m下降的作用。環(huán)胞霉素的衍生物(N-methyl-Val-Cyclosporin)有較強的穩(wěn)定線粒體m的作用，而呈現(xiàn)明顯細胞保護作用，但其免疫抑制作用已基本不存在，因此，有良好抗凋亡的應用前景。五、防止線粒體跨膜電位的下降72第六節(jié)細胞凋亡的檢測隨著研究技術(shù)的提高和對細胞凋亡的認識不斷深入，檢測方法已從細胞、染色質(zhì)到分子水平日趨完善和成熟。

目前，檢測方法很多，按方法學的學科分類可將細胞凋亡的檢測方法分為形態(tài)學、生物化學、免疫化學和分子生物學測定法。也可分為以下七類檢測方法：第六節(jié)細胞凋亡的檢測隨著研究技術(shù)的提73①細胞凋亡的形態(tài)學檢測②流式細胞分析③DNA降解分析④凋亡細胞膜改變分析⑤細胞凋亡相關(guān)蛋白分析⑥細胞凋亡酶學分析⑦其他細胞凋亡檢測法①細胞凋亡的形態(tài)學檢測74可根據(jù)下列參數(shù)指標對細胞凋亡早期進行測定:

①細胞群體或單個細胞DNA片段化，凋亡細胞DNA可裂解為不同長度的片段；

②細胞膜不對稱性的改變，PS(磷脂酰絲氨酸）從細胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到細胞膜外側(cè)；

③凋亡細胞caspases的激活，caspase家族的激活可起動一系列瀑布反應事件從而使細胞凋亡發(fā)生；

④凋亡細胞的線粒體釋放細胞色素C和細胞凋亡起始因子(AIF)。從實際需要出發(fā)，可將細胞凋亡檢測分為分析細胞群體中的凋亡和單個凋亡細胞二大類。(見圖)可根據(jù)下列參數(shù)指標對細胞凋亡早期進行測定:758細胞凋亡與疾病4課件76細胞凋亡與疾病

ApoptosisandDisease細胞凋亡與疾病Apoptosis77第一節(jié)概述第二節(jié)細胞凋亡過程與調(diào)控第三節(jié)細胞凋亡的發(fā)生機制第四節(jié)細胞凋亡與疾病第五節(jié)細胞凋亡在疾病防治中的意義第六節(jié)細胞凋亡的檢測

第一節(jié)概述78第一節(jié)概述

一、發(fā)展研究史1972年病理學家Kerr等首先提出細胞凋亡(apoptosis)的概念，引起人們對這一生物學現(xiàn)象的興趣。尤其是wyllie等1980年揭示了細胞凋亡獨特的生物學特征，即180-200bP單體或寡聚核小體DNA片段，電泳譜為典型的“梯形帶”(ladderpattern)，使其倍受世人關(guān)注。第一節(jié)概述一、發(fā)展研究史79

近二十年來，特別是90年代初細胞凋亡已成為生物學和生物醫(yī)學的研究熱點，其研究論文在世界各種學術(shù)雜志上發(fā)表數(shù)量呈指數(shù)級增長。1994年美國著名《科學》雜志主編Cubtta和Koshland將細胞凋亡評為當年世界生命科學中僅次于DNA修復酶的第二個研究熱點。經(jīng)過無數(shù)研究證明細胞凋亡是一種具有特征形態(tài)和生化改變的過程，是一系列基因活動引起的級聯(lián)反應的結(jié)果。有利它性，使周圍的細胞生長得更好，或是發(fā)育過程或是免疫功能的需要。

80細胞凋亡學說的建立是20世紀生物醫(yī)學科學發(fā)展史上的里程碑。目前已經(jīng)能夠從分子水平了解調(diào)控細胞凋亡的分子和其形態(tài)變化的一些分子基礎(chǔ)。當細胞的聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)、Lamin—1、核DNA和拓撲異構(gòu)酶、-fodrin和-肌動蛋白等分子被降解，使不同類型細胞的凋亡產(chǎn)生相似的形態(tài)特征。如Lamin、拓撲異構(gòu)酶的降解使染色質(zhì)失去核內(nèi)的附著，變?yōu)闈饪s；核酸內(nèi)切酶的被激活而切斷DNA，使核小體之間發(fā)生斷裂，在電泳下呈現(xiàn)階梯狀特點，-fodrin、-actin被降解，使細胞膜和細胞骨架受到影響；凋亡的細胞形成多個凋亡小體。說明細胞死亡也像細胞的生存一樣是受分子調(diào)控的，在進化中也是保守的。細胞凋亡學說的建立是20世紀生物醫(yī)學科學發(fā)展81

現(xiàn)在認為，細胞凋亡在有機體的正常發(fā)生、組織重建、老化和應答不可恢復的損害中具有重要意義；細胞凋亡的失控，可能成為腫瘤、神經(jīng)退化性疾病及免疫缺陷等多種疾病的病因。細胞凋亡研究中的重要事件l972年Kerr、Wyllie、Currie首次提出細胞凋亡這一劃時代的生物學概念。1980年Wyllie發(fā)現(xiàn)核酸內(nèi)切酶激活引起凋亡細胞DNA特異性梯形帶的形成，提醒世人細胞凋亡的重要性，并重新點燃和激起世界范圍內(nèi)對細胞凋亡研究的熱潮。現(xiàn)在認為，細胞凋亡在有機體的正常發(fā)生、組織重建、老化821993年底發(fā)現(xiàn)ICE家族在細胞凋亡發(fā)生中的作用。caspases蛋白酶在細胞凋亡中的作用（1996）Bcl-2家族及其作用。Fas(Apo-l，CD95)死亡受體家族的發(fā)現(xiàn)。細胞凋亡信號傳導系統(tǒng)的基本框架及組成。許多疾病與細胞凋亡的基本關(guān)系。（1995）近年來，逐漸認識到細胞凋亡有其特殊的生物學意義，引起了發(fā)育生物學、細胞生物學、免疫學、神經(jīng)生物學、分子生物學、腫瘤學和研究工作者的廣泛興趣，形成了一個新的研究熱點。1993年底發(fā)現(xiàn)ICE家族在細胞凋亡發(fā)生中的作用。83

二、與細胞凋亡有關(guān)的基本概念細胞凋亡在臨床疾病的發(fā)生與發(fā)展中的作用，愈來愈受到人們所關(guān)注。近代概念認為：

由體內(nèi)外因素觸發(fā)細胞內(nèi)預存的死亡程序而導致的細胞死亡過程稱為細胞凋亡(apoptosis)

。

生理條件下，細胞死亡是機體對衰老或畸變或其他任何一種不需要的細胞(如炎性細胞、過度增殖的細胞等)的清除方式；但在某些病理生理條件下發(fā)生的細胞凋亡，則可能引起器官或組織的損傷，即引起臨床疾病。二、與細胞凋亡有關(guān)的基本概念84

（一）細胞凋亡與程序性細胞死亡細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下,遵循自身的程序，自己結(jié)束生命的過程，最后細胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，被其他細胞吞噬.。現(xiàn)在很多情況下，細胞凋亡亦稱為程序性細胞死亡(programmedcelldeath,PCD)。PCD這一概念已為科學家廣泛接受。但不同的人對PCD概念的解釋有所不同。一般而言，細胞凋亡是一個形態(tài)學的概念，是對細胞凋亡時所見到的固定形式的形態(tài)學描述，而PCD是功能上的概念。PCD是發(fā)生于生長發(fā)育過程中的生理性細胞死亡，而細胞凋亡則是PCD的最常見、研究最多的方式。（一）細胞凋亡與程序性細胞死亡85

(二)細胞凋亡與有絲分裂(mitosis)

與有絲分裂的細胞增殖活動相比，細胞發(fā)生凋亡時，像秋天的樹葉或花的自然凋落(fallingoff)一樣，這種生物學現(xiàn)象，借用希臘詞“apoptosis”來表示，意思是秋天的樹葉或花的自然凋落，譯為“細胞凋落”.

有絲分裂:細胞的分裂與分化，其與機體的生長發(fā)育密切相關(guān)。

細胞凋亡:由細胞內(nèi)某些特定基因所決定，具有特殊的生物學意義，是一種細胞的主動死亡過程。

二者雖互為對立，正常情況下，在機體內(nèi)處于動態(tài)平衡，以維持機體細胞數(shù)量的平衡和自身的穩(wěn)定(如蝌蚪青蛙尾巴消失現(xiàn)象)。(二)細胞凋亡與有絲分裂(mitosis)86

（三）細胞凋亡與細胞壞死(necrosis)

是多細胞生物細胞死亡的兩種不同形式，在形態(tài)學、生化代謝、分子機制、結(jié)局和意義等方面都有本質(zhì)的區(qū)別：

細胞凋亡與壞死的比較

壞死凋亡1.性質(zhì)病理性，非特異性生理性或病理性，特異性2.誘導因素強烈刺激，隨機發(fā)生較弱刺激，非隨機發(fā)生3.生化特點被動過程，無新蛋白主動過程，有新蛋白合成，合成，不耗能耗能4.形態(tài)變化細胞結(jié)構(gòu)全面溶解、胞膜及細胞器相對完整破壞細胞腫脹細胞皺縮，核固縮5.DNA電泳彌散性降解，電泳呈DNA片段化(180—200bp)，均一DNA片狀電泳呈“梯”狀條帶6.炎癥反應溶酶體破裂，溶酶體相對完整，局部炎癥反應局部無炎癥反應7.凋亡小體無有8.基因調(diào)控無有（三）細胞凋亡與細胞壞死(necrosis)878細胞凋亡與疾病4課件88三、細胞凋亡的生理和病理意義凋亡作為生理過程，有以下三項作用：

1.確保正常發(fā)育生長機體的發(fā)育、生長過程并不僅僅與細胞的增殖與分化有關(guān)，凋亡在器官組織的形成、成熟過程中也發(fā)揮了重要作用。它可以清除多余的、失去功能價值的細胞。例如：人胚胎肢芽發(fā)育過程中指(趾)間組織，通過細胞凋亡機制而被逐漸消除，形成指(趾)間隙。2.維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定受損、突變或衰老的細胞如果存留體內(nèi)就可能干擾機體功能，甚至演變?yōu)槎喾N疾病(如腫瘤)。維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，機體必須及時將這些細胞清除，清除的主要方式就是凋亡。三、細胞凋亡的生理和病理意義89例如機體通過細胞凋亡：清除針對自身抗原的T淋巴細胞，維持免疫穩(wěn)定。皮膚、粘膜上皮不斷更新：新的C增殖和衰老C凋亡子宮內(nèi)膜的周期性變化：增生激素凋亡、脫落；受損不能修復的細胞、癌前病變細胞的清除。通過細胞凋亡被機體清除的細胞數(shù)量是相當可觀的，每秒鐘可達數(shù)百萬個。3.發(fā)揮積極的防御功能參與了機體的防御反應，例如當機體受到病毒感染時，受感染的細胞發(fā)生凋亡，使DNA發(fā)生降解，整合于其中的病毒DNA也隨之被破壞，因而阻止了病毒的復制。例如機體通過細胞凋亡：90第二節(jié)細胞凋亡過程與調(diào)控

一、細胞凋亡的過程從細胞受到凋亡誘導因素的作用到細胞凋亡大致可分成四個階段：1.凋亡信號轉(zhuǎn)導細胞內(nèi)外的凋亡誘導因素通過各種受體作用于細胞后，細胞產(chǎn)生一系列復雜的生化反應，形成與細胞凋亡有關(guān)的第二信使物質(zhì),如Ca2+,cAMP，神經(jīng)酰胺等，然后通過胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導途徑激活后續(xù)凋亡程序。第二節(jié)細胞凋亡過程與調(diào)控一、細胞凋亡的過程91

2.凋亡基因激活調(diào)控凋亡的基因接收由信號轉(zhuǎn)導途徑傳來的死亡信號后按預定程序啟動，并合成為執(zhí)行凋亡所需的各種酶類及相關(guān)物質(zhì)。3.細胞凋亡的執(zhí)行

主要的執(zhí)行者：核酸內(nèi)切酶(endogenousnuclease，DNase)：徹底破壞細胞生命活動所必須的全部指令

凋亡蛋白酶（Caspases）：導致細胞結(jié)構(gòu)的全面解體2.凋亡基因激活924.凋亡細胞的清除已經(jīng)凋亡的細胞可被鄰近的吞噬細胞或其他細胞所吞噬，分解。上述全過程需時約數(shù)分鐘至數(shù)小時不等。從凋亡信號轉(zhuǎn)導到凋亡執(zhí)行的各個階段都有負調(diào)控因子存在，以形成完整的反饋環(huán)路，使凋亡過程受到精確、嚴密的調(diào)控。凋亡誘導因素+受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺死亡信號凋亡相關(guān)基因激活DNase激活Caspases激活巨噬細胞吞噬分解凋亡細胞細胞凋亡過程4.凋亡細胞的清除凋亡誘導因素+受體93

二、凋亡時細胞的主要變化

1.細胞凋亡的形態(tài)學改變凋亡細胞表面的微絨毛消失，并逐步脫離與周圍細胞的接觸。可見到:①空泡化(blebbing)：胞漿脫水，胞膜迅速發(fā)生空泡化。②固縮(condensation)：細胞體積逐漸縮小引起。

二、凋亡時細胞的主要變化94③出芽(buding)：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不斷擴張并與胞膜融合，形成膜表面的芽狀突起。

④染色質(zhì)邊集(margination)：晚期核質(zhì)高度濃縮融合成團，染色質(zhì)集中分布在核膜的邊緣，呈新月形或馬蹄形分布。線粒體和溶酶體的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化不大。⑤凋亡小體(apoptosisbody)：胞膜皺縮內(nèi)陷，分割包裹胞漿，形成泡狀小體，這是凋亡細胞特征性的形態(tài)學改變。（電鏡下見透亮空泡和濃密核碎片）③出芽(buding)：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不斷擴張并與胞95

2.細胞凋亡的生化改變

細胞凋亡過程中DNA的片段化斷裂及蛋白質(zhì)的降解尤為重要。

1)．DNA的片段化

典型的細胞凋亡以細胞核固縮、染色質(zhì)DNA的特征性片段化為主要特征。細胞凋亡發(fā)生時DNA雙鏈的斷裂發(fā)生在核小體連接部，是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活所致。

96DNA鏈上每隔200個核苷酸有1個核小體，當內(nèi)切酶在核小體連接區(qū)切開DNA時，即可形成180—200bp或其整倍數(shù)的片段。這些片段在瓊脂糖凝膠電泳中呈特征性的“梯”狀(ladderpattern)條帶，是判斷凋亡發(fā)生的客觀指標之一。

DNA片段化斷裂是細胞凋亡的關(guān)鍵性結(jié)局。DNA鏈上每隔200個核苷酸有1個核小體，當97

2)．內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用

執(zhí)行染色質(zhì)DNA切割任務的是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶。盡管已有多種核酸內(nèi)切酶存在于細胞核內(nèi)，但細胞內(nèi)外的凋亡誘導因素并不能直接激活該酶，它需要經(jīng)過一系列胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導環(huán)節(jié)方能被激活。

3).凋亡蛋白酶(caspases)的激活及其作用

caspases是一組對底物天冬氨酸部位有特異水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶(caspase是cysteine—containingaspartate—specificprotease的縮寫)。目前已發(fā)現(xiàn)該蛋白酶家族至少有13個成員(caspase1-13)。2)．內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用98

caspase在凋亡中所起的主要作用是：滅活細胞凋亡的抑制物(如Bcl-2)；水解細胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導致細胞解體，形成凋亡小體；在凋亡級聯(lián)反應(cascade)中水解相關(guān)活性蛋白，使該蛋白獲得或喪失某種生物學功能（如caspase-9可使caspase-3酶原水解形成具有分解蛋白質(zhì)活性的caspase-3）?！铩?98細胞凋亡與疾病4課件100

三、細胞凋亡的調(diào)控

(一)細胞凋亡相關(guān)因素誘導性因素和抑制性因素兩大類：

1．誘導性因素

細胞凋亡是一個程序化的過程，這個程序雖已預設于活細胞之中，正常情況下它并不“隨意”啟動，只有當細胞受到來自細胞內(nèi)外的凋亡誘導因素作用的時候，才啟動，使細胞一步步走向死亡，因此凋亡誘導因素是凋亡程序的啟動者。常見誘導因素有：三、細胞凋亡的調(diào)控101

(1)激素和生長因子失衡例如強烈應激引起的淋巴細胞數(shù)量減少，主要由于大量GC分泌，誘導淋巴細胞凋亡所致。

(2)理化因素射線、高溫、強酸、強堿、乙醇、抗癌藥物等，均可導致細胞凋亡。例如：電離輻射可產(chǎn)生大量氧自由基，使細胞處于氧化應激狀態(tài)，DNA受損，引起細胞凋亡。

(3)免疫性因素免疫細胞在生長、分化及執(zhí)行防御、自穩(wěn)、監(jiān)視功能中其免疫分子參與了免疫細胞或靶細胞的凋亡過程，例如：細胞毒T淋巴細胞(CTL)可分泌粒酶，引起靶細胞發(fā)生凋亡。(1)激素和生長因子失衡102

(4)微生物學因素細菌、病毒等致病微生物及其毒素可誘導細胞凋亡。如