gP96多肽復(fù)合物／樹突狀細胞疫苗研究課件

gP96多肽復(fù)合物／樹突狀細胞

疫苗的實驗研究gP96多肽復(fù)合物／樹突狀細胞

疫苗的實驗研究北京大學(xué)人民醫(yī)院胸部微創(chuàng)中心胸外科博士研究生：李運導(dǎo)師：王俊教授

gP96多肽復(fù)合物／樹突狀細胞

疫苗的實驗研究gP96多肽復(fù)研究背景研究背景全世界肺癌病例1910年<200例1912年374例1920年956例（美國）新增肺癌病例肺癌死亡病例1997年178，100160，4002002年169，400154，9002003年171，900157，200發(fā)病占全部腫瘤發(fā)生的15%，死亡占全部因腫瘤死亡病例的29%全世界肺癌病例1910年<200例1912年374例1920整體療效與30年前比較沒有明顯提高，總的五年生存率仍不足15%整體療效與30年前比較沒有明顯提高，總的五年生存率仍不足15腫瘤抗原免疫系統(tǒng)特異性抗原識別破壞和消滅腫瘤細胞抗原呈遞系統(tǒng)腫瘤抗原免疫系統(tǒng)特異性抗原識別破壞和消滅腫瘤細胞抗原呈遞系統(tǒng)HSPs具有結(jié)合細胞內(nèi)抗原性多肽的能力，可以帶有腫瘤細胞內(nèi)全部抗原肽具有該細胞特有的抗原庫的作用,稱為“分子伴侶”抗原gP96HSPs具有結(jié)合細胞內(nèi)抗原性多肽的能力，可以帶有腫瘤細胞內(nèi)全經(jīng)典的外源性抗原呈遞途徑gP96介導(dǎo)的外源性抗原呈遞途徑通過MHC-II類分子激活CD4+T淋巴細胞通過MHC-I類分子激活CD8+T淋巴細胞經(jīng)典的外源性抗原呈遞途徑gP96介導(dǎo)的外源性抗原呈遞途徑通過途徑激發(fā)人體有效的特異性抗腫瘤免疫功能樹突狀細胞體內(nèi)最強的抗原呈遞細胞途徑激發(fā)人體有效的特異性抗腫瘤免疫功能樹突狀細胞體內(nèi)+>>gP96orDC科研工作新問題單方面要素兩方面要素gP96多價性特異性（抗原庫）DC識別抗原激活細胞免疫（專職抗原呈遞細胞）+>>gP96orDC科研工作新問題單方面要素兩方面研究內(nèi)容研究內(nèi)容肺癌組織提取gP96SDS—PAGE凝膠電泳、銀染鑒定、Western印跡分析蛋白定量分析RT-PCR檢測RNA水平表達免疫組化檢測蛋白水平表達第一部分gp96多肽復(fù)合物提取鑒定在肺癌組織中表達的研究肺癌組織gP96提取和鑒定；肺癌組織和正常組織gP96的表達水平；[目的][流程]肺癌組織提取gP96第一部分gp96多肽復(fù)合物提取鑒定定量分析測得所提取的gp96蛋白濃度在0.1μg/ul左右，相當于50-80ug/g組織。定量分析測得所提取的gp96蛋白濃度在0.1μg/ul左右，肺癌組織細胞漿中有棕黃色顆粒聚集

正常肺組織中細胞蘇木素染色陰性

同一患者標本

GeneN(x±s)T(x±s)tvaluepvaluegp960.6725±0.47131.110±0.4467-4.318<0.001肺癌組織細胞漿中有棕黃色顆粒聚集正常肺組織中細胞蘇木素染色外周血單個核細胞提取及體外擴增流式細胞儀鑒定gP96與樹突狀細胞共孵育制備疫苗體外CTL反應(yīng)，INF-γ濃度淋巴細胞表型分析第二部分gP96多肽復(fù)合物/DC疫苗體外誘導(dǎo)CTL反應(yīng)實驗研究外周血來源DC培養(yǎng)和鑒定gP96多肽復(fù)合物/DC疫苗的制備gP96/DC體外實驗

[目的][流程]外周血單個核細胞提取及體外擴增第二部分gP96多肽復(fù)合培養(yǎng)2-3天后的DC

培養(yǎng)7天后的DC

培養(yǎng)2-3天后的DC培養(yǎng)7天后的DCA-1．培養(yǎng)前CD1a-A-2.培養(yǎng)后CD1a+

B-1.培養(yǎng)前CD86-B-2.培養(yǎng)后CD86+C-1.培養(yǎng)前CD83-C-2.培養(yǎng)后CD83+D-1.培養(yǎng)前CD80-D-2.培養(yǎng)后CD80+E-1.培養(yǎng)前CD14+E-2.培養(yǎng)后CD14-

CD14-；CD80+；CD83+；CD86+

A-1．培養(yǎng)前CD1a-A-2.培養(yǎng)后CD1培養(yǎng)前淋巴細胞的CD3培養(yǎng)10d后淋巴細胞的CD3培養(yǎng)前淋巴細胞的CD4、CD8培養(yǎng)10d淋巴細胞的CD4、CD8CD3/CD8＋T細胞明顯增加；CD8＋/CD4＋細胞比例增加培養(yǎng)前淋巴細胞的CD3樣本ELISA反應(yīng)的OD值(X±S)釋放IFN-γ的量（pg/ml）gp96/DC2.244±0.1334150.835gp961.674±0.1623066.847DC0.126±0.011122.966樣本ELISA反應(yīng)的OD值(X±S)釋放IFN-γ的量（pg建立動物模型以制備的疫苗免疫動物并種植腫瘤觀察成瘤率，腫瘤體積，動物生存時間第三部分gP96多肽復(fù)合物/DC疫苗

動物體內(nèi)實驗研究

gP96/DC在小鼠體內(nèi)的抑制腫瘤生長作用的研究[目的][流程]建立動物模型第三部分gP96多肽復(fù)合物/DC疫苗gPgP96多肽復(fù)合物／樹突狀細胞疫苗研究課件LA795肺癌腫瘤組織提取Gp96小鼠外周血615小鼠肺癌模型Gp96/DC，Gp96，DC提取DC細胞觀察腫瘤生長情況及對小鼠生存期的影響LA795肺癌腫瘤組織提取Gp96小鼠外周血615小鼠肺癌模SCID小鼠PAa肺癌腫瘤組織提取Gp96人外周血免疫重建小鼠荷人肺癌免疫重建小鼠Gp96/DC疫苗提取DC細胞觀察腫瘤生長情況及對小鼠生存期的影響SCID小鼠PAa肺癌腫瘤組織提取Gp96人外周血免疫重建小100%75%615小鼠腫瘤植入后不同時間的腫瘤體積（x±scm3）組數(shù)處理動物數(shù)腫瘤植入后天數(shù)212835Ⅰ種植102.63±0.876.46±1.478.04±1.40ⅡGP9680.33±0.27※0.70±0.62※1.49±1.17※ⅢDC80.30±0.22※0.64±0.49※1.16±0.92※ⅣGP96+DC80.21±0.22※△0.32±0.30※△0.62±0.30※△615LA795※：與Ⅰ組比較，P<0.05?！鳎号cⅡ組和Ⅲ組比較，P<0.05

100%75%615小鼠腫瘤植入后不同時間的腫瘤體積（x±s※：與Ⅰ組比較，P<0.05。△：與Ⅱ組和Ⅲ組比較，P<0.05

615小鼠腫瘤植入后的生存時間組數(shù)處理動物數(shù)腫瘤植入后生存天數(shù)Ⅰ種植1052ⅡGP96851.5ⅢDC858.5※ⅣGP96+DC877※△※：與Ⅰ組比較，P<0.05。615小鼠腫瘤植入后的生存時SCIDPAa※：與Ⅰ組比較，P<0.05?！鳎号cⅡ組和Ⅲ組比較，P<0.05

SCID小鼠腫瘤植入后不同時間的腫瘤體積(X±Scm3)組數(shù)處理動物數(shù)腫瘤植入后天數(shù)212832Ⅰ重建160.38±0.120.75±0.300.90±0.33ⅡGP9680.09±0.06※0.17±0.06※0.22±0.11※ⅢDC80.08±0.06※0.15±0.08※0.24±0.11※ⅣGP96+DC80.03±0.03※△0.08±0.08※△0.12±0.13※△87.5%100%SCIDPAa※：與Ⅰ組比較，P<0.05。SCIDSCID小鼠腫瘤植入后的生存時間組數(shù)處理動物數(shù)腫瘤植入后生存天數(shù)Ⅰ重建1637ⅡGP96852※ⅢDC852.5※ⅣGP96+DC8＞62※△SCID小鼠腫瘤植入后的生存時間組數(shù)處理動物數(shù)腫瘤植入后生存gP96多肽復(fù)合物／樹突狀細胞疫苗研究課件討論討論gP96在肺癌中的表達基因表達的檢測

mRNA水平：原位雜交、NorthernBlot、核酸酶保護分析Real-timeRT-PCR、、半定量RT-PCR。蛋白水平。

方法比較原位雜交僅能提供mRNA在細胞內(nèi)的定位信息，不能確定mRNA的含量，受人為因素影響大，無法檢測極微量的mRNANorthernBlot敏感性低，樣品用量大，對實驗條件要求高，需要應(yīng)用放射性物質(zhì)，不適合檢測低豐度的mRNAReal-timeRT-PCR儀器和試劑盒價格昂貴，標準物難以獲得核酸酶保護分析操作復(fù)雜，價格昂貴半定量RT-PCR

高度敏感、準確、簡便、快捷、對儀器要求低、可重復(fù)性強、易于掌握gP96在肺癌中的表達基因表達的檢測mRNA水平：原位雜交與正常組織相比，肺癌組織中編碼gp96的基因在mRNA水平的表達明顯增高的。這進一步證實了在罹患腫瘤時，以gp96為代表的HSPs合成明顯增加，這是機體受到腫瘤刺激產(chǎn)生的熱休克反應(yīng)，以此來維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，是機體的一種保護性反應(yīng)。半定量RT-PCR法mRNA水平gP96肺癌組織正常肺組織免疫組化法蛋白水平引物設(shè)計循環(huán)次數(shù)操作中注意：模板內(nèi)對照與正常組織相比，肺癌組織中編碼gp96的基因gP96的提取

提取gP96的經(jīng)典方法（Srivastava）：飽和硫酸銨沉淀刀豆球蛋白A親和層析DEAE離子交換層析（提取率估計在20-30%，蛋白提取量在15-150ug/g組織）存在的普遍問題：蛋白提取率低，尚無法滿足臨床需要解決：更改其中的試劑或步驟：

去除飽和硫酸銨沉淀過程，離子交換層析柱換用MonoQ或POROS20QE柱

增加組織中g(shù)P96含量：

熱刺激、缺氧等物理刺激或者通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入gP96cDNA重組真核表達質(zhì)粒以增加細胞中g(shù)P96合成量

gP96的提取提取gP96的經(jīng)典方法（SrivastavaDC的來源來源培養(yǎng)方法建立比較臍帶血1992腫瘤患者多無法獲得外周血

1994取材容易，操作簡單，，DC生成量大，純度高，可以反復(fù)進行，患者痛苦小，便于臨床應(yīng)用，是目前獲得DC的較理想的途徑。骨髓1995穿刺操作復(fù)雜，獲得細胞量少，需多點反復(fù)操作，可能會增加創(chuàng)傷，給患者造成極大的痛苦DC的來源來源培養(yǎng)方法建立比較臍帶血1992腫瘤患者多無法DC的分離和培養(yǎng)分離純化DC的方法物理方法根據(jù)細胞的黏附性進行分離黏附分離法、尼龍毛分離法和羰基碳分離法等根據(jù)細胞比重進行分離葡聚糖-泛影葡胺（Ficoll）密度梯度離心、Percoll非連續(xù)性/連續(xù)性密度梯度離心及E花環(huán)沉淀分離等方法免疫分選淘洗法、流式細胞技術(shù)、磁性細胞分離術(shù)等方法密度梯度離心獲取單個核細胞富集前體DC細胞因子體外擴增培養(yǎng)DC的分離和培養(yǎng)分離純化DC的方法物理方法根據(jù)細胞的黏附富集前體DC：去除粒、單核、T、B、NK和巨噬細胞方法特點黏附法直接黏附法對細胞干擾小，DC獲得率高間接黏附法培養(yǎng)體系小，節(jié)省細胞因子，細胞損傷大，DC獲得率低單抗法免疫磁珠和流式細胞技術(shù)需要大量的特殊抗體，細胞損失量大，價格昂貴，細胞因子作用必需GM-CSF促進DC增殖，是最基本的因子IL-4抑制中性粒細胞和巨噬細胞增殖爭議TNF-α促進DC成熟，抑制粒細胞產(chǎn)生Flt3L促進DC增殖，抑制DC分化其他LPS、CD40L、INF-β、INF-γ及IL-1β等富集前體DC：去除粒、單核、T、B、NK和巨噬細胞方法特點黏方法備注形態(tài)結(jié)構(gòu)相差顯微鏡、電鏡直觀分子表達CD1a、CD80、CD86、CD40和CD83等，特別是CD83--樹突狀細胞的標志性分子準確功能狀態(tài)混合淋巴細胞反應(yīng)DC的鑒定方法備注形態(tài)結(jié)構(gòu)相差顯微鏡、電鏡直觀分子表達CD1a、CD8關(guān)于動物腫瘤模型動物模型的優(yōu)越性：避免了在人身上進行實驗所帶來的風險臨床上少見疾病可用動物隨時復(fù)制出來研究周期短，節(jié)省時間，克服人類某些疾病潛伏期長，病程長和發(fā)病率低的缺點可在人為控制條件下進行實驗可以嚴格控制實驗條件，增強實驗材料的可比性取材方便，可以簡化實驗操作和樣品收集成本低有助于更全面地認識疾病的本質(zhì)關(guān)于動物腫瘤模型動物模型的優(yōu)越性：避免了在人身上進行實驗所帶按產(chǎn)生原因自發(fā)性腫瘤模型實驗動物未經(jīng)任何有意識的人工處置，在自然情況下所發(fā)生的疾病誘發(fā)性腫瘤模型使用物理的、化學(xué)的和生物的致病因素作用于動物誘發(fā)腫瘤移植性腫瘤模型人類腫瘤移植動物按系統(tǒng)范圍疾病的基本病理過程模型各種疾病共同的一些病理變化過程的模型各系統(tǒng)疾病模型與人類各系統(tǒng)疾病相應(yīng)的模型按模型種類整體模型離體器官和組織細胞株分類按產(chǎn)生原因自發(fā)性腫瘤模型實驗動物未經(jīng)任何有意識的人工處置已建立動物模型的人類腫瘤：肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、膠質(zhì)瘤等常用的動物：小鼠、大鼠、兔、雞胚等近交系小鼠：BALB/c、C57、C3H、615、T739、裸鼠、SCID小鼠等五十余種已建立動物模型的人類腫瘤：肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌SCID小鼠16號染色體近著絲點處單個隱性基因發(fā)生SCID突變基因重排異常免疫球蛋白重鏈T細胞抗原受體T、B淋巴細胞前體分化T、B淋巴細胞細胞免疫體液免疫免疫球蛋白缺如淋巴細胞嚴重減少對體外移植物免疫排斥低聯(lián)合缺陷+1983年Bosma免疫重建1988年Moiser骨髓胸腺脾胎肝外周血淋巴細胞腹腔皮下免疫系統(tǒng)恢復(fù)且具有人類免疫系統(tǒng)的特征SCID小鼠16號染色體近著絲點處單個隱性基因發(fā)生SCID突與人體內(nèi)環(huán)境極其類似保證了患者本身的安全帶有人類腫瘤具有人類免疫系統(tǒng)研究腫瘤生長的理想動物模型與人體內(nèi)環(huán)境極其類似帶有人類腫瘤研究腫瘤生長的理想動物模型gP96/DC在體外可誘發(fā)強烈的CTL反應(yīng)在體內(nèi)可有效抑制腫瘤生長

gP96+DC特異性+多價性避免了腫瘤的免疫逃逸探尋機制抗原肽（小分子）DCgP96+抗原肽CD91T淋巴細胞MHC分子、共刺激分子粘附分子gP96/DC在體外可誘發(fā)強烈的CTL反應(yīng)gP96+DC--體外擴增培養(yǎng)DC未成熟DC凋亡gP96成熟DC直接與T淋巴細胞接觸發(fā)生作用未接觸腫瘤抗原不需激活腫瘤抗原非專職抗原呈遞細胞抗原特異性免疫耐受專職抗原呈遞細胞特異性免疫防御反應(yīng)體外擴增培養(yǎng)DC未成熟DC凋亡gP96成熟DC直接與T淋巴細結(jié)論結(jié)論gP96/DC，在動物體內(nèi)可降低腫瘤成瘤率，明顯抑制腫瘤生長，延長宿主生存時間屬于個體化治療方案，是未來原發(fā)腫瘤切除后微小轉(zhuǎn)移灶的預(yù)防和治療的有效措施之一

gP96在肺癌組織中RNA和蛋白水平的表達明顯高于正常肺組織gP96/DC疫苗在體外可激發(fā)更強烈的CTL反應(yīng)，刺激T淋巴細胞增殖，CD8+/CD4+細胞比例增加，并使T淋巴細胞IFN-γ分泌明顯增加gP96/DC，在動物體內(nèi)可降低腫瘤成瘤率，明顯抑制腫瘤生長gP96多肽復(fù)合物／樹突狀細胞

疫苗的實驗研究gP96多肽復(fù)合物／樹突狀細胞

疫苗的實驗研究北京大學(xué)人民醫(yī)院胸部微創(chuàng)中心胸外科博士研究生：李運導(dǎo)師：王俊教授

gP96多肽復(fù)合物／樹突狀細胞

疫苗的實驗研究gP96多肽復(fù)研究背景研究背景全世界肺癌病例1910年<200例1912年374例1920年956例（美國）新增肺癌病例肺癌死亡病例1997年178，100160，4002002年169，400154，9002003年171，900157，200發(fā)病占全部腫瘤發(fā)生的15%，死亡占全部因腫瘤死亡病例的29%全世界肺癌病例1910年<200例1912年374例1920整體療效與30年前比較沒有明顯提高，總的五年生存率仍不足15%整體療效與30年前比較沒有明顯提高，總的五年生存率仍不足15腫瘤抗原免疫系統(tǒng)特異性抗原識別破壞和消滅腫瘤細胞抗原呈遞系統(tǒng)腫瘤抗原免疫系統(tǒng)特異性抗原識別破壞和消滅腫瘤細胞抗原呈遞系統(tǒng)HSPs具有結(jié)合細胞內(nèi)抗原性多肽的能力，可以帶有腫瘤細胞內(nèi)全部抗原肽具有該細胞特有的抗原庫的作用,稱為“分子伴侶”抗原gP96HSPs具有結(jié)合細胞內(nèi)抗原性多肽的能力，可以帶有腫瘤細胞內(nèi)全經(jīng)典的外源性抗原呈遞途徑gP96介導(dǎo)的外源性抗原呈遞途徑通過MHC-II類分子激活CD4+T淋巴細胞通過MHC-I類分子激活CD8+T淋巴細胞經(jīng)典的外源性抗原呈遞途徑gP96介導(dǎo)的外源性抗原呈遞途徑通過途徑激發(fā)人體有效的特異性抗腫瘤免疫功能樹突狀細胞體內(nèi)最強的抗原呈遞細胞途徑激發(fā)人體有效的特異性抗腫瘤免疫功能樹突狀細胞體內(nèi)+>>gP96orDC科研工作新問題單方面要素兩方面要素gP96多價性特異性（抗原庫）DC識別抗原激活細胞免疫（專職抗原呈遞細胞）+>>gP96orDC科研工作新問題單方面要素兩方面研究內(nèi)容研究內(nèi)容肺癌組織提取gP96SDS—PAGE凝膠電泳、銀染鑒定、Western印跡分析蛋白定量分析RT-PCR檢測RNA水平表達免疫組化檢測蛋白水平表達第一部分gp96多肽復(fù)合物提取鑒定在肺癌組織中表達的研究肺癌組織gP96提取和鑒定；肺癌組織和正常組織gP96的表達水平；[目的][流程]肺癌組織提取gP96第一部分gp96多肽復(fù)合物提取鑒定定量分析測得所提取的gp96蛋白濃度在0.1μg/ul左右，相當于50-80ug/g組織。定量分析測得所提取的gp96蛋白濃度在0.1μg/ul左右，肺癌組織細胞漿中有棕黃色顆粒聚集

正常肺組織中細胞蘇木素染色陰性

同一患者標本

GeneN(x±s)T(x±s)tvaluepvaluegp960.6725±0.47131.110±0.4467-4.318<0.001肺癌組織細胞漿中有棕黃色顆粒聚集正常肺組織中細胞蘇木素染色外周血單個核細胞提取及體外擴增流式細胞儀鑒定gP96與樹突狀細胞共孵育制備疫苗體外CTL反應(yīng)，INF-γ濃度淋巴細胞表型分析第二部分gP96多肽復(fù)合物/DC疫苗體外誘導(dǎo)CTL反應(yīng)實驗研究外周血來源DC培養(yǎng)和鑒定gP96多肽復(fù)合物/DC疫苗的制備gP96/DC體外實驗

[目的][流程]外周血單個核細胞提取及體外擴增第二部分gP96多肽復(fù)合培養(yǎng)2-3天后的DC

培養(yǎng)7天后的DC

培養(yǎng)2-3天后的DC培養(yǎng)7天后的DCA-1．培養(yǎng)前CD1a-A-2.培養(yǎng)后CD1a+

B-1.培養(yǎng)前CD86-B-2.培養(yǎng)后CD86+C-1.培養(yǎng)前CD83-C-2.培養(yǎng)后CD83+D-1.培養(yǎng)前CD80-D-2.培養(yǎng)后CD80+E-1.培養(yǎng)前CD14+E-2.培養(yǎng)后CD14-

CD14-；CD80+；CD83+；CD86+

A-1．培養(yǎng)前CD1a-A-2.培養(yǎng)后CD1培養(yǎng)前淋巴細胞的CD3培養(yǎng)10d后淋巴細胞的CD3培養(yǎng)前淋巴細胞的CD4、CD8培養(yǎng)10d淋巴細胞的CD4、CD8CD3/CD8＋T細胞明顯增加；CD8＋/CD4＋細胞比例增加培養(yǎng)前淋巴細胞的CD3樣本ELISA反應(yīng)的OD值(X±S)釋放IFN-γ的量（pg/ml）gp96/DC2.244±0.1334150.835gp961.674±0.1623066.847DC0.126±0.011122.966樣本ELISA反應(yīng)的OD值(X±S)釋放IFN-γ的量（pg建立動物模型以制備的疫苗免疫動物并種植腫瘤觀察成瘤率，腫瘤體積，動物生存時間第三部分gP96多肽復(fù)合物/DC疫苗

動物體內(nèi)實驗研究

gP96/DC在小鼠體內(nèi)的抑制腫瘤生長作用的研究[目的][流程]建立動物模型第三部分gP96多肽復(fù)合物/DC疫苗gPgP96多肽復(fù)合物／樹突狀細胞疫苗研究課件LA795肺癌腫瘤組織提取Gp96小鼠外周血615小鼠肺癌模型Gp96/DC，Gp96，DC提取DC細胞觀察腫瘤生長情況及對小鼠生存期的影響LA795肺癌腫瘤組織提取Gp96小鼠外周血615小鼠肺癌模SCID小鼠PAa肺癌腫瘤組織提取Gp96人外周血免疫重建小鼠荷人肺癌免疫重建小鼠Gp96/DC疫苗提取DC細胞觀察腫瘤生長情況及對小鼠生存期的影響SCID小鼠PAa肺癌腫瘤組織提取Gp96人外周血免疫重建小100%75%615小鼠腫瘤植入后不同時間的腫瘤體積（x±scm3）組數(shù)處理動物數(shù)腫瘤植入后天數(shù)212835Ⅰ種植102.63±0.876.46±1.478.04±1.40ⅡGP9680.33±0.27※0.70±0.62※1.49±1.17※ⅢDC80.30±0.22※0.64±0.49※1.16±0.92※ⅣGP96+DC80.21±0.22※△0.32±0.30※△0.62±0.30※△615LA795※：與Ⅰ組比較，P<0.05?！鳎号cⅡ組和Ⅲ組比較，P<0.05

100%75%615小鼠腫瘤植入后不同時間的腫瘤體積（x±s※：與Ⅰ組比較，P<0.05?！鳎号cⅡ組和Ⅲ組比較，P<0.05

615小鼠腫瘤植入后的生存時間組數(shù)處理動物數(shù)腫瘤植入后生存天數(shù)Ⅰ種植1052ⅡGP96851.5ⅢDC858.5※ⅣGP96+DC877※△※：與Ⅰ組比較，P<0.05。615小鼠腫瘤植入后的生存時SCIDPAa※：與Ⅰ組比較，P<0.05?！鳎号cⅡ組和Ⅲ組比較，P<0.05

SCID小鼠腫瘤植入后不同時間的腫瘤體積(X±Scm3)組數(shù)處理動物數(shù)腫瘤植入后天數(shù)212832Ⅰ重建160.38±0.120.75±0.300.90±0.33ⅡGP9680.09±0.06※0.17±0.06※0.22±0.11※ⅢDC80.08±0.06※0.15±0.08※0.24±0.11※ⅣGP96+DC80.03±0.03※△0.08±0.08※△0.12±0.13※△87.5%100%SCIDPAa※：與Ⅰ組比較，P<0.05。SCIDSCID小鼠腫瘤植入后的生存時間組數(shù)處理動物數(shù)腫瘤植入后生存天數(shù)Ⅰ重建1637ⅡGP96852※ⅢDC852.5※ⅣGP96+DC8＞62※△SCID小鼠腫瘤植入后的生存時間組數(shù)處理動物數(shù)腫瘤植入后生存gP96多肽復(fù)合物／樹突狀細胞疫苗研究課件討論討論gP96在肺癌中的表達基因表達的檢測

mRNA水平：原位雜交、NorthernBlot、核酸酶保護分析Real-timeRT-PCR、、半定量RT-PCR。蛋白水平。

方法比較原位雜交僅能提供mRNA在細胞內(nèi)的定位信息，不能確定mRNA的含量，受人為因素影響大，無法檢測極微量的mRNANorthernBlot敏感性低，樣品用量大，對實驗條件要求高，需要應(yīng)用放射性物質(zhì)，不適合檢測低豐度的mRNAReal-timeRT-PCR儀器和試劑盒價格昂貴，標準物難以獲得核酸酶保護分析操作復(fù)雜，價格昂貴半定量RT-PCR

高度敏感、準確、簡便、快捷、對儀器要求低、可重復(fù)性強、易于掌握gP96在肺癌中的表達基因表達的檢測mRNA水平：原位雜交與正常組織相比，肺癌組織中編碼gp96的基因在mRNA水平的表達明顯增高的。這進一步證實了在罹患腫瘤時，以gp96為代表的HSPs合成明顯增加，這是機體受到腫瘤刺激產(chǎn)生的熱休克反應(yīng)，以此來維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，是機體的一種保護性反應(yīng)。半定量RT-PCR法mRNA水平gP96肺癌組織正常肺組織免疫組化法蛋白水平引物設(shè)計循環(huán)次數(shù)操作中注意：模板內(nèi)對照與正常組織相比，肺癌組織中編碼gp96的基因gP96的提取

提取gP96的經(jīng)典方法（Srivastava）：飽和硫酸銨沉淀刀豆球蛋白A親和層析DEAE離子交換層析（提取率估計在20-30%，蛋白提取量在15-150ug/g組織）存在的普遍問題：蛋白提取率低，尚無法滿足臨床需要解決：更改其中的試劑或步驟：

去除飽和硫酸銨沉淀過程，離子交換層析柱換用MonoQ或POROS20QE柱

增加組織中g(shù)P96含量：

熱刺激、缺氧等物理刺激或者通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入gP96cDNA重組真核表達質(zhì)粒以增加細胞中g(shù)P96合成量

gP96的提取提取gP96的經(jīng)典方法（SrivastavaDC的來源來源培養(yǎng)方法建立比較臍帶血1992腫瘤患者多無法獲得外周血

1994取材容易，操作簡單，，DC生成量大，純度高，可以反復(fù)進行，患者痛苦小，便于臨床應(yīng)用，是目前獲得DC的較理想的途徑。骨髓1995穿刺操作復(fù)雜，獲得細胞量少，需多點反復(fù)操作，可能會增加創(chuàng)傷，給患者造成極大的痛苦DC的來源來源培養(yǎng)方法建立比較臍帶血1992腫瘤患者多無法DC的分離和培養(yǎng)分離純化DC的方法物理方法根據(jù)細胞的黏附性進行分離黏附分離法、尼龍毛分離法和羰基碳分離法等根據(jù)細胞比重進行分離葡聚糖-泛影葡胺（Ficoll）密度梯度離心、Percoll非連續(xù)性/連續(xù)性密度梯度離心及E花環(huán)沉淀分離等方法免疫分選淘洗法、流式細胞技術(shù)、磁性細胞分離術(shù)等方法密度梯度離心獲取單個核細胞富集前體DC細胞因子體外擴增培養(yǎng)DC的分離和培養(yǎng)分離純化DC的方法物理方法根據(jù)細胞的黏附富集前體DC：去除粒、單核、T、B、NK和巨噬細胞方法特點黏附法直接黏附法對細胞干擾小，DC獲得率高間接黏附法培養(yǎng)體系小，節(jié)省細胞因子，細胞損傷大，DC獲得率低單抗法免疫磁珠和流式細胞技術(shù)需要大量的特殊抗體，細胞損失量大，價格昂貴，細胞因子作用必需GM-CSF促進DC增殖，是最基本的因子IL-4抑制中性粒細胞和巨噬細胞增殖爭議TNF-α促進DC成熟，抑制粒細胞產(chǎn)生Flt3L促進DC增殖，抑制DC分化其他LPS、CD40L、INF-β、INF-γ及IL-1β等富集前體DC：去除粒、單核、T、B、NK和巨噬細胞方法特點黏方法備注形態(tài)結(jié)構(gòu)相差顯微鏡、電鏡直觀分子表達CD1a、CD80、CD86、CD40和CD83等，特別是CD83--樹突狀細胞的標志性分子準確功能狀態(tài)混合淋巴細胞反應(yīng)DC的鑒定方法備注形態(tài)結(jié)構(gòu)相差顯微鏡、電鏡直觀分子表達CD1a、CD8關(guān)于動物腫瘤模型動物模型的優(yōu)越性：避免了在人身上進行實驗所帶來的風險臨床上少見疾病可用動物隨時復(fù)制出來研究周期短，節(jié)省時間，克服人類某些疾病潛伏期長