實驗九 水中總大腸菌群的測定課件

實驗九水中總大腸菌群的測定一實驗器材1培養(yǎng)基乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內(nèi)有倒置小套管）培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂平板2溶液和試劑革蘭氏染色液3儀器和其他用品高壓濕熱滅菌器、顯微鏡、載玻片、滅菌培養(yǎng)皿、滅菌吸管、試管、三角瓶、接種環(huán)二目的要求1學習檢測水中總大腸菌群的方法。2了解檢測水中總大腸菌群各種方法的原理及其應用中的優(yōu)、缺點。3了解水質(zhì)評價的微生物學衛(wèi)生標準，明白其應用的重要性。實驗八水中總大腸菌群的測定三基本原理

大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能?？偞竽c菌群可用多管發(fā)酵法或濾膜法檢驗。多管發(fā)酵法的原理是根據(jù)大腸菌群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，以及具備革蘭氏染色陰性，無芽孢，呈桿狀等有關(guān)特性，通過三個步驟進行檢驗求得水樣中的總大腸菌群數(shù)。試驗結(jié)果以最可能數(shù)簡稱MPN表示。食品中大腸菌群數(shù)系以100mL(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（mostprobablenumber,MPN)表示。用漏斗分裝培養(yǎng)基及擺斜面培養(yǎng)基的分裝：一般制作斜面培養(yǎng)基時，每只15×150毫米的試管，約裝3～4毫升（1/4～1/3試管高度），如制作深層培養(yǎng)基，每只20×220毫米的試管約裝12～15毫升。每只錐形瓶裝入的培養(yǎng)基，一般以其容積的一半為宜。

◆包扎1．培養(yǎng)皿：以舊報紙密密包緊，一般以6套做一包，待滅菌。2．吸管：在距其粗頭頂端約0.5cm處，塞一小段1.5cm長的棉花。棉花要塞得松緊恰當（過緊，吹吸液體太費勁；過松，吹氣時棉花會下滑），然后分別將每支吸管尖端斜放在舊報紙條的的近左端，與報紙約呈60o角，并將右端多余的報紙打一小結(jié)。3．三角玻扒：跟包扎吸管相似，將三角部分斜放在報紙條的近左端，與報紙約呈45o角，并將右端多余的報紙打一小結(jié)。4.玻璃器皿、金屬器械包扎完畢后置干燥箱160－170℃滅菌2h.高壓蒸汽自動滅菌鍋手提式高壓蒸汽滅菌鍋五操作步驟1水樣的采?。?）檢測自來水先將自來水龍頭用火焰燒灼3min滅菌，再開放水龍頭使水流5min后，在火焰旁打開滅菌三角瓶塞，以其接取水樣，迅速地進行分析。

（2）檢測池水、河水或湖水應取距水面10－15cm的深層水樣，先將滅菌帶玻璃塞的空瓶瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，撥開玻璃塞，水即流入瓶中，滿后將玻璃塞塞好，再從水中取出。有時需用特制的采樣器取水樣。采取的水樣最好立即檢測，否則需放入冰箱中保存。4分離培養(yǎng)將初發(fā)酵的陽性管(產(chǎn)酸產(chǎn)氣)的菌液分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基平板。置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18～24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)。選擇符合大腸菌群菌落特征的菌落:①深紫黑色，有金屬光澤；②紫黑色，不帶或略帶金屬光澤；③淡紫紅色，中心顏色較深,挑取一部分，進行革蘭氏染色。

平板劃線分離操作法示意圖5復發(fā)酵試驗上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，則挑選該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒置管），每管可接種分離自同一初發(fā)酵管的最典型菌落1～3個，然后置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣者，即證實有大腸菌群存在。根據(jù)證實有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數(shù)查附表1“大腸菌群檢數(shù)表”，報告每升水樣中的大腸菌群數(shù)。每組：三倍濃縮乳糖蛋白胨（5ml）15管普通濃度乳糖蛋白胨（10ml）15管伊紅美蘭培養(yǎng)基150ml(5個平板)三角瓶1個（裝27mL蒸餾水滅菌）、10ml吸管2支、1ml吸管2支包扎滅菌表2最可能數(shù)(MPN)表

（接種5份10mL水樣、5份1mL水樣、5份0.1mL水樣時，不同陽性及陰性情況下100mL水樣中細菌數(shù)的最可能數(shù)和95%可信限值）

思考題1.何謂大腸菌群？它主要包括哪些細菌屬？2.假如水中有大量致病菌，如：痢疾、傷寒、霍亂等病原菌，用多管發(fā)酵法檢測總大腸菌群，能否得到陽性