鼠疫病原學檢驗的實驗室質(zhì)量控制課件

鼠疫病原學檢驗的實驗室質(zhì)量控制寧夏疾病預防控制中心人畜共患病實驗室2014年4月1日鼠疫病原學檢驗的實驗室質(zhì)量控制寧夏疾病預防控制中心1鼠疫病原學檢驗的實驗室質(zhì)量控制質(zhì)量控制的定義鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法鼠疫病原學檢驗方法動物間鼠疫疫情的實驗室復判鼠疫病原學檢驗的實驗室質(zhì)量控制質(zhì)量控制的定義2實驗室質(zhì)量控制的定義實驗室質(zhì)量控制的定義3實驗室質(zhì)量控制的定義質(zhì)量控制(QualityContro,lQ.C)是監(jiān)視全過程,排除誤差,防止變化,維持標準化現(xiàn)狀的一個管理過程。

鑒于鼠疫細菌學檢驗的重要性,有必要對其進行規(guī)范化管理。鼠疫細菌學檢驗質(zhì)控(QualityControloftestYersiniaPestis)是鼠疫微生物學實驗室為了保證檢驗結果實事求是地反映客觀存在而建立的操作程序體系。實驗室質(zhì)量控制的定義質(zhì)量控制(QualityContro,l4鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法5室內(nèi)質(zhì)控(InternalQualityControlIQC)是指一個實驗室內(nèi)部對所有影響質(zhì)量的各個環(huán)節(jié)進行系統(tǒng)控制，是由實驗室內(nèi)部制定并實施的，是質(zhì)量保證的核心和基礎。目的是控制本實驗室常規(guī)工作的精密度，提高常規(guī)工作前后的一致性。室間質(zhì)控(ExternalQualityAssessment簡稱EQA)簡稱室間質(zhì)評。室間質(zhì)控由上級業(yè)務單位采用一系列的辦法連續(xù)地、客觀地評價各實驗室的試驗結果，并發(fā)現(xiàn)室內(nèi)質(zhì)控不易發(fā)現(xiàn)的不準確性，了解各實驗室之間結果的差異，并幫助校正，使具有可比性，這種評價是一種回顧性評價。室內(nèi)質(zhì)控主要監(jiān)測試驗結果的精密度，而室間質(zhì)控主要控制實驗結果的準確度，不互相替代，參與室間質(zhì)控的試驗室應先做好室內(nèi)質(zhì)控。鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法室內(nèi)質(zhì)控(InternalQualityControl6鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法人員與組織管理儀器設備的質(zhì)控疑似鼠疫材料的采取、保存和運輸培養(yǎng)基、染色液、試劑盒等的質(zhì)量控制鼠疫細菌檢驗程序及結果判定報告卡的書寫、疫情上報及交換室內(nèi)質(zhì)控鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法人員與組織管理儀器設備的質(zhì)控疑似7室內(nèi)質(zhì)控扎實的基礎教育和專業(yè)知識職業(yè)道德和高度的責任心質(zhì)量管理體系各實驗室制定SOP專業(yè)化的技能培訓繼續(xù)教育人員與組織管理室內(nèi)質(zhì)控扎實的基礎教育和專業(yè)知識職業(yè)道德和高度的責任心質(zhì)量管8室內(nèi)質(zhì)控性能試驗正確貯存無菌試驗診斷試劑盒(噬菌體等)培養(yǎng)基量pH值試劑的質(zhì)量控制室內(nèi)質(zhì)控性能試驗正確貯存無菌試驗診斷試劑盒(噬菌體等)培養(yǎng)9室內(nèi)質(zhì)控生物安全柜顯微鏡高壓鍋離心機培養(yǎng)箱冰箱儀器設備室內(nèi)質(zhì)控生物安全柜顯微鏡高壓鍋離心機培養(yǎng)箱冰箱儀器設備10鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法設立參比實驗室發(fā)質(zhì)控物進行檢查評價定期舉辦各級培訓班派觀察員到實驗室進行檢查指導室間質(zhì)控方法鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法設立參比實驗室發(fā)質(zhì)控物進行檢查評11室間質(zhì)控的一般檢查項目實驗室的布局SOP制訂及執(zhí)行情況實驗室安全防護和污染物處理室內(nèi)質(zhì)控執(zhí)行情況及各種紀錄發(fā)放模擬標本(菌種)，規(guī)定時間內(nèi)反饋至上級業(yè)務單位

以pH值、軟硬度、鼠疫菌生長數(shù)量(活菌數(shù))等為綜合指標對培養(yǎng)基進行質(zhì)控和用已知菌對噬菌體進行質(zhì)控盲點試驗，模擬標本混入監(jiān)測標本常規(guī)測定對結果進行評價，分析錯誤原因室間質(zhì)控的一般檢查項目實驗室的布局12鼠疫病原學檢驗方法鼠疫病原學檢驗方法13鼠疫病原學檢驗方法染色鏡檢培養(yǎng)特性噬菌體裂解動物實驗基因檢測鼠疫病原學檢驗方法染色鏡檢14鼠疫病原學檢驗方法鼠疫病原體發(fā)現(xiàn)：1894年，在香港，日本學者北里柴三郎和法國學者亞力山大耶爾森二氏。分類位置：腸桿菌科耶爾森菌屬。生物學特性分子生物學特性：6MD、45MD、65MD三種質(zhì)粒；目前已知IS100、IS285、IS1541、IS1661四種插入序列，分布于鼠疫菌質(zhì)粒的染色體基因組中。毒力決定因子:F1抗原，VWa抗原，Pstl，Pgm分型:古典、中世紀、東方、田鼠變種四個生物變種；5個群（A、B、C、D、E群），21個生態(tài)型。鼠疫病原學檢驗方法鼠疫病原體15

染色鏡檢革蘭氏染色美蘭染色典型的鼠疫菌是短而粗、兩端鈍圓、兩極濃染的橢圓形小桿菌，革蘭氏染色陰性。染色鏡檢革蘭氏染色典型的鼠疫菌16細菌培養(yǎng)細菌培養(yǎng)17

病原學在普通培養(yǎng)基上28－30℃經(jīng)24h，肉眼可見形成薄薄一層淡灰色小菌落,圓形，有光澤，中心稍突起。透過光線呈灰白色或淡青色，菌落較干燥，鏡下：中央隆起中心發(fā)暗，有粗糙顆粒（黃褐色）周圍有薄而透明的花邊，呈鋸齒狀。培養(yǎng)特性病原學在普通培養(yǎng)基上28－30℃經(jīng)18Y.PEVY.E耶爾森菌屬三個致病菌形態(tài)比較Y.PEVY.E耶爾森菌屬三個致病菌形態(tài)比較19噬菌體裂解實驗28－30℃24h噬菌帶明顯噬菌體裂解實驗28－30℃24h噬菌帶明顯20觀察1-9天，可以從感染動物體內(nèi)檢出鼠疫菌為陽性。動物實驗觀察1-9天，可以從感染動物體內(nèi)檢出鼠疫菌為陽性。動物實驗21鼠疫菌的基因檢測病原學的檢測鼠疫菌的基因檢測病22DNA提取水煮法提取可疑鼠疫菌DNA對于臟器標本，在強毒實驗室以無菌手續(xù)取動物的各種臟器(心、肝、脾、肺)約1g，加入到等量生理鹽水中，研碎，100℃水浴中煮沸10min，離心，取上清直接用作PCR模板對于培養(yǎng)可疑鼠疫菌，在平板上刮取可疑鼠疫菌于裝有500ul蒸餾水（生理鹽水）的1.5ml離心管中，于沸水浴中煮10min，離心上清液中含有可疑鼠疫菌DNA作為PCR模板。細菌基因組DNA提取試劑盒提取鼠疫菌基因組DNA操作方法可根據(jù)試劑盒說明書進行操作。鼠疫菌的基因檢測DNA提取鼠疫菌的基因檢測23體系配制PCR-bufferdNTP引物（2對各1ul）TaqDNA聚合酶模板純水總體積25ul2.5ul2ul4ul1ul（2.5U)1ul14.5ul鼠疫菌的基因檢測體系配制PCR-bufferdNTP引物（2對各1ul）T24PCR擴增93℃5min90℃1min60℃1min72℃1min30cycle72℃10min4℃保存鼠疫菌的基因檢測PCR擴增93℃5min90℃1min60℃25瓊脂糖凝膠鼠疫菌的基因檢測瓊脂糖凝膠鼠疫菌的基因檢測26拍照鼠疫菌的基因檢測拍照鼠疫菌的基因檢測27臟器懸液基因檢測：FI特異性片249bp，Pla特異性片456bp臟器懸液基因檢測：FI特異性片249bp，Pla特異性片4528菌懸液基因檢測：FI特異性片249bp，Pla特異性片456bp菌懸液基因檢測：FI特異性片249bp，Pla特異性片45629PCR操作鼠疫菌株的復蘇、培養(yǎng)、傳代、核酸提取均在BSL-2實驗室操作其余PCR過程在普通實驗室操作PCR操作鼠疫菌株的復蘇、培養(yǎng)、傳代、核酸提取均在BSL-230動物間鼠疫疫情的實驗室復判動物間鼠疫疫情的實驗室復判31動物間鼠疫疫情的實驗室復判復判流程日常監(jiān)測膠體金抗體陽性間接血凝（抑制）陽性自斃鼠培養(yǎng)鑒定為陽性膠體金抗原陽性反向血凝（抑制）陽性培養(yǎng)鑒定為陽性報自治區(qū)疾控中心復判動物間鼠疫疫情的實驗室復判復判流程日常監(jiān)測膠體金抗體陽性間接32鼠疫病原學檢驗的實驗室質(zhì)量控制課件33謝謝大家！

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電子郵箱：x34鼠疫病原學檢驗的實驗室質(zhì)量控制寧夏疾病預防控制中心人畜共患病實驗室2014年4月1日鼠疫病原學檢驗的實驗室質(zhì)量控制寧夏疾病預防控制中心35鼠疫病原學檢驗的實驗室質(zhì)量控制質(zhì)量控制的定義鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法鼠疫病原學檢驗方法動物間鼠疫疫情的實驗室復判鼠疫病原學檢驗的實驗室質(zhì)量控制質(zhì)量控制的定義36實驗室質(zhì)量控制的定義實驗室質(zhì)量控制的定義37實驗室質(zhì)量控制的定義質(zhì)量控制(QualityContro,lQ.C)是監(jiān)視全過程,排除誤差,防止變化,維持標準化現(xiàn)狀的一個管理過程。

鑒于鼠疫細菌學檢驗的重要性,有必要對其進行規(guī)范化管理。鼠疫細菌學檢驗質(zhì)控(QualityControloftestYersiniaPestis)是鼠疫微生物學實驗室為了保證檢驗結果實事求是地反映客觀存在而建立的操作程序體系。實驗室質(zhì)量控制的定義質(zhì)量控制(QualityContro,l38鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法39室內(nèi)質(zhì)控(InternalQualityControlIQC)是指一個實驗室內(nèi)部對所有影響質(zhì)量的各個環(huán)節(jié)進行系統(tǒng)控制，是由實驗室內(nèi)部制定并實施的，是質(zhì)量保證的核心和基礎。目的是控制本實驗室常規(guī)工作的精密度，提高常規(guī)工作前后的一致性。室間質(zhì)控(ExternalQualityAssessment簡稱EQA)簡稱室間質(zhì)評。室間質(zhì)控由上級業(yè)務單位采用一系列的辦法連續(xù)地、客觀地評價各實驗室的試驗結果，并發(fā)現(xiàn)室內(nèi)質(zhì)控不易發(fā)現(xiàn)的不準確性，了解各實驗室之間結果的差異，并幫助校正，使具有可比性，這種評價是一種回顧性評價。室內(nèi)質(zhì)控主要監(jiān)測試驗結果的精密度，而室間質(zhì)控主要控制實驗結果的準確度，不互相替代，參與室間質(zhì)控的試驗室應先做好室內(nèi)質(zhì)控。鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法室內(nèi)質(zhì)控(InternalQualityControl40鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法人員與組織管理儀器設備的質(zhì)控疑似鼠疫材料的采取、保存和運輸培養(yǎng)基、染色液、試劑盒等的質(zhì)量控制鼠疫細菌檢驗程序及結果判定報告卡的書寫、疫情上報及交換室內(nèi)質(zhì)控鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法人員與組織管理儀器設備的質(zhì)控疑似41室內(nèi)質(zhì)控扎實的基礎教育和專業(yè)知識職業(yè)道德和高度的責任心質(zhì)量管理體系各實驗室制定SOP專業(yè)化的技能培訓繼續(xù)教育人員與組織管理室內(nèi)質(zhì)控扎實的基礎教育和專業(yè)知識職業(yè)道德和高度的責任心質(zhì)量管42室內(nèi)質(zhì)控性能試驗正確貯存無菌試驗診斷試劑盒(噬菌體等)培養(yǎng)基量pH值試劑的質(zhì)量控制室內(nèi)質(zhì)控性能試驗正確貯存無菌試驗診斷試劑盒(噬菌體等)培養(yǎng)43室內(nèi)質(zhì)控生物安全柜顯微鏡高壓鍋離心機培養(yǎng)箱冰箱儀器設備室內(nèi)質(zhì)控生物安全柜顯微鏡高壓鍋離心機培養(yǎng)箱冰箱儀器設備44鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法設立參比實驗室發(fā)質(zhì)控物進行檢查評價定期舉辦各級培訓班派觀察員到實驗室進行檢查指導室間質(zhì)控方法鼠疫病原學檢驗的質(zhì)量控制方法設立參比實驗室發(fā)質(zhì)控物進行檢查評45室間質(zhì)控的一般檢查項目實驗室的布局SOP制訂及執(zhí)行情況實驗室安全防護和污染物處理室內(nèi)質(zhì)控執(zhí)行情況及各種紀錄發(fā)放模擬標本(菌種)，規(guī)定時間內(nèi)反饋至上級業(yè)務單位

以pH值、軟硬度、鼠疫菌生長數(shù)量(活菌數(shù))等為綜合指標對培養(yǎng)基進行質(zhì)控和用已知菌對噬菌體進行質(zhì)控盲點試驗，模擬標本混入監(jiān)測標本常規(guī)測定對結果進行評價，分析錯誤原因室間質(zhì)控的一般檢查項目實驗室的布局46鼠疫病原學檢驗方法鼠疫病原學檢驗方法47鼠疫病原學檢驗方法染色鏡檢培養(yǎng)特性噬菌體裂解動物實驗基因檢測鼠疫病原學檢驗方法染色鏡檢48鼠疫病原學檢驗方法鼠疫病原體發(fā)現(xiàn)：1894年，在香港，日本學者北里柴三郎和法國學者亞力山大耶爾森二氏。分類位置：腸桿菌科耶爾森菌屬。生物學特性分子生物學特性：6MD、45MD、65MD三種質(zhì)粒；目前已知IS100、IS285、IS1541、IS1661四種插入序列，分布于鼠疫菌質(zhì)粒的染色體基因組中。毒力決定因子:F1抗原，VWa抗原，Pstl，Pgm分型:古典、中世紀、東方、田鼠變種四個生物變種；5個群（A、B、C、D、E群），21個生態(tài)型。鼠疫病原學檢驗方法鼠疫病原體49

染色鏡檢革蘭氏染色美蘭染色典型的鼠疫菌是短而粗、兩端鈍圓、兩極濃染的橢圓形小桿菌，革蘭氏染色陰性。染色鏡檢革蘭氏染色典型的鼠疫菌50細菌培養(yǎng)細菌培養(yǎng)51

病原學在普通培養(yǎng)基上28－30℃經(jīng)24h，肉眼可見形成薄薄一層淡灰色小菌落,圓形，有光澤，中心稍突起。透過光線呈灰白色或淡青色，菌落較干燥，鏡下：中央隆起中心發(fā)暗，有粗糙顆粒（黃褐色）周圍有薄而透明的花邊，呈鋸齒狀。培養(yǎng)特性病原學在普通培養(yǎng)基上28－30℃經(jīng)52Y.PEVY.E耶爾森菌屬三個致病菌形態(tài)比較Y.PEVY.E耶爾森菌屬三個致病菌形態(tài)比較53噬菌體裂解實驗28－30℃24h噬菌帶明顯噬菌體裂解實驗28－30℃24h噬菌帶明顯54觀察1-9天，可以從感染動物體內(nèi)檢出鼠疫菌為陽性。動物實驗觀察1-9天，可以從感染動物體內(nèi)檢出鼠疫菌為陽性。動物實驗55鼠疫菌的基因檢測病原學的檢測鼠疫菌的基因檢測病56DNA提取水煮法提取可疑鼠疫菌DNA對于臟器標本，在強毒實驗室以無菌手續(xù)取動物的各種臟器(心、肝、脾、肺)約1g，加入到等量生理鹽水中，研碎，100℃水浴中煮沸10min，離心，取上清直接用作PCR模板對于培養(yǎng)可疑鼠疫菌，在平板上刮取可疑鼠疫菌于裝有500ul蒸餾水（生理鹽水）的1.5ml離心管中，于沸水浴中煮10min，離心上清液中含有可疑鼠疫菌DNA作為PCR模板。細菌基因組DNA提取試劑盒提取鼠疫菌基因組DNA操作方法可根據(jù)試劑盒說明書進行操作。鼠疫菌的基因檢測DNA提取鼠疫菌的基因檢測57體系配制PCR-bufferdNTP引物（2對各1ul）TaqDNA聚合酶模板純水總體積25ul2.5ul2ul4ul1ul（2.5U)1ul14.5ul鼠疫菌的基因檢測體系配制PCR-bufferdNTP引物（2對各1ul）T58PCR擴增93℃5min90℃1min60