熒光原位雜交FISH實驗步驟與方法

FISH實驗步驟一、實驗儀器：熒光顯微鏡:高速離心機：可達12000r/min高壓滅菌鍋：160°C以上殺菌恒溫箱：為雜交提供恒定溫度恒溫水浴鍋照相機（與熒光顯微鏡配套）：熒光捕捉圖片二、試劑的配制：1、 0.2mol/L（pH7.4）磷酸緩沖溶液（PB）試劑為NaHP0?2H0和NaHP0?12H0。TOC\o"1-5"\h\z2 4 2 2 4 2 0.2M的NaHP0溶液：31.2gNaHP0?2H0,加蒸餾水1000mL溶解2 4 2 4 2 0.2M的NaHP0溶液：71.632gNaHP0?12H0加蒸餾水至1000ml溶解2 4 2 4 2——0.2M（pH7.4）磷酸緩沖溶液（PB）:19ml的NaHP0溶液和81ml的NaHP0溶液充分2 4 2 4混合高壓滅菌，常溫保存。2、 0.03mol/L磷酸鹽緩沖溶液（（PBS）試劑為NaCl和磷酸緩沖溶液PB 0.03MPBS溶液：22.8gNaCl,150ml磷酸緩沖溶液（PB），加蒸餾水至1000ml,混勻 0.02MPBS溶液:取100ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至150ml 0.01MPBS溶液:取50ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至150ml高壓滅菌，常溫保存。3、 4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通風櫥內進行操作） 將略小于2/3體積的水（660ml）加熱到50C， 40g多聚甲醛PFA，邊攪拌邊加入到水中，繼續(xù)保持60C 1滴2mol/LNa0H溶液，立即澄清，但仍有小顆粒。 1/3體積的PBS溶液， 用Hcl將pH調至7.2，定容， 用孔徑為0.22um的濾膜過濾，——4C保存最多保存兩天，或者取少量保存在-20C。（加熱時溫度不宜過高，為60C-65C，否則PFA容易降解，配置好后應盡快使用，否則固定效果較差）。4、 1mol/L（pH8.0）Tris-HCl緩沖液的配置―-121.1gTris（三羥基氨基甲烷），加800mL蒸餾水溶解，加入大約42mL的濃HCl―-用1M的HCl或lM的NaOH將pH調至&0,最后加蒸餾水至1000Ml高壓滅菌，4C冰箱保存。5、 10%SDS―-10gSDS（十二烷基硫酸鈉）于50ml滅菌水中，加水至100ml,分裝后室溫保存。滅菌，或用濾膜過濾稱取SDS時需戴口罩！6、 0.5MEDTA(pH8.0)溶液的配置——186.1g乙二胺四乙酸二鈉加800mL蒸餾水溶解，劇烈攪拌(最好使用磁力攪拌機) 用NaOH調節(jié)溶液的pH至&0,然后定容至1000mL。7、 雜交緩沖液配置2ml雜交緩沖液于2ml離心管中，各試劑的加入順序：360uL5MNaCl；40uL1MTris—HClxuL100％甲酰胺(見下表)yuL無菌水(見下表)2uL10％SDS0.22um孔徑的濾膜過濾，4°C保存。表1配置不同甲酰胺雜交液中甲酰胺和無菌水的體積甲酰胺濃度(％) 甲酰胺體積x(uL) 無菌水體積y(uL)TOC\o"1-5"\h\z0 0 15985 100 149810 200 139815 300 129820 400 119825 500 109830600998357008984080079845 900 698501000598551100498甲酰胺有劇毒，操作時需戴手套，在通風處內進行，廢液需要回收)不同甲酰胺雜交液的配制甲酰胺濃度(%)5MNaCl溶液(mL)1MTris-HCl(mL)10%SDS(mL)甲酰胺體積x(mL)無菌水體積y(mL)207280.480239.6357280.4140179.6407280.4160159.6557280.422099.68、雜交后洗滌液的配置配制50mL雜交洗滌液于50mL離心管中，各試劑加入的順序如下:ZuL5MNaCl1mL1MTris-HCl(pH7.6)無菌水加至50mL50uL10％SDS500卩LEDTA表2 根據(jù)雜交緩沖液中甲酰胺濃度而定的探針清洗液液中NaCl體積數(shù)甲酰胺濃度％ NaCl體積z(uL) NaCl最終濃度(mM)TOC\o"1-5"\h\z0 9000 9005 6400 64010 4600 46015 3280 32820 2250 22525 1590 15945 400 4050280285520020不同甲酰胺對應的洗滌液的配制甲酰胺濃度(%)1MTris-HCl(mL)10%SDS(mL)0.5MEDTA(mL)5MNaCl溶液(mL)尢菌水體積(mL)2080.4418369.63580.446.4381.24080.444.48383.125580.441.63869、4',6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid(DAPI)常備：1mgM-i需要稀釋為：1AgM-i滅菌儲存在-20°C(用鋁箔覆蓋管子)DAPI可誘變致癌，所以在使用時要戴手套并且收集廢液，包括早使用移液管時。為了避免使用時對溶液造成污染，所有的溶液應取出置于50ml管中，夠每天使用的量。三、實驗步驟：1、玻片的預處理：玻片預處理1)玻片清洗：載玻片與蓋玻片用熱肥皂水刷洗干凈，在實驗室可用超聲清洗代替刷洗(4~5次每次10min),然后用清水浸泡過夜；2)硅化處理：第二天換用1%的鹽酸浸泡24小時,然后用蒸餾水清洗干凈后放入高壓滅菌鍋滅菌，60°C烘干。蓋玻片用錫紙包好4°C保存?zhèn)溆?。（蓋玻片干凈即可，不用處理）（2）黏附劑涂片制備載玻片放入APES與丙酮的1:50溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）中約lmin，取出用高壓滅菌處理過的蒸餾水清洗后于室溫下干燥（也可放入烘箱里25°C烘干），然后置4°C保存?zhèn)溆?、 熒光探針的選擇和標記（見fish探針的選擇表）3、 樣品的制備與固定（1） 用已滅菌的聚乙烯取樣管取反應器內泥水混合液1mL，加適量滅菌蒸餾水振蕩混勻，并用超聲波處理使細菌分散。取處理后的懸濁液約0.5ml進行后續(xù)處理。（2） 將懸濁液混合均勻后，按1:1加入4%多聚甲醛，于4C固定24小時，（3） 然后置于12000r/min離心5min去除固定劑，將固定樣本加入1ml0.0lmol/LPBS以10000r/min的速度離心漂洗兩次，棄去上清液。（4） 采用PBS與乙醇的1:1溶液稀釋定容至1ml于20C保存?zhèn)溆?、 樣品的預處理（1） 用微型振蕩器將樣品混合均勻，取10ul樣品在載玻片上涂抹20mmX20mm大?。ú灰螅?7C的烘箱熱固定2h,最高溫度不超過60C（2） 風干后于50%、80%、95%的乙醇中各脫水3min，自然風干。（脫水：準備三個瓷盤，然后將載玻片取出依次放入瓷盤中，50用%乙醇淹沒載玻片，脫水3min，取岀放入第二、三個瓷盤，然后用0%乙醇脫水，96%乙醇脫水。脫水后的80%、96%乙醇回收。）脫水后的玻片可以在室溫下保存幾個月，可在-20C的條件下保存幾個月5、 原位雜交探針濃度為50ng/uL，在密閉的雜交盒內鋪滿吸水紙（經高壓滅菌烘干），用雜交液濕潤，使雜交環(huán)境保持一定的濕度。用移液槍分別取24uL的雜交液和1UL探針滴入帶有樣品的載玻片上（均勻覆蓋涂片面積），（加蓋硅化蓋玻片，不用）放入雜交盒內進行雜交反應。雜交溫度與雜交時間如下。所有有關探針的操作在處理時都應避光處理！探針種類溫度（C）時間（h）甲酰胺濃度％備注EUBMIX46520同步染色法AOBMIX46355重復染色法NOBMIX46540重復染色法GAOMIX462.530同步染色法HGC69a462.530同步染色法PAO651462.530同步染色法6、 雜交后洗滌從恒溫箱中取出玻片之前將盛有清洗液的容器放入到48C的水浴中預熱20分鐘。雜交完成后取出玻片，立即放入到預熱好的容器中。注意不能讓玻片干燥，不然將很難洗去非特異性結合的信號，增加背景染色。清洗液的量應當淹沒玻片，清洗15?20分鐘后取出，用清水洗去剩余的清洗液，然后室溫下晾干。7、 DAPI染色

每個玻片用lO^LDAPI（用甲醇稀釋至l^g/UL）滴加到載玻片樣品上，在冰上染色lOmin,用水沖洗多次，室溫下自然晾干，鏡檢前加蓋蓋玻片。8、熒光顯微鏡觀察經過以上處理的樣品，用熒光顯微鏡進行觀察。探針目標菌群探針序列甲酰胺濃度修飾EUB338DomainBacteriaGCTGCCTCCCGTAGGAGT20%HEXNSO190Ammonia-oxidizingbacteriaCGATCCCCTGCTTTTCTCC55%HEXNIT3CCTGTGCTCCATGCTCCGFITCNitrite-oxidizingbacteria40%cNIT3bCCTGTGCTCCAGGCTCCGGA0Q989CompetibacterTTCCCCGGATGTCAAGGC35%Cy5TMHGC69aActinobacteriaTATAGTTACCACCGCCGT25%FITCPA0651AccumulibacterCCCTCTGCCAAACTCCAG35%Cy3TMDenitrifierCGGGAGGCAGCAGT35%FAM注：a探針濃度均為50ng/uL；bcNIT3為硝酸菌探針NIT3的競爭探針。AbbreviationmaximumabsorptionMaximumemissionFiltersetFITC（綠色）492nm528nm10(Zeiss)DAPI（藍色）365nm418nm02(Zeiss)CY3（橙色/紅色）554nm570nm15(Zeiss)CY5（紅外線檢測）650nm667nm26(Zeiss)HEX探針的選用選用EUBMIX（EUB338、EUB338II、EUB338III）來檢測活性污泥中的全部的細菌。選用PAOMIX來檢測活性污泥中的聚磷菌，選用AOBMIXNOBMIX來檢測活性污泥中的硝化菌。選用GAOMIX探針來檢測活性污泥中的聚糖菌，選用HGC69a探針來檢測反硝化聚磷菌的優(yōu)勢菌種Actinobacteria,用PAO651來檢測優(yōu)勢菌種Rhodocyclus,雜交后用4?,6-diamidino